MATERIEL ET METHODES
2.4 ANALYSES MOLECULAIRES
Extraction et quantification de l'ADN Protocole d'extraction de l'ADN:
- Peser 0.2 g de sédiment et le transférer dans un tube Eppendorf de 2 ml. Suivre la méthodologie suivante ou conserver le matériel à -80°C.
- Ajouter au sédiment 0.1 g de billes de verre avec un diamètre inférieur à 1 06 IJm, et 0.1 g de billes de verre avec un diamètre de 150-212 IJm.
- Compléter le volume à 1.5 ml avec le tampon d'extraction (voir 2.1 solutions).
- Utiliser l'appareil Mini-Beadbeater (Biospec product) à 3000 rpm, 3 fois 80 secondes. Entre les trois cycles, mettre les échantillons dans la glace afin de diminuer la température.
-Centrifuger à 13000 rpm, 4°C pendant 1 minute, transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf (2 ml).
Ajouter au surnageant isolé 1/4 vol. de phénol et 1/4 vol. de chloroforme -isoamylacool (24:1 ), et agiter vigoureusement (manuellement, ne pas utiliser le vortex).
- Centrifuger à 13000 rpm, 4°C pendant 10 minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf (2 ml).
- Ajouter au surnageant 1/2 vol. de chloroforme-isoamylalcool (24:1) et agiter vigoureusement (manuellement, ne pas utiliser le vortex).
- Centrifuger à 13000 rpm, 4
oc
pendant 1 0 minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf (2 ml).-Ajouter au surnageant 1/10 vol. d'acétate de sodium 3M (pH 5.2) et 2 vol. d'EtOH ( 1:1/1 0:2). À la place de 2 vol. d'EtOH on peut utiliser 1 vol. d'isopropanol.
-Laisser les échantillons obtenus à-
sooc
pendant 10 minutes.- Centrifuger à 13000 rpm, 4
oc
pendant 1 0 minutes et jeter le surnageant.- Laver trois fois le culot avec de I'EtOH à 70%, et entre chaque lavage, centrifuger à 13000 rpm, 4
oc
pendant 10 minutes et jeter le surnageant.- Déshydrater le culot dans le Speedvac.
-Dissoudre le culot avec 50-150 !JI de dH20.
-Pour la réaction de PCR, diluer 1/10, 1/100 et 1/1000.
Quantification de l'ADN:
La quantification de l'ADN a été effectuée en utilisant le kit "PicoGreenR dsDNA Quantification Reagent and Kit" (Molecular Probes), qui contient un marqueur fluorescent des acides nucléiques, détectable avec un fluoromètre (TD700 Turnes Designs, Witec AG, Littau, Suisse), après excitation à une longueur d'onde de 260 nm. En général on utilise une courbe standard de l'ADN du bactériophage lambda, qui en présence de 2 j.Jg/ml d'ADNds donne un résultat d'absorbance de 0.04 à une longueur d'onde de 260 nm.
Protocole:
Diluer 5 1-11 du produit de PCR purifié dans 495 1-11 de TE 1X (dilution 1 :100).
Ajouter 500 1-11 de la solution de PicoGreen (dilution 1:200 en TE 1x).
Mélanger avec le vortex et laisser à température ambiante pendant 2 minutes à l'obscurité. À ce point l'échantillon peut être introduit dans le fluoromètre (TD-700;
Turner Design, USA) pour la mesure de l'absorbance à 260 nm.
Gel d'agarose:
1 Ox TBE (solution stock):
Tris
Acide borique EDTA0.5 M dH20
108 g 55 g 40 ml
jusqu'à 1 000 ml
Ajuster le pH à 8 avec environ 5 ml de Na OH 1 OM.
Préparation du gel (Gel 0.8%, 1%, 2%):
Agarose 0.8/1 /2 g
1x TBE 100 ml
Une fois l'agarose dissout, ajouter 5 1-11 de bromure d'éthidium (1 0 mg/ml), mélanger et laisser polymériser.
2. MATERIEL ET METHODES
Bromure d'éthidium:
Bromure d'éthidium dH20
10 mg 1 ml
Charger les échantillons dans les puits:
Prélever 8 !JI de produit PCR et ajouter 2 !JI de "Loading buffer". Charger ces 10 1-11
dans un puits et faire migrer l'ADN dans le gel à 100 V pendant 1 heure.
"Loading Buffer":
Bleu de bromophénol Xylène Cyanol
Dissoudre dans de l'eau bidistillée.
0.25%
0.25%
PCR (Réaction de Polymérase en Chaine):
Pour chaque profondeur, l'ADN ribosomique 16S a été amplifié avec deux amorces universelles pour les bactéries (8f/1517r). Une PCR "nested" a ensuite été faite avec les amorces des Delta-proteobacteria (SRB385rc-GC/1387r). L'appareil (thermal cycler) utilisé est le GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Eimer). La présence des produits de PCR a été contrôlée avec un gel d'agarose (1%).
Mélange pour la PCR:
ADN (<1 IJg) 1 IJI
Taq PCR Master Mix (QIAGEN) 25 IJI
Primer F 1.5 !JI
Primer R 1.5 IJI
d H20
.2.1J!!
50 !JI
Amorces Sequences 5' ~ 3'
8F 5'-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3'
1517R 5'-ACGGCT ACCTTGTTACGACTT -3'
SRB385rc 5'-GGCCTGACGCAGCRACGCCG-3'
GC-clamp 5~CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC
CGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3'
1387r 5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3'
Cycles d'amplification (PCR «Touchdown» ):
5 min.
94°C 1min.
65°C - 1 oc 1 min. x 10 cycles
72°C 1 min.
94°C 1
min-55 oC 1 min.
x
20 cycles72oC 1 min.
5 min.
0()
Analyse des communautés microbiennes au moyen de la DGGE:
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Biorad)
Références (5) (5) (25) (23)
(17)
L'extraction des acides nucléiques a été effectuée à partir du sédiment conservé à -20°C ou directement après l'échantillonnage. Les cellules ont été lysées mécaniquement grâce au Mini-Beadbeater (Biospec product), et les acides nucléiques ont ensuite été séparés par une extraction au phénol- chloroforme suivie par des purifications à l'éthanol (19).
L'ADN ribosomique 168 des microorganismes appartenant aux Bacteria et aux Archaea a été obtenu par amplification en utilisant respectivement les amorces suivantes:
2. MATERIEL ET METHODES
Bf (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCA-3') /1517r (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') (5)
- A112f (5'-GCTCAGTAACACGTGG-3') 1 A934b (5'-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3') (7)
Des sets d'amorces plus spécifiques ont ensuite été utilisés:
- 338f (GCTGCCTCCCGTAGGAGT) (1) /518r (ATTACCGCGGCTGCTGG) (2)
- Arch344f (ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA) (21) 1 Arch915r (GTGCTCCCCCGCCAATTCCT) (21) - SRB385fRC (CCTGACGCAGCRACGCCG) (25) /518r (ATTACCGCGGCTGCTGG) (2)
- GC-clamp: 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3' (14, 19)
respectivement pour les domaines des Bacteria, des Archaea et pour les bactéries sulfate-réductrices (SRB,
o-
groupe des Proteobacteria et certaine Gram-positive Bacteria).SRB385fRC représente une combinaison entre les sondes SRB385 et I'SRB385Db décrites pour la détection des Desulfovibrionaceae et des Desulfobacteriaceae. Un Ge-clamp (6, 14) de 40 nucléotides a été ajouté à l'extrémité 3' des amorces 338f, Arch344f et SRB385fRC. La longueur des produits (sans GC-clamp) est respectivement de 180, 571 et 133 paires de bases. Ces amplifications ont été obtenues en utilisant une PCR
«Touchdown» selon le protocole suivant:
5 mln.
94aC 1min.
65°C - 1aC 30 sec. x 10 cycles
72aC 1 min.
94aC 1 min.
55°C 30 sec.
x
10 cycles72aC 1 min.
5min.
00
Les produits d'amplification ont été ensuite séparés grâce à la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Biorad) (6). Avec cette méthode d'électrophorèse, on utilise
un gel de gradient vertical dénaturant. Le temps d'électrophorèse a été de 5 heures à un voltage constant de 150 Volts et à une température de 60
oc.
Un paramètre spécifique variable est représenté par l'intervalle de dénaturation du gel. Nous avons utilisé des intervalles respectifs de 30-55% pour les Bacteria et les BSR et de 30-70% pour les Archaea. Un gel avec un gradient dénaturant de 100% correspond à 40% de formamide et 7M d'urée.Les gels contenant les différents profils ont été ensuite photographiés avec le UVP Bio Doc-lt™ System (Upland, USA) en utilisant un illuminateur UV, après avoir effectué un bain de coloration pendant 25 minutes dans une solution de 0.01 % de Sybrgreen 1® (Molecular Probe).
Les photos ainsi obtenues ont été converties, normalisées et analysées avec le
«GeiCompar software package version 3.1 » (applied Maths, Kortrijk, Belgium), en utilisant le coefficient «Pearson product moment correlation» et «l'unweighted pair group clustering method with arithmetic averages (UPGMA)». Afin de permettre une bonne conversion et normalisation du gel, un standard formé de 7 clones et d'un produit d'amplification d'une culture pure de Methanosarcina barkeri a été utilisé. Ce standard a en effet été utilisé dans tous les gels des Bacteria et des Archaea (22).
Clonage:
À partir des comptages de bactéries et des analyses chimiques, il a été possible d'identifier les profondeurs les plus significatives pouvant nous donner une majeure diversité phylogénique des bactéries sulfata-réductrices.
Pour le lac de Cadagno le sédiment du mois de juin 2001 a été analysé en différenciant les profondeurs suivantes: (C2) 0.5-1 cm, (C7) 3-3.5 cm, (C10) 4.5-5 cm, (C14) 8-9 cm, (C16) 10-11 cm et (C18) 12-13 cm (voir chapitre 4 pour les données de comptages et de chimie). Certaines profondeurs ont été regroupées durant le travail (16+18), afin de réduire le nombre des clonages.
Pour le Rotsee, deux zones ont été étudiées en utilisant le sédiment prélevé au mois de mai 2001: celle des 5 premiers centimètres ou RS1 (0-5 cm) et celle des 15 derniers centimètres ou RS2 (8-23 cm).
L'amplification a été faite avec les amorces des Oe/ta-proteobacteria (SRB385rc (25) 1 1387r ( 17), voir page 39) et les conditions suivantes:
2. MATERIEL ET METHODES
Mélange de PCR:
ADN (<1 tJg) 1 !JI
Taq PCR Master Mix (QIAGEN) 25 !JI
Amorce SRB385rc 1.5 1-11
Amorce 1387r 1.5 1-11
dH20
.21J!!
Cycle d'amplification:
94°C 94oC 52 oC 72°C
501-11
5 min. 1 min.
1 min. X 30 cycles 1 min.
?mm.
00
La présence des fragments amplifiés a été contrôlée avec un gel d'agarose 2% (longueur -1 kb).
Cinq clonages ont été faits pour le lac de Cadagno, nous permettant de voir s'il existait des différences phylogénétiques dues à la profondeur. Pour le Rotsee, les deux clonages
sédiment plus profond, et enfin d'identifier les espèces et de les comparer avec celles du lac de Cadagno.
Les échantillons ont été purifiés avec le kit "NucleoSpin® Extract kit" (Macherey-Nagel, Cat. No. 740 590.250) avant d'utiliser le kit de clonage "TOPO TA Cloning® Kit" (lnvitrogen K4575-01). Les clones ont été cultivés sur milieu de Luria Bertani (L. B. liquide et agarisé) avec ampicilline (concentration finale: 50 mg/1).
Milieu de Luria Bertani (L. B. agar):
10 g de Tryptone 5 g de Y east extract 10 g NaCI
15 g Agar
jusqu'à 1000 ml dH20
Autoclaver à 121
oc,
attendre que le milieu se refroidisse jusqu'à environ 50°C et ajouter une solution d'ampicilline afin d'avoir une concentration finale de 50 mg/1.Mélanger (mélangeur magnétique, si l'aimant a été inséré dans la solution avant sa stérilisation) et verser environ 20 ml du milieu dans des boîtes de Petri.
Le même milieu peut être fait sous forme liquide, simplement en n'ajoutant pas les 15 g d'agar.
Une fois que les clones ont été isolés des boîtes de Petri, il est possible de les stocker à -80°C en les remettant en culture liquide (850 !JI de L. B. avec ampicilline, pendant la nuit à 3]DC avec agitation), puis en y ajoutant 150 !JI de glycérol 87%.
ARDRA:
Afin de ne pas séquencer tous les clones, des réactions de digestion avec des enzymes de restriction ou endonucleases ont été effectuées. Les profils obtenus ont ensuite été comparés et différents représentants ont été choisis pour le séquençage.
Réamplification de l' ADNr 168:
Afin d'obtenir des fragments amplifiés de longueurs constantes (SRB385rc/1387r: -1 kb), deux amorces du plasmide on été utilisées ("TOPO TA Cloning® Kit" lnvitrogen K4575-01 ).
Amorce Séquence pMoles fournies par le kit
M13 Forward (-20) 5'-GT AAAACGACGGCCAG-3' 407
M13 Reverse 5'-CAGGAAACAGCT ATGAC-3' 385
Mélange de PCR:
ADN (<1 IJg) 1 !JI
Taq PCR Master Mix (QIAGEN) 25 !JI
Amorce F 1.5 !JI
Amorce R 1.5 !JI
d H zO
.1..1..!!!
50 !JI
2. MATERIEL ET METHODES
Cycle d'amplification:
94°C 94°C 55°C 72oC
5 min.
1 min.
1 min. X 30 cycles 1 min.
00
La présence des fragments amplifiés a été contrôlée avec un gel d'agarose 2% (longueur 1 kb) et les échantillons ont ensuite été digérés avec deux enzymes de restriction.
Réactions de digestion avec deux enzymes de restriction:
Les enzymes ont été choisis en vérifiant avec le logiciel sur le site http://www.restrictionmapper.org le nombre théorique de fragments qu'ils pouvaient générer sur les séquences des clones connus dans le Lac de Cadagno (CLONE22, AJ389622; CLONE141, AJ389624; CLONE167, AJ389625; CLON39, clone du sédiment).
On a donc choisi deux enzymes coupant le fragment amplifié (385 -1387, positions des amorces utilisées en corrélation avec I'ADNr 16S de E. colt) en un majeur nombre possible de brins.
Notre choix est ainsi tombé sur Hae/11 et Rsal (Promega).
Caractéristiques des enzymes de restriction utilisés:
Enzyme Catalog No Taille Concentration Longueur Séquence Tampon et % d'efficacité Hae/11 R6171 2,500
10 u/~1
u 4 pb GG/CC
c
100% L90% R90%Rsa/ R6371 1,000
10 u/~1
u 4 pb GT/AC
c
100% L90% R90%Afin d'obtenir le plus grand nombre de fragments, les deux endonucléases on été utilisées simultanément. Le tampon C, ayant la meilleure efficacité pour les deux enzymes, a donc été choisi.
Nombre des fragments théoriques produits par les deux enzymes sur les différents clones:
Les fragments de même longueur ( et D) ne pouvant pas être différenciés dans le gel d'agarose ont été comptés comme un seul.
En outre, les fragments d'une longueur inférieure à 20 pb (0) sont en général perdus pendant l'électrophorèse.
Pour les clones CLONE22 et CLONE141 on doit donc obtenir théoriquement 6 fragments.
CLONE167
Enzyme
-
Hae/11 Rsal Hae/11 Rsal Hae/11 Hae/11 Rsal Hae/11 Rsal-Position d'homologie
385 421 491 747 897 935 1216 1241 1251 125
1387
avec 6
l'enzyme, 5'
Longueur du fragment 136 P b 1 70 1 326 pb pb 1 150 pb 1 38 pb 1281 b 125 pb P 11 0 pb
l s
pb 1Pour le clone CLONE167 on doit obtenir théoriquement 7 fragments.
CLONE 39
Enzyme
-
Rsal Hae/11 Rsal Hae/11 Hae/11 Hae/11 Rsal-Position d'homologie
avec 385 464 787 870 908 1191 1373 1379 1387 l'enzyme, 5'
Longueur du 179 b 1 323 183 b 138 b 1 283 1182 b 1 6 pb 1 8 pb 1
fragment P pb P P pb P
Pour le clone CLONE39 on obtient théoriquement 6 fragments.
2. MATERIEL ET METHODES
Réaction de digestion:
dHzO 13 IJI
Tampon de restriction C
2 ~1
(1 Ox)
BSA, Acetylé (1mg/ml) 2 IJI pPCR (0.2 - 1.0 ~g) 1 ~1
Enzyme Hae/11 1 IJI
Enzyme Rsal 1 IJI
Volume final 20 ~1
Pour chaque exemple, un volume variable de produit de PCR (pPCR) a été ajouté, afin d'obtenir la concentration correcte du fragment amplifié (0.2 - 1.0 ~g). Par conséquent, on a diminué le volume d'eau bidistillée afin d'obtenir un volume final constant.
Le mélange a été préparé en gardant tous les composants dans la glace, afin de ne pas compromettre les enzymes, et le vortex n'a pas été utilisé (mélange avec pipette). Chaque tube a été centrifugé brièvement {12'000 x g), afin de concentrer le mélange au fond du tube. L'incubation a été effectuée durant deux heures à 3rC.
Le résultat de la digestion (20 ~1) a ensuite été vérifié avec un gel d'agarose 2%. Afin de pouvoir faire les comparaisons, le même marqueur {50 pb À ADN) ainsi que les mêmes conditions d'électrophorèse (100V pendant 1 heure, 1xTBE) ont été utilisés pour tous les gels.
Exemp!e d'un ge! d'agarose 2%: avec 1 '! ~!enez du par enzymes choisis.
')... 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ')...
Les images des gels ont ensuite été enregistrées sous forme de documents TIFF et analysées avec le programme "Gel Compare software, version 3.1" (applied Maths,
Kortrijk, Belgium). Les niveaux de similitude des différents profils de restriction ont été calculés avec le coefficient de corrélation "Band Dice" (option du programme). L'analyse des groupements a été appliquée avec la méthode "unweighted pair group" en faisant la moyenne arithmétique.
Séquençage:
Les produits de PCR ont été purifiés avec le kit "NucleoSpin® Extract kit" (Macherey-Nagel, Cat. No. 740 590.250), et préparés pour le séquençage avec le kit "ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystem).
Réaction de séquençage avec le kit "BigDye T·erminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit" (Applied Biosystem):
BigDye Terminator solution Tris Buffer 2.5X
Amorce (1 !JM) Amplicon dH20
2 !JI 4 !JI 2.4 !JI X !JI
--.Y.!!!
15 !JI
La solution de BigDye Terminator du fournisseur Applied Biosystem contient:
l'Ampli TaqRDNA Polymerase, la matrice 310/377 BigDye Terminators v1.1 (ddNTP: A-Dye, C-Oye, G-A-Dye, T-Dye), les nuclosides triphosphates (dNTP: dATP, dCTP, diTP, dUTP), la rTh pyrophosphatase, du MgCI2 et du Tris-HCI (pH=9).
Le tampon Tris Buffer 2.5X fourni aussi par Applied Biosystem est composé de 80 mM Tris-HCI pH 9 et 2 mM MgCb.
2. MATERIEL ET METHODES
La concentration du produit amplifié dépend de la longueur du fragment:
Longueur Quantité
Produit PCR:
100-200 pb 1-3 ng
200-500 pb 3-10 ng 500-1000 pb 5-20 ng 1 000-2000 pb 10-40 ng
> 2000 pb 40-100 ng
Simple brin 50-100 ng
Double brin 150-300 ng
Les produits de la réaction de séquençage (15 IJI) ont été purifiés en les déposant durant 2 heures sur des filtres de Nitrocellulose de 0.025 Jlm (VSWP04700 MILLIPORE), flottant sur une solution de TE (pH 8.0), afin d'éliminer les nucléotides et les amorces superflus.
Huit !JI de chaque échantillon ont enfin été prélevés des filtres et mélangés avec 12 1-11 de
"Template Suppression Reagent" ou "TSR" (Applied Biosystem) avant d'être insérés dans l'appareil de séquençage "ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystem) et analysés.
Analyse phylogénique:
Les séquences partielles obtenues (avec les premières 300 pb) ont été comparées (en enlevant l'amorce SRB385rc, on obtient un fragment de 280 pb) en utilisant le programme
"MegAiign software" (DNASTAR lnc., Windows 3.06a). Un arbre phylogénique a ensuite été construit avec le programme "MEGA3" (16). En outre, afin d'identifier les clones, des séquences de I'ARNr 16S bactérien, connues et disponibles dans la base de données
"EMBL-EBI Nucleotide Database" (http://www.ebi.ac.uk/Database/nucleotide.html ) ont été insérées.
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