Analyses du crible et résultats

Deux analyses indépendantes ont été réalisées sur les images d’immunofluorescence pour permettre d’identifier un maximum de candidats et pour éviter les faux-positifs et faux-négatifs. Toutefois, ces deux analyses sont basées sur la même méthode. Le calcul du Z-score robuste (rZ-Score) permet d’estimer pour chaque condition si la variation observée est significative par rapport à la variation de l’ensemble des conditions. Ainsi, on suppose que la majorité des ARNi n’a aucun effet sur l’infection et cette absence de variation sert de référence (Figure 20). Cependant, quelques paramètres varient d’une analyse à l’autre. Dans les paragraphes ci-dessous sont représentés les détails de chacune des analyses ainsi que les résultats propres à celles-ci.

Plaque 1 Plaque 2 Plaque 3 Plaque 4 Réplicat 1 4,83 3,91 4,03 4,69

Réplicat 2 5,61 4,88 5,43 5,13

Avec - $ la moyenne du nombre de cellules dans la condition donnée - n le nombre de répétitions - σ l’écart type

Tableau 7. Contrôle qualité de la transfection. Ce tableau regroupe les résultats de facteur β obtenus pour chaque plaque de culture de chaque réplicat du crible. La transfection est considérée comme un succès lorsque facteur β ≥ 3,00.

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a. Analyse 1 : segmentation des cellules et quantification du marquage d’enveloppe

La première analyse a été réalisée à l’aide du logiciel IN Cell Analyzer 3.7 Workstation (GE Healthcare).

Cette analyse a permis d’individualiser chaque cellule et donc de comptabiliser leur nombre pour chaque condition. De plus, l’intensité de l’immuno-marquage de la protéine d’enveloppe de ZIKV est quantifié. Ainsi à l’issu de cette analyse, un pourcentage d’infection pour chaque condition a été obtenu. Par ailleurs, pour s’affranchir de tous biais venant de la position de la condition dans la plaque de culture, un lissage a été opéré sur les valeurs. Cette opération permet la soustraction itérative des médianes de la ligne ou de la colonne, calculées à partir de toutes les plaques d’un réplicat (Malo et al., 2006). Il est important de noter que c’est cette analyse qui a nous a permis de réaliser les différents contrôles qualité décrits plus haut. Pour finir, le rZ-Score a été calculé de la manière suivante :

rZ-Score = ( é )

1.4826 (| é − ( é )|) Avec - x, pourcentage d’infection dans la condition - med, la médian

- pop réf, la population de référence, ici, pourcentage d’infection de toutes conditions excepté les contrôles

Résultats – Partie I ǀ 72 La figure 21 représente le rZ-Score obtenu pour toutes les conditions et pour chaque réplicat du crible suite à cette analyse.

b. Analyse 2 : dénombrement des noyaux et des foyers d’infection

La seconde analyse a été réalisée à l’aide du logiciel CellProfiler. Cela a permis d’identifier le nombre de cellules sur chaque image grâce à l’isolation des noyaux. De la même façon que lors de la première analyse, le nombre de cellules infectées a été dénombré. Suite à cette analyse nous avons donc établi un pourcentage d’infection pour chaque condition. Là encore, le rZ-Score a été déterminé comme précédemment expliqué. La figure 22 représente le rZ-Score obtenu pour toutes les conditions et pour chaque réplicat du crible suite à cette analyse.

Figure 21. Résultats du crible suite à l’analyse 1. Cette figure représente les rZ-Score obtenus suite à l’analyse 1, pour toutes les conditions du réplicat 2 en fonction des résultats du réplicat 1. En orange apparaissent les conditions contrôles où les cellules ont reçu un ARNi ciblant IFNAR1 ou IFNAR2. En gris foncé apparaissent les conditions contrôles où les cellules ont reçu un ARNi NT. La droite verte représente la régression linéaire.

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c. Liste de candidats retenus

Pour sélectionner les candidats ayant un impact significatif sur l’infection par ZIKV nous nous sommes basé sur les deux analyses décrites ci-dessus. En effet, nous avons commencé par comparer les résultats obtenus suite aux deux analyses pour nous assurer qu’ils n’étaient pas en désaccord. Nous pouvons voir sur la figure 23 que les analyses sont cohérentes l’une avec l’autre.

Figure 23. Comparaison des analyses 1 et 2 du crible. Cette figure représente les taux d’infection moyens de chaque condition du crible obtenus à la suite de l’analyse 2 en fonction de ceux obtenus suite à l’analyse 1. La droite verte représente la régression linéaire.

Figure 22. Résultats du crible suite à l’analyse 2. Cette figure représente les rZ-Score obtenus suite à l’analyse 2, pour toutes les conditions du réplicat 2 en fonction des résultats du réplicat 1. En orange apparaissent les conditions contrôles où les cellules ont reçu un ARNi ciblant IFNAR1 ou IFNAR2. La droite verte représente la régression linéaire.

Résultats – Partie I ǀ 74 Le seuil de rZ-Score communément utilisé dans ce genre d’étude à haut débit est de 2. Ainsi, pour une condition donnée, si le rZ-Score obtenu est supérieur ou égal à 2 ou inférieur ou égal à -2, la condition est décrite comme variant significativement par rapport à la médiane des autres conditions de l’expérience et est considérée comme positive. Nous avons choisi pour ce crible de garder cette valeur de seuil. Par ailleurs, nous rappelons que chaque gène est ciblé par trois ARNi individuels dans chacun des deux réplicats. Ainsi nous avons choisi de définir comme candidats positifs à l’issu du crible les gènes modulant l’infection et répondant au critère suivant : au moins 2 ARNi sur 3 positifs dans les deux réplicats d’une des analyses (cf. Matériel et Méthodes). Le tableau 8 présente la liste des différents candidats regroupés par effet pro-viral ou antiviral. Nous pouvons voir que dans cette liste de candidats apparaissent des gènes déjà décrits pour leurs fonctions modulatrices de l’infection par le virus Zika. En effet, IRF9 est un facteur de transcription directement impliqué dans l’induction des ISGs, il est normal de le retrouver parmi les candidats antiviraux (Fink and Grandvaux, 2013). IFITM3 est lui aussi connu comme modulant l’infection de plusieurs virus et notamment ZIKV (Savidis et al., 2016a). Du coté des candidats pro-viraux, on retrouve LY6E qui permet de faciliter l’entrée de ZIKV dans les cellules infectées (Hackett and Cherry, 2018) et USP18 qui, lui, est un régulateur négatif de la voie JAK-STAT (Malakhova et al., 2006). L’identification de ces gènes à la suite du crible nous a conforté dans le choix des différentes conditions et des analyses réalisées.

Effet

antiviral ^{MTA2 IRF9 IFITM3 GPD2 C1R PXK XCL1 IFI16 NMI} Effet

pro-viral ^{NAPA APOL3 CCND3 GBP3 IRF2 ISG20 NADK RUBCN LY6E ISG15 USP18 C22orf39} Tableau 8. Candidats retenus. Les candidats sont regroupés par effet antiviral ou pro-viral supposé du gène.

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