ECOSYSTEMES CHOISIS
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES Phylum BVIII Nitrospira:
(voir figure 5.2.16)
Dans ce phylum on trouve dix séquences partielles isolées à partir du sédiment du lac de Cadagno, et deux séquences de référence. Une autre caractéristique importante est que ces organismes ont été mis en évidence seulement en dessous de 8-9 cm de profondeur, donc à partir de la zone riche en hydrogène sulfuré. De plus, C14S2 et C16-18S7 ont un pourcentage de similitude de 100%, ce qui réduit à neuf le nombre des phylotypes possibles. Les deux séquences de référence introduites dans le dendrogramme sont deux séquences partielles de I'ARNr 16S, appartenant à deux bactéries environnementales non cultivables. Tant AF524005 (6) que AF351225 (5) ont été identifiées en analysant respectivement du sédiment et de l'eau contaminés par des métaux.
Phylum BXIV Actinobacteria:
(voir figure 5.2.16)
Le quatorzième phylum des Bacteria est celui des Actinobacteria. Grâce au clonage effectué durant ce travail, il a été possible d'isoler une séquence partielle du gène ARNr 16S dans chaque lac. C14S12 et RS1 29 ont des pourcentages d'identité respectifs de 99.81% et 99.84% avec la séquence de référence de ce phylum, AJ007290 (29, 34). Enfin ces deux séquences ont entre elles un pourcentage d'identité de 99.86%. Le microorganisme de Cadagno était situé à une profondeur de 8-9 cm et celui du Rotsee était à une profondeur inférieure à 5 cm.
Phylum BXIII Firmicutes:
(voir figure 5.2.17)
Quinze séquences partielles du gène de I'ARNr 16s appartiennent à ce phylum. Onze ont été prélevées du lac de Cadagno et 4 du Rotsee. Dix séquences (C10S25, C16-18S41, C14S10, C10S49, C16-18S55, C7S4, C14S23, C14S42, C7S6 et RS1 36) sont proches (>99.80%) de deux espèces de Clostridium sp. (AB125279, (22); et L09174, (35)). Deux autres (RS1 11, RS1 34) sont proches (>99.96%) de Holofaga foetida (X77215, (25)). Il est en outre important de noter que ces deux dernières proviennent des cinq premiers centimètres du Rotsee. Enfin, trois espèces de ce phylum sont phylogénétiquement proches (>99.86%) de AB015022, Ha/ophilic bacterium MBIC33 (non publié, séquence déposée en 1998 par Hamada et al., dans la base de données EMBL). Les séquences
C7S3 et RS2 5 ont un pourcentage d'identité de 100%, représentant donc le même phylotype présent dans les deux lacs.
Delto~proteobaclerio (11SC, 32R, 27 ref.)
r -- - - · · · ·Phylum BVIII Nitro.<pira (lOC,- R, 2 ref.) I r- - -- - - -Phylum BXJV Actinobacteria (lC, IR, J ref.)
C2 (0.5--1 cm) C7 (3--3.5 cm) C10 (4.5-5 cm) C14 (8-9 cm)
C16-18 (10-11 + 12-13 cm) RS1:
R1 (O-Q.5 cm) R7 (3-3.5 cm) R10 (4.5-5 cm) RS2:
R14 (8-9 cm) R16 (10-11 cm) R23 (17-18 cm) R2B (22-23 cm)
Phylum BXIII Firmicutes (11C, 4R, 7 ref.)
L - - -- AY538172 Anaerobie bacterium sk,prop . - l ' - - - J I J 2 110GO U. Ho/ophaga/Acidobaclerium
Holophaga foetida
1 (17C,3R, 2 ref.)
Phylum BXV Planctomycetes (17C, 6R, 3 ref.)
Groupe 4 (14C, 5R, 2 ref.)
0.05
Figure 5.2.17: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du Phylum BXIII Firmicutes.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Del'la·pro/e·obac/eria (Il SC, 32R, 27 ref.)
Phylum BXIII Firmicu/es (llC, 4R, 7 ref.) c16-18s46
AF005745 UncuHured eubactarium l0.6.f
' - - - -- - - -- AY323233 Baclerlum VS
91
, . . - - -- - C10S40
, - - -- C16·1BS29 C16-1BS31
,..-- - - - - -C10S6
C2 (0.5-1 cm) C7 (3-3.5 cm) C10 (4.5-5 cm) C14 (8-9 cm)
C16-18 (10-11 + 12-13 cm) RS1:
R1 (0-0.5 cm) R7 (3-3.5 cm) R10 (4.5-5 cm) RS2:
R14 (8-9 cm) R16 (10-11 cm) R23(17-18cm) R28 (22-23 cm)
C14S21 ' - - -- - - - - -- - ,100:::-1 C14S26
Groupe 1 (17C, 3R, 2 ref.)
Phylum BXV Planctomyce/es (17C, 6R, 3 ref.)
Groupe 4 (14C, SR, 2 ref.)
0.05
Figure 5.2.18: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du Groupe 1.
Groupe 1:
La figure 5.2.18 représente le premier de quatre groupes (peut-être phyla) qui sont difficiles à caractériser (voir aussi figure 5.2.20). Les deux seules séquences de référence qu'il a été possible d'inclure dans ce groupe sont des séquences partielles de microorganismes environnementaux non cultivables. Il n'était donc pas possible d'avoir suffisamment d'informations pour mieux les caractériser.
Le groupe 1 (figure 5.2.18) comprend 15 possibles séquences différentes (17 séquences partielles; C14S21
=
C14S26 et C16-18S28=
C16-18S65) du lac de Gadagne et 3 du Rotsee (RS2 6, RS2 12 et RS1 14). Les deux seules séquences de référence introduites dans le dendrogramme sont l'eubactérie t0.6.f (AF005745, (9)) et la bactérie VS (AY323233, (10)). Pour les deux lacs, les séquences du gène ARNr 16S identifiées se retrouvent dans presque toutes les différentes profondeurs analysées. Plus précisément, pour le lac de Gadagne, cela est vrai seulement à partir de la profondeur C10 (4.5-5 cm).Phylum BXI Chlorobi:
(voir figure 5.2.19)
Six séquences partielles du lac de Gadagne et une seule du Rotsee ont pu être caractérisées comme appartenant au onzième phylum des Bactéries: c'est-à-dire celui des Chlorobi. Au niveau phylogénique, trois séquences de référence sont proches (>99.70%) de ces sept séquences. La première des trois est la bactérie Ch/orobium phaeobacteroides (CPY08104, (30)), très bien décrite et caractérisée, les deux autres au contraire sont des séquences du gène ARNr 16S de bactéries environnementales non cultivables: J'Uncultured Ch/orobi bacterium (AJ519406) et l' Uncultured actinobacterium (AJ519400, non publié, séquences déposées en 2002 par Geissler et al., dans la base de données EMBL).
Phylum BXV Planctomycetes:
(voir figure 5.2.19)
Le quinzième phylum des Bactéries est celui des Planctomycetes. Les clonages effectués durant ce travail ont permis d'identifier dix-sept séquences dans le Lac de Cadagno et six dans le Rotsee. Les trois séquences de référence les plus proches sont la bactérie non cultivable AY191354 Uncultured planctomycete (23), Pire/lu/a staleyi (AJ231183, (18)) et I'Uncultured sail bacterium PBS-11-13 (AJ390443, (12)). Pour les deux lacs, les possibles espèces trouvées proviennent de toutes les profondeurs analysées. De plus, dans le
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Rotsee, quatre différentes séquences représentent la même espèce, ce qui réduit à seulement deux les exemplaires appartenant à ce phylum (RS2 17 et RS 1 37
=
RS 1 15=
RS1 26
=
RS1 7).Groupe 2:
(voir figure 5.2.20)
Le groupe 2 représente les séquences identifiées dans les deux lacs, qui résultent proches (> 99.70%) d'une cyanobactérie marine appelée Symploca sp. VP642a (AY032932, (27)). Deux des séquences représentées appartiennent aux premiers centimètres du sédiment du Rotsee (RS1 10 et RS1 21). En revanche, la seule séquence appartenant au lac de Cadagno a été mise en évidence à une profondeur majeure (C16-18S 2), c'est-à-dire à 10-11 ou 12-13 cm.
Groupe 3:
(voir figure 5.2.20)
Trois autres séquences (C10S76, C14S27 et C16-18S69), cette fois-ci isolées seulement dans le sédiment du lac de Cadagno, sont proches phylogénétiquement (>99.80%) de deux séquences de la base de données EMBL. La séquence AY053493, (24) appelée At425_EubF1 a été détectée dans une source gazeuse du golf du Mexique, et a été décrite comme appartenant au phylum des Firmicutes. L'autre référence, I'Uncultured low G+C Gram-positive bacterium (AF507892, (20)) a été identifiée comme un Bacil/us ou Clostridum spp. isolé dans un lac alcalin de la Californie.
Groupe 4:
(voir figure 5.2.20)
Dans ce dernier groupe, on a enfin regroupé quatorze séquences du lac de Cadagno et cinq du Rotsee. Les deux seuls phylotypes de référence qui se rapprochaient de ces séquences appartiennent à une bactérie environnementale (AF254404, (47)), ainsi qu'un microorganisme non cultivable (AB109437, non publié, séquence déposée en 2003 par Yamada T., et al., dans la base de données EMBL).
Dellil·f''oteobaclerill (Il SC, 321l, 21 ref.)
L - -- - - CI>\'œ,IO<Chlorobhlmphaeobacleroid6s ' - -- - -- - -- A.I511141l0Uncullured Chlon:lbl bacterium
L---AJ$1~1~Unoul••~~~
lOO
L -- - -- -RS218
r - - - •Groupe 2 (JC, 2Rt 1 ref.) 1---·CroupeJ(JC,-~lref.)
C2 (0.5-1 cm) C7 (3-3.5 cm) C10 (4.5-5 cm) C14 (6-9 cm)
C16-18 (10-11 + 12-13 cm) RS1:
R1 (0·0.5 cm) R7 (3·3.5 cm) R10 (4.5-5 cm) RS2:
R14 (6·9 cm) R16(10·11 cm) R23 (17-16 cm) R26 (22·23 cm)
Phylum Xl Chlorobi (6C, 1 R, 3 ref.)
Phylum BXV P/anctomycetes (17C, 6R, 3 ref.)
Figure 5.2.19: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du Phylum BXI Chlorobi et du Phylum BXV Planctomycetes.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
De/to-proteobocterio (J tSC, 32R, 27 rer.)
r----···
Phylum BVIII Nitrospira (lOC,- R, 2 ref.)~r---• ~hylum BXIV Actinobacteriu (IC, IR, 1 ref.)
Xl Ch/orobi (6C, 1 R, 3 ref.)
Phylum BXV Planctomycetes (1 7C, 6R, 3 ref.)
C2 (0.5--1 cm) C7 (3-3.5 cm) C10 (4.5--5 cm) C14(8-9cm)
C1S-18 (10-11 + 12-13 cm) RS1:
R1 (0-0.5 cm) R7 (3-3.5 cm) R10 (4.5-5 cm) RS2:
R14 (8-9 cm) R16 (10-11 cm) R23 (17-18 cm) R28 (22-23 cm)
Groupe 2 (1C, 2R, 1 ref.)
Groupe 3 (3C, - R, 2 ref.)
Groupe 4 (14C, 5R, 2 ref.)
AF254404 Uncultured bacterium
A9109437 Anaerobie filamentous bacterium
o.os
Figure 5.2.20: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du Groupe 2, 3, 4.
5.3 DISCUSSION
L'analyse phylogénique du gène de I'ARNr 16S présentée dans ce chapitre montre la diversité des possibles bactéries sulfata-réductrices dans les deux lacs étudiés. Dans le tableau 5.3.1 sont présentées les caractéristiques des Delta-proteobacteria regroupées dans les différents sous-groupes pour les deux lacs.
CAO AGNO ROTSEE
Phylotypes
Profondeur Phylotypes
Profondeur Espèces putatives
Séquences de différents/ différents 1 communes aux deux lacs
(0-13 cm) (0-23 cm) référence
Tableau 5.3.1: Description des sous-groupes des Oe/ta-proteobacteria dans les deux lacs étudiés.
Q Sous-groupe SANS espèces de référence.
Le nombre des sous-groupes découverts dans le Cadagno (= 13) montre une plus grande
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
substrats nutritionnels. Les sous-groupes 5 et 12 sont caractérisés par des BSR de la partie plus superficielle (0-5 cm), dégradant donc les composés de la matière organique de la surface du sédiment. Enfin les microorganismes des sous-groupes 2,3,4,7,9 et 11 utilisent des donneurs d'électrons qui se trouvent à des profondeurs majeures. À l'exception de la seule séquence du sous-groupe 7, la même distribution est visible également dans l'analyse du sédiment du Rotsee. Le pourcentage des séquences obtenues dans les sous-groupes, pour Cadagno et le Rotsee sont respectivement de 37.5% (33/88) et 40% (10/25) pour le sous-groupe 1, environ 8% (7/88) et 32% (8/25) pour le sous-groupe 6, environ 14% (13/88) et 8% (2/25) pour le sous-groupe 11. Les autres sous-groupes des De/ta-proteobacteria ont enfin des pourcentages inférieurs dans les deux lacs. Ces pourcentages, même s'ils ne représentent pas vraiment le nombre des espèces des différents sous-groupes, mais plutôt celui des séquences obtenues après amplification, clonage et séquençage; montrent néanmoins une possible diversité d'espèces plus importante dans Cadagno que dans le Rotsee. En effet, ces trois sous-groupes représentent à eux seuls 60% et 80% des séquences obtenues respectivement dans les deux lacs. Enfin les sous-groupes 2,6,8,9 et la séquence C16-18S80 n'ont pas de séquences de référence similaires connues (base EMBL). Donc à part le sous-groupe 6, les autres sous-groupes peuvent être retenus spécifiques et nouveaux pour le lac de Cadagno. Le sous-groupe 6 est quant à lui présent dans les deux lacs. Au niveau phylogénique, le lac de Cadagno est donc certainement plus intéressant pour l'étude et la caractérisation de ces microorganismes.
En ce que concerne les séquences appartenant aux autres groupes phylogéniques, en particulier les phylum BVIII Nitrospira, le phylum BXIV Actinobacteria, le phylum BXIII Firmicutes, le Groupe 1, le phylum BXI Chlorobi, le phylum BXV Planctomycetes, et les groupes 2, 3 et 4, celles-ci ont été également amplifiées avec les amorces SRB385RC/1387r (28, 45). Les conditions d'amplification avant le clonage n'avaient pas pour but d'amplifier le plus grand nombre de séquences de BSR. De plus, on a déjà vu dans le chapitre 4, que la séquence homologue de l'amorce SRB385RC a été utilisée comme sonde moléculaire dans la technique du FISH. Cela est possible, vu que les sondes sont au contraire très spécifiques. En effet, si un seul nucléotide diffère d'une séquence et s'il se trouve au milieu de la sonde, cela suffit pour que la sonde ne s'hybride pas.
5.4 CONCLUSION
Les caractéristiques du sédiment du lac de Cadagno, c'est-à-dire l'absence de variations saisonnières, la constante absence d'oxygène, la prévalence de la sulfatoréduction et la présence de matière organique, nous avaient incité à approfondir l'étude de ces microorganismes. En utilisant donc les techniques d'écologie moléculaire, il a été possible d'identifier une grande variété de séquences appartenant aux Delta-proteobacteria. Les bactéries sulfata-réductrices sont pour la plupart encore inconnues. Leur distribution au niveau de la profondeur dépend probablement de la possibilité de rechercher des substrats nutritionnels spécifiques. Même s'il est actuellement encore assez difficile d'identifier ces relations biochimiques, on peut cependant mettre en évidence une différente disposition des sous-groupes en fonction de la production d'hydrogène sulfuré (8-9 cm). De plus, la comparaison avec le Rotsee, qui possède des caractéristiques bio-géologiques complètement différentes, a permis de montrer que la plupart des sous-groupes ont la même distribution dans le deux lacs. La différence plus importante à noter dans le Rotsee est une diversité inférieure des microorganismes et une biodégradation plus importante de la matière organique. Cette particularité est probablement due également à la présence d'oxygène et de microorganismes aérobies pendant la période de circulation. En plus dans les sous-groupes 1, 6 et 11 des Delta-proteobacteria on a pu identifier des phylotypes présentent dans les deux lacs. Il serait donc sûrement très intéressant de mieux analyser, dans le future, ces microorganismes ubiquitaires. Un autre approfondissement serait aussi l'étude des premiers 14 phylotypes du sous-groupe 1 et les sous-groupes 2, 8, 9, tel que la séquence C16-18S80 vu qu'ils ont été identifiés seulement dans le lac de Cadagno et ils ne contiennent pas d'espèces de référence.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
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5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
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La sulfatoréduction et la méthanogenèse caractérisent les étapes finales de la minéralisation de la matière organique dans des environnements anaérobiques tels que les sédiments lacustres. Grâce aux récentes techniques moléculaires, il a été possible d'identifier et de quantifier les bactéries sulfata-réductrices (BSR) et les Archaea méthanogènes (AM) dans de tels sédiments.
L'analyse annuelle de la distribution des BSR et des AM dans les sédiments du Rotsee a mis en évidence leur abondance dans les 5 premiers centimètres (5-10 x109 cellules g·1 de sédiment sec). L'absence apparente de séparation verticale montre l'importance de l'hétérogénéité tridimensionnelle des habitats microbiens et de la coexistence métabolique dans la zone active par la sulfatoréduction. Même en absence de gradient du sulfate en dessous de 5 cm de profondeur, les AM et les BSR étaient présentes en nombre significatif, c'est à dire à 1-5 x 109 cellules g·1 de sédiment sec. Cette situation suggère la coexistence entre les BSR qui possèdent un métabolisme synergétique avec celles qui peuvent également avoir un métabolisme fermentatif, et co-existent avec les méthanogènes. Les quantités les plus élevées de cellules bactériennes appartenant au domaine Bacteria (DAPI) et les cellules positives après hybridation avec la sonde SRB385 ont été observées au mois d'août, juste après la période de production primaire maximale du lac. Les Archaea ont présenté des valeurs plus basses au mois de mai, après le mélange hivernal, lorsque la concentration des THAA atteignait un minimum.
Les cellules identifiées comme appartenant aux Desu/fovibrionacées et aux Desulfobactéracées diminuaient pendant la période de stratification (baisse de disponibilité en sulfate dans la colonne d'eau pendant l'été), alors que les Archaea méthanogènes diminuaient de 50% durant le mélange du lac (phénomène en corrélation avec la diminution de matière organique fraîche).
En comparant les deux lacs (Cadagno et Rotsee ), tant la valeur mesurée du carbone organique total que celle des acides aminés hydrolysables totaux, étaient deux fois plus élevées dans le lac de Cadagno (à l'interface eau-sédiment 149 (TOC), et 77 (THAA) mg g·1 de sédiment (poids sec)) par rapport au Rotsee. De plus, ces valeurs étaient en relation avec les comptages microbiens. Dans le lac de Cadagno deux zones de plus
En comparant les deux lacs (Cadagno et Rotsee ), tant la valeur mesurée du carbone organique total que celle des acides aminés hydrolysables totaux, étaient deux fois plus élevées dans le lac de Cadagno (à l'interface eau-sédiment 149 (TOC), et 77 (THAA) mg g·1 de sédiment (poids sec)) par rapport au Rotsee. De plus, ces valeurs étaient en relation avec les comptages microbiens. Dans le lac de Cadagno deux zones de plus