Analyses des résultats du crible

Deux analyses indépendantes ont été réalisées pour étudier les résultats du crible pour permettre l’identification d’un maximum de candidats.

a. Analyse 1 : segmentation des cellules et quantification du marquage d’enveloppe

Cette première analyse consiste en la segmentation de chaque cellule présente sur chaque image acquise. La segmentation est réalisée à partir du logiciel IN Cell Analyzer 3.7 Workstation (GE Healthcare) et va permettre d’obtenir le contour de chaque cellule et de les individualiser. Une fois cette étape opérée, l’intensité du marquage fluorescent de la protéine d’enveloppe de ZIKV est

Matériels et Méthodes ǀ 60 quantifiée par cellule. Ainsi, pour une condition donnée, un pourcentage de cellules infectées est obtenu. Ce pourcentage est moyenné pour les trois images obtenues pour une même condition. Cette méthode de quantification de l’intensité du marquage de l’enveloppe virale nous permet également d’identifier des conditions pour lesquelles le pourcentage d’infection est similaire à celui du contrôle mais où l’intensité du signal (et donc la production de protéines virales) de chaque cellule est plus développé ou plus intense que dans les conditions contrôles, nous apportant ainsi une information complémentaire.

Cette analyse prend en compte l’emplacement de chaque condition dans la plaque de culture. En effet, lors d’un crible, il est possible d’observer un effet local en fonction des positions des puits dans les plaques de culture. Pour s’affranchir de cet effet, une opération est réalisée consistant en la soustraction à chaque condition de la médiane de la ligne de puit, de celle de la colonne et de la médiane de cette position dans chaque plaque de culture d’un même réplicat. Cette opération est répétée et après dix itérations, une valeur est obtenue permettant la quantification de l’effet de position (Malo et al., 2006).

Enfin, pour déterminer si la variation d’infection observée pour une condition donnée est significativement différente de la variation observée pour l’ensemble des conditions, le Z-Score robuste (rZ-Score) est calculé. Ce calcul est basé sur l’hypothèse que la majorité des conditions n’aura pas d’effet sur l’infection virale et ainsi chaque condition est considérée dans la population de références. De cette population de référence sont cependant exclus les contrôles phénotypiques que sont les conditions ayant reçu les ARNi ciblant IFNAR1 et IFNAR2, car nous savons que ces conditions ont un impact important sur le taux d’infection. Le rZ-Score est calculé de la manière suivante :

rZ-Score = ( é ) 1.4826 (| é − ( é )|)

b. Analyse 2 : dénombrement des noyaux et des foyers d’infection

La seconde analyse a été réalisée à l’aide du logiciel CellProfiler. Cette analyse est basée sur le dénombrement des noyaux présent sur chaque image, ce qui permet de déduire le nombre de cellules. Dans un second temps, les sites intracellulaires de réplication sont également dénombrés, ainsi, nous pouvons obtenir un pourcentage d’infection, regroupant la moyenne des trois images, pour une

Avec - x, pourcentage d’infection dans la condition - med, la médian

- pop réf, la population de référence, ici, pourcentage d’infection de toutes conditions excepté les contrôles

Matériels et Méthodes ǀ 61 condition donnée. Cette stratégie permet de déterminer si une cellule est infectée ou non mais ne donne pas d’information concernant la taille ou l’intensité du marquage du site de réplication. De la même manière que précédemment, le rZ-Score est déterminé.

Cette analyse n’apporte pas d’informations supplémentaires en comparaison à l’analyse précédente. Cependant, elle permet une approche légèrement différente quant à la quantification des cellules infectées. Cela permet la validation de certains autres candidats et l’élimination de faux négatifs dans la première analyse.

c. Sélection des candidats

La sélection des candidats est basée sur les deux analyses indépendantes. Sont choisi comme candidats les gènes pour lesquels 2 ARNi sur 3 dans l’une des 2 analyses permettent l’obtention d’un rZScore inférieur ou égale à -2 ou supérieur ou égale à 2.

Comme expliqué précédemment, l’analyse 1 nous apporte une information concernant l’intensité du marquage de l’enveloppe virale. Ainsi pour cette analyse sont pris en compte également les candidats permettant l’obtention de marquages plus ou moins intenses par rapport à la médiane globale (toujours avec pour valeur seuil du rZScore -2 et 2).

Pour la seconde analyse, beaucoup de candidats possédaient un rZScore inférieur ou égale à -2. Pour diminuer la présence de faux positifs sur cette analyse nous avons choisi d’ajouter une condition pour la sélection. Les candidats possédant un rZScore inferieur ou égale à -2 doivent également avoir un pourcentage d’infection diminué d’au moins 50 % comparé à la médiane.

Résultats

Partie I

Résultats – Partie I ǀ 63 L’objectif de ce travail était de développer une stratégie pour identifier des gènes cellulaires impliqués dans la réponse immunitaire et étant capables de moduler la réplication du virus Zika.

Différentes approches basées sur la perte de fonction ou la surexpression ont permis de découvrir des ISGs impliqués dans le contrôle de l’infection par ZIKV comme IFI6, IFITM3 ou la Vipérine (Richardson et al., 2018 ; Savidis et al., 2016a ; Van der Hoek et al., 2017). Des ISGs favorisant l’infection comme LY6E et MCOLN2 ont également été mis en évidence (Hackett and Cherry, 2018 ; Rinkenberger and Schoggins, 2018). Afin d’identifier de nouveaux gènes de la réponse immunitaire qui jouent un rôle lors de l’infection par ZIKV, nous avons conçu et réalisé un crible à haut débit basé sur une approche de ‘perte de fonction’.