Les applications de la PCR-DGGE

I.10.2.1. Étude de la biodiversité de la communauté microbienne dans l’environnement

Depuis son introduction par Muyzer et al. (1993) en communauté microbienne, la PCR-DGGE a été employée avec succès pour étudier les communautés microbiennes dans l’environnement. Cette technique est habituellement employée pour évaluer la diversité de la communauté et pour

Identification des espèces microbiennes

Extraction d’ADN

ADN totaux comprenant un mélange des ADN microbiens des

espèces différentes

Amplification par PCR d’une région variable de

l’ADN ribosomique Mélange des amplicons

d’ADN des espèces différentes (même taille mais séquences différentes)

Analyse par DGGE

* Purification et séquençage des bandes * Analyse comparative des séquences

déterminer sa dynamique en réponse aux variations environnementales. Peu d'études ont utilisé cette technique pour caractériser la diversité des eucaryotes. Les plus récentes applications portent sur l’étude de la structure et de l’évolution des communautés des champignons de l’environnement (López-Archilla et al., 2001 ; Aguilera et al., 2006) ; du sol (Van Elsas et al., 2000 ; Li et al., 2008) ; de l’aérosol (Nieguitsila et al., 2007) ; des fruits frais (El Sheikha et al., 2009a; El Sheikha et Montet, 2010 ; El Sheikha et Montet, 2010; El Sheikha, 2010 ; El Sheikha et al., 2010 ; El Sheikha et al., 2010a,b,c) ; de rhizosphère du blé ( Smit et al., 1999 ; Gomes et al., 2003) ; du compost (Marshall et al., 2003) ; des boues (Marsh et al., 1998) ; des picoeucaryotes marins (Díez et al., 2001a,b) ; des rivières (Van Hannen

et al., 1999 ; Amaral Zettler et al., 2002) ; du bois (Vainio et Hantula, 2000).

I.10.2.2. Suivi et identification de la communauté microbienne au cours des fermentations

Au cours de ces dernières années, la méthode DGGE a également été utilisée pour étudier les populations de champignons dans le lait, le pain au levain (Meroth et

al., 2003. Gatto et Torriani, 2004) (Cocolin et al., 2002a.), dans le café (Masoud et

al., 2004) et les fermentations du vin (Cocolin et al., 2000, 2001, 2002b ; Hernán-Gómez et al., 2000 ; Mills et al., 2002 ; Cocolin et Mills, 2003; Prakitchaiwattana et

al., 2004). Le grand potentiel montré par la PCR-DGGE pour analyser les échantillons environnementaux a stimulé les microbiologistes pour étudier la possibilité de son application dans le suivi des fermentations microbiennes. Parmi les premiers qui s’y sont intéressés, Cocolin et al. (2000) et Fernandez-Gonzalez et al. (2001) ont étudié la diversité des levures et des moisissures présentes au cours de la fermentation du vin. Ils montrent que la PCR-DGGE est une alternative viable aux méthodes classiques en boite de pétri pour une évaluation qualitative des constituants microbiens dans les fermentations de vins modèles. La PCR-DGGE est très sensible et permet de détecter des différences subtiles dans le développement des flores de champignons et leur persistance dans deux fermentations réalisées dans des conditions légèrement différentes. Dans chaque cas, les auteurs ont obtenu une excellente corrélation entre les données obtenues en boite de pétri et la présence ou l'absence d'une bande en DGGE.

traditionnelles de microbiologie pour suivre la dynamique des communautés microbiennes au cours de la fermentation et offre de plus la possibilité d'identifier les espèces de microorganismes par séquençage. En outre, la PCR-DGGE a la capacité d’être applicable à un grand nombre d'échantillons en utilisant un volume minimal d'échantillons (Nielsen et al., 2005 ; Nielsen et al., 2007 ; Stringini et al., 2008 ; Laforgue et al., 2009).

De plus, cette approche globale pourrait servir pour le contrôle des appellations d’origine. Coppola et al. (2001) ont comparé différents modes de fabrication de fromage : une méthode dite artisanale et une méthode plus industrielle. Ils ont montré que la microflore du fromage dépend en partie du mode de production. De ce fait, la technique de PCR-DGGE pourrait être assimilée à un outil de diagnostic pour les produits qui doivent porter la mention « produit artisanal ».

I.10.2.3. Contrôle de qualité des produits alimentaires

La PCR-DGGE peut être appliquée, en tenant compte de ses limites de sensibilité, à la détermination des flores des champignons dans un produit fini, et ainsi permettre de contrôler sa qualité microbiologique. Ainsi, Cocolin et al. (2004) ont utilisé la PCR-DGGE, la RT-PCR-DGGE et l’hybridation pour la surveillance de la détérioration des vins par des champignons et ont proposé de détecter la présence de Brettanomyces bruxellensis comme test de confirmation de détérioration des vins. Nielsen et al. (2005) l’ont utilisée pour caractériser les populations levuriennes présentes dans le cacao fermenté Ghanéen sur trois sites différents à des périodes différentes au cours de la saison de production. Ils ont montré que la PCR-DGGE semble être une méthode efficace et relativement bon marché pour examiner la composition microbienne de la fermentation du cacao, offrant ainsi la possibilité d'examiner un certain nombre d'échantillons dans un temps relativement court. En outre, une meilleure compréhension de la dynamique microbienne au cours de la fermentation du cacao est une étape importante vers l'élaboration de mesures de gestion de qualité pour la production de cacao de haute qualité.

Dans la même optique, Laforgue et al. (2009) ont ainsi montré que la PCR-DGGE a permis de suivre la dynamique des communautés fongiques présentes sur les raisins pour une détection précoce des espèces potentiellement impliquées dans

et espèces de moisissures isolées à partir de raisins (Sage et al., 2004 ; Serra et al., 2005), incluant les espèces responsables des défauts du vin. Ils ont conclu que la PCR-DGGE représente un outil utile pour établir le profil des communautés fongiques, mais ne convient pas directement pour décrire avec précision les espèces présentes. Des études complémentaires devront ainsi être réalisées sur les cultures complexes pour une meilleure connaissance des communautés fongiques sur les raisins, en particulier des espèces responsables des défauts du vin. Lorsque ces espèces seront connues, il sera également intéressant de concevoir des méthodes plus spécifiques pour les détecter.