Apoptose spontanée, une déprivation en facteur de croissance impliquant la voie

1.4.2.1 Formation de l’apoptosome

Les caspases sont des protéases à cystéine qui sont initialement présentes sous forme de zymogène devant donc être clivées afin d’être actives. En effet, elles sont présentes dans le cytoplasme sous forme inactive: les procaspases. Celles-ci vont ensuite être clivées et se dimériser pour former les caspases actives. Il existe une distinction entre les caspases initiatrices (la caspase-9 notamment) qui activent les caspases effectrices (comme la caspase-3). La caspase-2 est la seule caspase qui n’est pas exprimée par les PN (Binet et al., 2010). L’apoptose spontanée des PN est dépendante des caspases. En effet les inhibiteurs des caspases inhibent cette apoptose (Wardle et al., 2011).

La voie mitochondriale nécessite l’activation de la caspase-9, une caspase initiatrice et implique les protéines de la famille Bcl-2. Cette voie est contrôlée par une variété de senseurs comme les dommages à l’ADN, la déprivation en facteur de croissance ou encore le stress du réticulum endoplasmique (RE). Ainsi, le stress du RE induit par le trioxyde d’arsenic induit l’apoptose du PN, impliquant une activation des caspases-3,-4,-8 et -9 (Binet et al., 2010). Ces perturbations mènent à la perméabilisation de la membrane externe de la mitochondrie et à la libération du cytochrome c (Binet et al., 2010).

L’apoptose intrinsèque s’explique par l’apparition progressive au cours du temps d’un déséquilibre spontané entre les facteurs pro- et anti-apoptotiques et ce en faveur des facteurs pro- apoptotiques. Les molécules régulatrices sont les protéines de la famille Bcl-2. La perte d’équilibre en

faveur des protéines pro-apoptotiques favorise la libération du cytochrome c et l’activation de la caspase-9 via la formation de l’apoptosome (figure 19).

La phase effectrice de l’apoptose comporte l’ouverture des pores de transition de perméabilité des mitochondries. Suite à l’ouverture de ces pores, il y a libération de molécules pro- apoptotiques telles que le cytochrome c ainsi que l’Apoptosis Inducing Factor (AIF), les protéines SMAC (second mitochondria-derived activator of caspase) chez la souris / Diablo chez l’homme (Direct IAP-binding protein with low pI), inhibiteurs des IAP (inhibitors of apoptosis proteins).

La pro-caspase-9 interagit avec APAF-1 (Apoptosis protease-activating factor-1), une protéine cytoplasmique. APAF-1 est particulièrement exprimée chez le PN ce qui compense la faible quantité de cytochrome c et explique l’importante activation de la caspase-9 observée dans l’apoptose spontanée du PN (Murphy et al., 2003). L’apoptosome, résultant de l’interaction de la caspase-9 et d’APAF-1, va à son tour activer les caspases effectrices -3, -6 et -7, déclenchant le programme de mort cellulaire (Borner and Monney, 1999; Kitanaka and Kuchino, 1999).

Les caspases effectrices vont cliver l’actine qui maintient l’intégrité de la membrane plasmique, ce qui va mener au rétrécissement de la cellule et à la formation de corps apoptotiques. Elles entraînent également la fragmentation de l’ADN et empêchent classiquement sa réparation en clivant la poly(ADP) ribose polymérase (PARP) (Cohen et al., 1992). Cependant PARP serait absente des PN matures, son expression diminuant au cours de la différenciation (Bhatia et al., 1995). De plus les caspases amplifient le signal apoptotique en inactivant des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 ou des inhibiteurs de l’apoptose comme les IAP, qui inhibent les caspases-9 et -3 (Salvesen, 2002).

Figure 19 : Les voies extrinsèque et intrinsèque de l’apoptose. En rouge sont figurés les inhibiteurs de

l’apoptose : cFLIP (cellular caspase-8-FLICE-like inhibitory protein) empêche l’activation de la caspase-8, IAPs (Inhibitors of apoptosis) celle de la caspase-9. Les deux voies sont liées via BID qui une fois tronqué (tBID) induit un changement de la conformation de BAX, entrainant la perméabilisation de la membrane mitochondriale. En effet, l’activation des protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax et Bak) aboutit à la formation de pores au sein de la membrane mitochondriale et à la libération du cytochrome c. Cela permet l’activation de la caspase- 9 par la formation de l’apoptosome constitué de la procaspase-9, APAF1 et du cytochrome c principalement. (Gabelloni et al., 2013b). RE= Réticulum endoplasmique.

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1.4.2.2 Les gardiens de la mitochondrie

De nombreuses molécules modulent l’activation des caspases et sont en quelque sorte les gardiens de l’intégrité de la mitochondrie. La famille Bcl-2 est importante, mais les PN expriment également de nombreux autres acteurs, qui font de l’apoptose du PN un mécanisme finement régulé. Les principaux acteurs sont présentés dans la figure 20 et seront détaillés par la suite.

Figure 20 : Les gardiens de l’intégrité mitochondriale. Le déclenchement de l’apoptose est contrôlé par un équilibre entre

des molécules pro et anti apoptotiques plus ou moins spécifiques du PN. Au cours de la vie du PN leur quantité peut décroître, comme la survivine, ils peuvent devenir actif en étant libérés, comme SMAC/Diablo ou encore être désinhibés, comme les calpaïnes. Les acteurs de la même couleur sont impliqués dans des contrôles mutuels (par exemple la calpastine inhibe les calpaïnes ou encore SMAC/diablo inhibe les IAPs).

Au niveau intracellulaire, un équilibre des protéines de la famille Bcl-2

Pour revue, (Shamas-Din et al., 2011).

Les neutrophiles en circulation expriment moins de protéines anti-apoptotiques que les PN présents dans la moelle osseuse (Altznauer et al., 2004a). En général, les protéines anti-apoptotiques sont localisées dans la membrane externe de la mitochondrie alors que les pro-apoptotiques sont retrouvées au niveau du cytoplasme. Si les PN n’expriment pas la molécule anti-apoptotique Bcl-2, ils expriment de façon constitutive les protéines pro-apoptotiques Bax et Bak, et les protéines à domaine BH3, tels Bid, Bim, NOXA, Bik et Bad. Ces protéines ont une demi-vie relativement longue et leur expression constitutive pourrait expliquer en partie la durée de vie courte des PN sanguins. Elles sont localisées dans le cytoplasme sous une forme inactive. Lors d’un stimulus apoptotique, elles se relocalisent à la mitochondrie où elles exercent leurs effets (Gross et al., 1998; Wolter et al., 1997). Bax et Bak s’hétérodimérisent et forment des pores de transition dans la membrane externe de la mitochondrie (Llambi et al., 2011). Les PN expriment aussi de manière inductible les molécules anti- apoptotiques A1, Mcl-1 et Bcl-XL, de demi-vie très courte (Akgul et al., 2000; Edwards et al., 2003).

L’apoptose des PN serait ainsi gouvernée par les taux cellulaires de ces protéines anti-apoptotiques. L’utilisation de modèles KO a permis de mieux comprendre l’importance de toutes ces protéines. Ces résultats sont synthétisés dans le tableau III.

Tableau III : Importance des protéines impliquées dans le contrôle de la mort des PN, utilisation des modèles KO (adapté de (Cabrini et al., 2010; Geering and Simon, 2011).

Protéines délétées Effet sur les PN Références

Bax dans les PN Délai dans l’apoptose spontanée (Villunger et al., 2003)

Bak Viabilité normale des PN (Lindsten et al., 2000)

Bax et Bak Augmentation du nombre de PN circulant (Lindsten et al., 2000)

Bim Augmentation des PN dans le sang et la rate (Lindsten et al., 2000)

Bim dans les granulocytes Augmentation de la viabilité

Réponse retardée à la déprivation en cytokine

(Villunger et al., 2003)

Noxa et Bim Augmentation encore plus importante de la viabilité (Kirschnek et al., 2011)

Bcl-2 Viabilité normale des PN (Villunger et al., 2003)

Bcl-w Viabilité normale des PN (Villunger et al., 2003)

Bid Diminution de l’apoptose induite par FasL (Geering et al., 2011)

A1-a Augmentation de l’apoptose spontanée des PN (Hamasaki et al., 1998)

Mcl-1 dans les PN Augmentation de l’apoptose spontanée des PN (Moulding et al., 1998)

Mcl-1 Diminution du nombre de PN dans le sang et la rate de 80%

(Dzhagalov et al., 2007)

Mcl-1 semble une protéine clef du PN. Elle forme des héterodimères avec Bid, NOXA, Bim et Bak dans la membrane de la mitochondrie (Thomas et al., 2010). Les agents qui accélèrent le mort du PN diminuent le taux de Mcl-1 (comme les inhibiteurs de CDK (Cyclin dependent kinases) tels la Roscovitine), alors que les agents la retardant induisent l’expression de Mcl-1 (comme les glucocorticoïdes). Mcl-1 est située au niveau du noyau et du cytoplasme du PN (Kato et al., 2006; Leuenroth et al., 2000). La quantité de Mcl-1 diminue avant l’activation des caspases, ce qui indique le rôle clef de cette protéine (Wardle et al., 2011). Il a été décrit que Mcl-1 était clivé par les caspases et que cela pouvait amplifier l’apoptose (Herrant et al., 2004). Lors de la sénescence du PN, la concentration intracellulaire de Mcl-1 décroît rapidement par dégradation dans le protéasome, suggérant que la survie du PN est régulée par l’expression de Mcl-1 (Moulding et al., 2001). Mcl-1 possède un domaine PEST (riche en proline (P), acide glutamique (E), sérine (S) et thréonine (T)) ce qui cible sa dégradation par le protéasome (Edwards et al., 2004). La stabilité de Mcl-1 est contrôlée notamment par des jeux de phosphorylation dirigés par JNK (cJun Nterminal kinase), GSK3 (Glycogen synthase kinase 3), p38 et ERK (Thomas et al., 2010). Les CDK sont également impliquées dans l’induction de l’expression de Mcl-1. Les PN expriment les CDK 5, 7, 9. Il a été montré une diminution de l’activité de la CDK9 au cours de l’apoptose, associée à la diminution de l’expression de Mcl-1 (Wang et al., 2012a).

Ainsi dans des conditions non inflammatoires, les PN expriment des taux élevés des protéines pro-apoptotiques alors que les protéines anti-apoptotiques A1 et Mcl-1 sont exprimées de façon marginale. En outre, celles-ci sont neutralisées par les protéines pro-apoptotiques Bad et Bim. Enfin la protéine pro-apoptotique Bid peut être clivée (clivage permettant à l’activation et à la translocation mitochondriale de Bax), participant au relargage de facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie vers le cytoplasme, tels que le cytochrome c, et conduisant à l’apoptose. Ainsi le processus d’apoptose du PN ne nécessite pas de synthèse, d’où l’appellation apoptose spontanée (Gabelloni et al., 2013b).

Au cours des processus inflammatoires, le mécanisme d’inhibition de l’apoptose requiert à l’inverse une synthèse de nouvelles protéines anti-apoptotiques. En effet, en l’absence de synthèse

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de novo, la quantité de ces protéines diminue rapidement en raison de leur demi-vie courte et de

leur turn-over rapide. Ainsi, une augmentation du taux intracellulaire des protéines anti- apoptotiques A1 et Mcl-1 est impliquée dans la survie des PN induite par des cytokines pro- inflammatoires comme le GM-CSF, l’IL-1β, le TNF-α et l’IL-15 (Moulding et al., 2001) et les agonistes des TLR-2,-4,-7,-8,-9 (Francois et al., 2005). De plus la phosphorylation de Bad par Akt/PKB, participe également à la survie des PN. En effet, elle conduit à sa séquestration dans le cytosol par la protéine 14-3-3, Bad étant alors incapable d’interagir avec les molécules anti-apoptotiques telles que Bcl-XL, Mcl-1 et A1. Ces dernières peuvent donc se lier à Bax, bloquant son activité pro-apoptotique, ce qui conduit à la survie cellulaire (Edwards et al., 2003; Perianayagam et al., 2004; Simon, 2003).

Les particularités du PN

Les IAP (inhibitor of apoptosis), les XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) et le PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) limitent l’activation des caspases dans les PN (figure 20).

Les IAP inhibent directement les caspases ou activent NF-кB, un facteur de transcription impliqué dans les réponses immunes et inflammatoires et qui joue un rôle très important dans l’expression de gènes apoptotiques (Salvesen and Duckett, 2002). Parmi les IAP, la survivine est fortement exprimée dans les PN immatures et dans les PN matures traités par des facteurs de survie ou en conditions inflammatoires (en présence de GM-CSF), la PI3K (phosphoinositide 3 kinase) régulant son expression (Altznauer et al., 2004b). La survivine s’associe aux XIAP pour être fonctionnelle (Altieri, 2010).

La protéine PCNA est connue pour améliorer la processivité des ADN polymérases lors de la réplication de l'ADN et est donc généralement nucléaire. Dans les PN, PCNA est exprimé majoritairement dans le cytoplasme. Initialement nucléaire dans les précurseurs des PN, PCNA se relocalise au niveau du cytoplasme au cours de la différenciation. Une diminution de l’expression de PCNA est associée à l’entrée en apoptose des PN, alors qu’un traitement par du G-CSF induit PCNA et ainsi la retarde. PCNA interagit avec les procaspases et limite leur activation. p21, inhibiteur endogène des CDK, empêcherait cette interaction (Witko-Sarsat et al., 2010).

Dans le cas de dommage à l’ADN, MNDA (Myeloid nuclear differnciation antigen) serait clivé et relocalisé dans le cytoplasme des PN. En interagissant physiquement avec Mcl-1, MNDA induit la dégradation de Mcl-1 et ainsi l’activation des caspases et la mort du PN (Fotouhi-Ardakani et al., 2010; Milot et al., 2012).

Plusieurs observations ont permis de conclure que les calpaïnes, des cystéines protéases n’appartenant pas à la famille des caspases, jouaient un rôle dans la régulation de l’apoptose des PN. En effet, des études ont montré que l’inhibition des calpaïnes par des inhibiteurs spécifiques bloquait l’apoptose des PN et que l’inhibition de la calpastatine, un inhibiteur endogène des calpaïnes, accélérait l’apoptose (Squier et al., 1999). L’expression de la calpastatine diminue au cours de l’apoptose permettant l’activation des calpaïnes. La calpaïne-1 a été identifiée comme l’isoforme critique ayant pour cible Bax, une protéine pro-apoptotique de la famille Bcl-2 (Altznauer et al., 2004a). Bax transloque vers la mitochondrie grâce au clivage par la calpaïne-1, clivage empêchant l’interaction avec les autres protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Knepper-Nicolai et al., 1998). Ces événements sont essentiels pour la libération du cytochrome c et pour l’activation subséquente de la caspase-3 dans le PN. De plus, les calpaïnes clivent et désactivent les XIAP qui empêchent l’activation des caspases effectrices (Kobayashi et al., 2002a). Ainsi, les calpaïnes en

activant Bax et désactivant les XAIP participent à l’apoptose du PN. Récemment, l’activation des calpaïnes a également été décrite dans des PN nécrotiques. Une augmentation du flux calcique, ayant lieu indépendamment de l’externalisation des phosphatidylsérines permet la transition de l’apoptose vers la nécrose (Francis et al., 2013). Cependant l’élévation du calcium intracellulaire n’est pas suffisante pour induire la nécrose du PN (Francis et al., 2013).

De plus les protéases granulaires peuvent participer à l’activation des caspases. Par exemple, les cathepsines (principalement la D) peuvent activer la caspase-8, et induire le clivage de Bid, conduisant à l’activation de la caspase-3 (Blomgran et al., 2007; Conus et al., 2008).