Analyses quantitatives de la biomasse

II. 3.3.1. Matière sèche sans cendre

Le dosage de la matière sèche sans cendre représente la quantité totale de matière organique contenue dans l’échantillon, ce qui inclut les micro-organismes vivants, qu’ils soient autotrophes ou hétérotrophes, les micro-organismes morts, les micro-invertébrés et les résidus détritiques (Biggs B.J.F. & Close M.E., 1989).

La quantité de matière organique contenue dans le biofilm est déterminée après filtration de l’échantillon sur filtre Whatman en fibre de verre de porosité 0,7 µm, préalablement rincé à l’eau distillée. Après séchage en étuve à 105°C, ce qui permet de déterminer la quantité de poids sec par unité de surface, le filtre est passé au four à 550°C pendant 1 heure. La perte de poids correspond à la fraction organique du biofilm (MV matières volatiles ou perte au feu).

Le teneur en matière sèche sans cendre en mg.cm^-2 est donnée par l’équation suivante :

avec

PE : poids du filtre après séchage de l’échantillon à l’étuve (mg) ; PF : poids du filtre après calcination au four (mg) ;

Vol filtré : volume d’échantillon filtré (mL) ;

Vol total : volume total d’échantillon récupéré (mL) ; S : surface de support grattée (cm²).

II. 3.3.2. Dosage de la chlorophylle a

Les communautés algales contiennent des associations diverses de pigments chlorophylliens selon les groupes taxonomiques. Cependant, c’est à travers le paramètre de la chlorophylle a, pigment majoritaire, qu’est appréhendée la composante algale du biofilm (Biggs B.J.F. & Kilroy C., 2000).

Nous avons suivi un protocole modifié de la norme AFNOR NFT 90-117 avec une extraction des pigments chlorophylliens par l’acétone et dosage des absorbances par spectrophotométrie. Cette méthode présente une sensibilité et une précision satisfaisantes pour le dosage de la chlorophylle a. Le principe du dosage est une filtration de l’échantillon sur membrane en fibre de verre GF/C, puis extraction de la chlorophylle par l’acétone à 90% et mesure de l’absorbance de l’extrait à 665 et 750 nm. Afin de tenir compte des

S

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produits de dégradation de la chlorophylle (phéopigments), qui interfèrent dans le dosage par absorption aux mêmes longueurs d’onde que la chlorophylle a, on procède à deux mesures successives de l’absorbance de l’extrait en intercalant une acidification de l’échantillon (40 µL d’HCl 2N, [finale]≈2.10^-2 mol.L^-1). L’acidification permet de convertir l’ensemble de la chlorophylle de l’échantillon en phéopigments et d’appliquer ensuite les facteurs de correction.

Les calculs des concentrations en chlorophylle a sont réalisés d’après les équations de Lorenzen (1967).

La concentration en chlorophylle a en µg.cm^-2 est donnée par l’équation :

La concentration en indice phéopigments en µg.cm^-2 est donnée par l’équation :

avec

A0 665, A0 750 : absorbances à 665 nm et 750 nm avant acidification ; Aa 665, Aa 750 : absorbances à 665 nm et 750 nm après acidification ; Vol acét. : volume de l’extrait acétonique (mL) ;

l : trajet optique de la cuve utilisée (cm) ;

S : surface de support gratté correspondante au volume filtré (cm²).

II. 3.3.3. Compartiment bactérien

Les bactéries présentes en milieu aquatique sont très variées, la composition de la flore bactérienne dépendant de nombreux facteurs tels que les charges organique et minérale, le pH, la température ou encore la turbidité (Champiat D. & Larpent J.P., 1988). Dans notre travail, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation du peuplement bactérien dans son ensemble (mesures de biomasse). P. Monfort et al. (1995) précisent que l'utilisation des milieux de culture pour l’estimation de l’abondance bactérienne sous-estime celle-ci, soit parce que le milieu de culture peut ne pas être adapté à la croissance de certaines bactéries exigeantes, soit parce que la grande majorité des cellules bactériennes n’est pas cultivable. Ces dernières peuvent alors soit être viables, mais non cultivables, soit en dormance. Les techniques de microscopie en épifluorescence appliquées à l'écologie bactérienne permettent alors de

( )

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Les numérations de bactéries viables et totales, sont réalisées après l’emploi du Kit LIVE/DEAD Baclight Viability L-13152, qui associe deux marqueurs fluorescents : le Syto 9, marqueur vert, et l’iodure de propidium (PI), marqueur rouge (Figure II-17).

L’association des deux fluorochromes permet d’évaluer l’intégrité membranaire des bactéries. Ils se fixent spécifiquement sur les molécules d’acides nucléiques. Le complexe ainsi formé, excité par la lumière UV, émet de la fluorescence. Le Syto9 colore indifféremment toutes les bactéries, quel que soit l’état de leur membrane. En revanche, le PI ne peut pénétrer que dans les bactéries dont la membrane est altérée.

Ainsi, on peut différencier les bactéries à membrane altérée (coloration rouge) de celles à membrane intacte (coloration verte).

Après incubation de l’échantillon avec la solution de fluorochrome, les échantillons sont filtrés sur filtres noirs Millipore (porosité : 0,2 µm). Le mode de répartition des bactéries sur membrane le plus fréquemment rencontré est la répartition contagieuse sous forme d’agrégats. Le recours au bain à ultrasons permet alors d’améliorer la qualité des dénombrements (Delsart C., 1995). Pour l’observation sous microscope, le filtre est monté entre lame et lamelle avec deux gouttes d’huile Baclight (Figure II-16).

Les dénombrements sont effectués à l’œil nu sous microscope à épifluorescence Olympus BX51TF.

Le nombre total de bactéries, en nombre de cellules.cm^-2, est donné par l’équation suivante :

avec

N : nombre moyen de bactéries par champ microscopique (sur 5 ou 10 champs observés) ; Surf membrane : surface utile de filtration de la membrane (∅ utile de filtration : 22 mm) ; Surf champ microscopique : surface d’un champ microscopique (∅ : 0,18 mm) ;

Vol total : volume total d’échantillon récupéré (mL) ; S : surface de support grattée (cm²) ;

Fd : facteur de dilution éventuellement appliqué lors du protocole ;

le facteur 10 est appliqué pour prendre en compte l’utilisation de 100 µL d’échantillon lors de la coloration et remonter ainsi à l’unité du mL.

S Fd

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Figure II-17 : Protocole de coloration des bactéries pour observation sous microscope à épifluorescence

II. 3.3.4. Communautés algales

Sur certaines expérimentations, conduites en laboratoire ou sur le terrain, et à certaines dates d’échantillonnage, nous avons procédé au comptage des différentes familles algales au sein du biofilm pour étudier la répartition algale selon trois groupes : Diatomées, Algues vertes, Cyanobactéries. Les

Echantillon de biofilm

Bain à ultrasons durant 15 min afin de limiter les amas cellulaires

Dilution décimale (selon la concentration de l’échantillon)

Prélèvement de 100 µL d’échantillon Ajout de 100 µL de Syto9-PI

+ 2 mL d’eau stérile

Incubation durant 15 min (bain à ultrasons et à l’obscurité)

Filtration sur membrane en polycarbonate noire (∅: 25 mm), séchage de la membrane et

montage à l’huile entre lame et lamelle.

Observation au grossissement X1000

Bain à ultrasons durant 15 min afin de limiter les amas cellulaires

Dilution décimale (selon la concentration de l’échantillon)

Prélèvement de 100 µL d’échantillon Ajout de 100 µL de Syto9-PI

+ 2 mL d’eau stérile

Incubation durant 15 min (bain à ultrasons et à l’obscurité)

Filtration sur membrane en polycarbonate noire (∅: 25 mm), séchage de la membrane et

montage à l’huile entre lame et lamelle.

Observation au grossissement X1000

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