MATERIEL ET METHODES
2.2 ANALYSES CHIMIQUES
Stratégie d'échantillonnage:
Des carottes de sédiment ont été prélevées au point le plus profond des deux lacs (21 m pour le lac de Cadagno et 16 m pour le Rotsee) à l'aide d'un foreur à gravité modifié avec des tubes en PVC. Le système de carottage utilisé permet le prélèvement d'une carotte de 48 cm de longueur avec un diamètre de 6.3 cm (12, 15). Ceci nous a permis de couper le sédiment en tranches de 0.5 à 1 cm d'épaisseur, jusqu'à 25 cm de profondeur. Chaque carotte a donc été subdivisée en échantillons pour les différentes analyses chimiques et moléculaires. A chaque prélèvement, à l'exception de celui d'octobre 2001, une autre carotte de sédiment de 30 cm a été extraite à la même profondeur. Cette dernière a été coupée en sections de 0.5 cm sur les 5 premiers centimètres et de 1 cm sur la longueur restante. Un demi à un gramme du sédiment des différentes profondeurs a été immédiatement utilisé pour l'extraction des acides nucléiques et des composés organiques tels que le carbone organique total (TOC, Total Organic Carbon), l'azote total (TN, Total Nitrogen), les acides aminés hydrolysables totaux (THAA, Total Hydrolysable Amino Acids) et les acides aminés. Une autre partie de ces sections a été stockée à -80oC pour les autres analyses. Le reste des portions a été fixé avec de I'EtOH (éthanol) à 96% ( 1:1) et gardé à -80°C afin des les utiliser par la suite pour une hybridation in situ fluorescente (CARD-FISH).
Plusieurs carottes de sédiment ont étés prélevées en été et en automne pendant les années 2000 et 2001 et des mesures immédiates de S(-11), de pH et de NH/ ont été faites dans l'eau interstitielle au moyen d'électrodes sélectives.
En même temps, la colonne d'eau a été échantillonnée avec des bouteilles Niskin tous les 2 m afin d'en analyser la composition chimique. En août et en novembre 2000, ainsi qu'en mai et en octobre 2001, le sédiment a également été échantillonné par la technique de diffusion équilibrée (4) (peepers).
Analyses chimiques dans l'eau interstitielle:
Les ions et les gaz ont été échantillonnés en utilisant la technique de diffusion équilibrée (4 ). Des plaques de dialyse (60cm de longueur, et 1 cm d'épaisseur) ont été placées durant 10 jours à la profondeur maximale. Aux mêmes endroits, des carottes de sédiment ont été extraites. Après récupération des plaques, grâce à des seringues, l'eau interstitielle
a été prélevée afin d'être analysée. À l'intérieur de la plaque, à chaque centimètre de profondeur se trouve une chambre différente qui contient l'eau équilibrée avec les composés chimiques présents dans l'eau interstitielle du sédiment aux mêmes profondeurs. Quand au pH, il a été mesuré avec un pH-mètre standard (Metrohm, Herisau, Suisse). L'alcalinité a été déterminée à partir du point de titration initial jusqu'au pH 4.3 avec 0.1M d'HCI (Metrohm 716 OMS Trinita). L'NH/ et le
sol-
ont été analysés par chromatographie ionique (Metrohm IC 690, Herisau, Suisse). Enfin, le S(-11) a été mesuré par colorimétrie (9).Les flux de S (-Il) entre l'interface eau-sédiment ont été déterminés en enregistrant les gradients de concentration verticaux avec une électrode de phase solide sélective pour le sulfure et des électrodes pour le pH. Nous avons en outre utilisé des électrodes miniatures pour S2- et le pH (Müller et Stierli, 1999 (18)) montés sur un micromanipulateur (Newport Instruments AG, Schlieren, Suisse). Une électrode trouvée dans le commerce a permis d'établir la référence pour Ag/AgCI (Metrohm, Suisse). Trois solutions avec chacune une activité définie de
s
2- et de pH ont ainsi permis de calibrer les Senseurs. Ce système de mesure mobile a été installé sur le radeau du lac. Tout de suite après son prélèvement, la carotte de sédiment était coupée en morceaux de longueur appropriée, puis chaque échantillon était placé dans un bain de glace et positionné sous le système mobile de mesure. Les électrodes étaient déplacées verticalement de 0.1 à O.Smm et les signaux étaient enregistrés au moyen d'un système «Channel 8 MacLab» (WissTech GmbH, Spechbach, Allemagne) et d'un ordinateur portable (pour les détails voir Müller et Stierli, 1999 (18)). L'excès d'eau dans le sédiment de la carotte était récolté pour en analyser le S(-11), I'02, le NH4 +et l'alcalinité. Le pH a été mesuré sur le site de prélèvement. L'acétate a été mesuré par chromatographie ionique en utilisant une procédure à différent gradient avec un faible éluant dans une colonne de basse capacité (3).Enfin, pour chaque échantillonnage, les profils de S2-et de pH étaient aussi déterminés au moyen d'un modèle de diffusion à une dimension, adapté par Epping et collaborateurs (1997) (10).
Analyse du méthane:
Directement après le prélèvement de la plaque de dialyse du sédiment, l'eau interstitielle a été extraite au moyen d'une seringue et transférée dans un verre de 1 Oml fermé par un
2. MATERIEL ET METHODES
bouchon en plastique mou contenant 2 ml de Na OH 1 M, permettant le «re-largage» du méthane dans la partie vide du récipient, et sa mesure par un chromatographe en phase gazeuse (HRGC 51 60; Carlo Erba, Milan, Italie), équipé d'un détecteur de ionisation à flamme (FID-40 ; Carlo Erba). L'H2 servait de gaz transporteur avec un flux de 4 ml min-1 à 40°C. Un volume de 0.2 ml de gaz éta_it donc injecté avec une seringue Hamilton et quantifié au moyen d'une courbe de calibrage à partir d'un standard de CH4. Les chromatographes et les surfaces des maxima ont été obtenus par un intégrateur.
Calcul des flux de diffusion:
Les flux de HC03-, NH/, CH4 et
sol-
entre l'interface eau-sédiment ont été calculés en utilisant la loi de Fick. Les coefficients de diffusion des ions àsoc
utilisés sont ceux publiés par Furrer et Wehrli ( 1996) (11).Mesures de TOC, TN et THAA:
Les échantillons congelés et lyophilisés ont été homogénéisés et le carbone organique total (TOC), l'azote total (TN) et les acides aminés totaux hydrolysables (THAA) mesurés.
Les TOC et les TN ont été mesurés au moyen d'un analyseur spécifique (Eiementar, varia EL) et les THAA ont été déterminés par un fluoromètre Turner Designs TD-700 (Witec AG, Littau, Suisse) (8).
Les valeurs des acides aminés totaux hydrolysables (THAA) ont été déterminées par dérivatisation avec o-phthaldialdehyde (OPA) de la même manière décrite par Dauwe et collaborateurs (8).
Protocole utilisé:
100 mg de sédiment congelé et lyophilisé sont homogénéisés et transférés dans une éprouvette Pyrex
Pour chaque échantillon ajouter 5 ml de 6N HCI
Incuber pendant 24 heures à 11
aoc
et centrifuger à 5000g pendant 10 minutes Conserver le surnageant à -20°C ou l'utiliser directement pour la dérivatisation OPA.- Dérivatisation OPA:
100 ~JI du surnageant hydrolysé sont mélangés avec 1700 1-JI d'une solution de borate de sodium (0.4M, pH 1 0)
Ajouter 100 ~JI de 6 N NaOH, vortexer et incuber pendant 1 heure à +20°C.
Centrifuger à 13000 rpm pendant 1 0 minutes
Diluer 100 111 du surnageant jusqu'à un volume final de 2 ml avec la solution phosphate de S0rensen (pH 8.0, pas isotonique)
Ajouter 100 1-JI du réactif OPA (100 ml du réactif OPA avec 50 1-JI de 2-mercaptoéthanol mélangé juste avant l'utilisation)
Mesurer la fluorescence après 5 minutes en utilisant le fluoromètre Turner Designs TD-700 (Witec AG, Littau, Switzerland) (8). Cet appareil était équipé d'un filtre avec une longueur d'onde d'excitation entre 300 et 400nm, et une longueur d'onde d'émission entre 410 et 610 nm. Les profils standards ont été préparés avec une solution standard d'acides aminés (Sigma AA-S-18, Steinheim, Germany).
Mesures des acides aminés individuels:
La valeur de chaque acide aminé a été mesurée en utilisant le protocole de Jones et Gilligan. Cette méthode se base sur la dérivatisation des acides aminés hydrolysables en utilisant OPA et successivement avec l'analyse à phase inverse de I'HPLC (13).
Outre à la glucosamine, les acides aminés suivants ont également pu être identifiés:
l'alanine (Aia), l'acide y-Aminobutyrique (y-ABA), l'acide aspartique (Asp), l'asparagine (Asn), l'acide glutamique (Glu), la glutamine (Gin), la glycine (Giy), l'histidine (His), l'isoleucine (lie), la leucine (Leu), la lysine (Lys), la phénylalanine (Phe), la sérine (Ser), la tyrosine (Tyr) et la valine (Val). La cystéine et la praline, la thréonine et l'arginine, et le tryptophane et la méthionine ne peuvent pas être séparés et ils sont donc considérés comme Cys/Pro, Thr/Arg, et Try/Met.
2. MATERIEL ET METHODES