ECOSYSTEMES CHOISIS
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Une première analyse de cet arbre phylogénique montre que le pourcentage des séquences appartenant au groupe des Delta-proteobacteria correspond à environ 60%
des séquences analysées dans les deux lacs. Les conditions peu sélectives (rannealing
=
52°C) d'amplification et une non spécificité relative des oligonucleotides utilisés (SRB385rc/1387r) ont contribué à l'amplification et le clonage des gènes codant pour les ARNr 16S de microorganismes appartenant à d'autre groupes phylogéniques (voir figure 5.2.3).Figure 5.2.3: Pourcentage de distribution des séquences partielles d'ARNr 168 dans les différents groupes phylogéniques à l'intérieur des librairies de clones des deux lacs.
L'avantage d'utiliser ces o!igonucléotides est avant tout celui de pouvoir amplifier un nombre de groupes phylogéniques limité par rapport à l'utilisation d'amorces universelles.
On a donc ainsi plus de chances d'amplifier les différentes bactéries sulfata-réductrices.
De plus, en utilisant le nombre des clones obtenus pour chaque lac, il a été possible de calculer la courbe de "raréfaction" (aRarefactWin, version 1.3; S. Holland, Stratigraphy Lab, University of Georgia, Athens [http://www.uga.edu/strata/softwarell) qui montre le nombre des groupes phylogéniques possibles, en relation avec les clones analysés. La courbe ainsi obtenue pour le lac de Gad agno (voir figure 5.2.4) nous a permis d'affirmer que le clonage nous a fourni un nombre suffisant de clones et donc que le résultat est représentatif de la diversité microbienne du sédiment. En ce qui concerne le Rotsee, on ne peut pas affirmer la même chose, même si les valeurs sont proches du nombre maximal des groupes. Il a été décidé d'accepter également ce résultat, étant donné que l'intérêt majeur de ce travail était d'approfondir l'analyse des clones à l'intérieur du groupe des Delta-proteobacteria et pas dans les autres groupes phylogéniques.
...
0 0 ('l') 0 L() 0 1'-- 00>
... ...
0 0 ('l')...
Nombre de séquences
0 L()
...
0 !'--...
0 0>...
- cadagno Rotsee
Figure 5.2.4: Courbe de raréfaction des types phylogéniques en fonction du nombre de séquences pour les deux lacs.
Groupe des Delta-proteobacteria:
Parmi les clones analysés, 147 appartenaient à cette subdivision phylogénique. Cent quinze séquences provenaient du sédiment du lac de Cadagno, 32 séquences de celui du Rotsee. De plus, grâce à l'introduction des séquences de référence (voir EMBL-EBI FASTA Nucleotide Database: http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html), il a été possible de subdiviser ce groupe phylogénique en 13 sous-groupes spécifiques (voir figure 5.2.5). De ces derniers, quatre (sous-groupes 2, 6, 8 et 9) n'ont pas de séquences de référence et sept (sous-groupes 2, 3, 4, 8, 9, 10, 13) n'ont pas de séquences identifiées dans le sédiment du Rotsee. Ces derniers peuvent donc être considérés comme spécifiques pour Cadagno. Les autres sous-groupes, au contraire, ont des représentants des deux lacs et sont proches de séquences de référence connues.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Sous-groupe 1 (43C, 14R, 13 ref.)
..._ _ _ __ _ _ Sous-groupe 2 (2C, - R,- ref.)
99
xxC: nombre de séquences partielles provenant du sédiment du lac de Cadagno et appartenant au sous-groupe.
xxR:nombre de séquences partielles provenant du sédiment du Rotsee et appartenat au sous-groupe.
xxref: nombre de séquences de référence les plus significatives appartenant au sous-gaupe.
98 Sous-groupe 3: Desulfomonile sp. (7C,- R, 7 ref.) ._ _ _ _ _ Sous-groupe 4 (2C,- R, 2 ref.)
Sous-groupe 5 (4C, 4R, 10 ref.)
Sous-groupe 6 (SC, 9R, - ref.)
, . . - . - - -- - -AF41817 4 Desulfoarculus baarsii DSM 2075 64
r-- ---•Sous-groupe 8 (3C,- R,- ref.) Sous-groupe 9 (12C, - R, - ref.)
. -- - -- -- -c16-18s80 100
.---- - - - -_,.Sous-groupe 10: CandDiv OP8 (6C,- R, 1 ref.)
54
100 Sous-groupe 11 (17C, 3R, 2 ref.) L - - - s o u s - g r o u p e 12 (IC, IR, 1 ref.)
L---•••••••••
Sous-groupe 13 (SC,- R, 2 ref.)0.05
Figure 5.2.5: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du groupe des Oelta-proteobacteria.
Comme pour la représentation globale des clonages, pour le groupe des Delta-proteobacteria, le nombre maximal de subdivisions possibles (types phylogéniques) a été calculé (voir figure 5.2.6). Pour le lac de Cadagno l'analyse des 115 clones a donné 13 sous-groupes différents, ce qui est représentatif de la biodiversité de ces microorganismes. Au contraire, pour le Rotsee, les 32 séquences obtenues dans le groupe des Delta-proteobacteria ne sont pas suffisantes pour une représentation de la diversité phylogénique. On peut en tout cas remarquer que la courbe du Rotsee a une
Figure 5.2.6: Courbe de raréfaction des types phylogéniques à l'intérieur des Delta-proteobacteria en fonction du nombre de séquences pour les deux lacs.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
Un autre analyse intéressante possible est celle d'examiner les séquences obtenues selon la profondeur, à l'intérieur des différents sous-groupes des Delta-proteobacteria (voir figure 5.2. 7).
En ce qui concerne le lac de Cadagno, cinq clonages à différentes profondeurs ont été effectués: les trois premiers (C2 (0-0.5 cm), C7 (3-3.5 cm), C10 (4.5-5 cm)) dans la partie plus superficielle du sédiment, les deux autres (C14 (8-9 cm), C16-18 (10-11 et 12-13 cm)) à une profondeur majeure (voir chapitre 2.4 ). Cette subdivision en deux parties est justifiée par les profils chimiques du sédiment, qui montrent un pic de production d'hydrogène sulfuré (H2S) à huit centimètres (voir chapitre 4). La figure 5.2.7 montre en effet le pourcentage des clones identifiés à chaque profondeur dans les différents sous-groupes.
La profondeur plus superficielle (C2), très riche en eau, a donné une unique séquence appartenant au sous-groupe 7. Des représentants de chaque profondeur ont été trouvés uniquement dans deux sous-groupes (sous-groupe 1 et 6). Les sous-groupes 5 et 12 sont au contraire caractérisés seulement par des organismes appartenant à la partie plus superficielle du sédiment. Deux autres sous-groupes (1 0 et 13) sont constitués d'organismes présents entre trois et neuf centimètres, et enfin, les séquences de la partie plus profonde du sédiment caractérisent les sous-groupes 2, 3, 4, 7, 8, 9 et 11.
Figure 5.2.7:Pourcentage des clones selon la profondeur dans les différents sous-groupes des Delta-proteobacteria pour le lac de Cadagno.
Pour le Rotsee, seuls deux clonages ont été effectués, en mélangeant les produits d'amplification des différentes profondeurs de manière équivalente (voir chapitre 2.4). RS1 correspond à la partie plus superficielle du sédiment (R1 (0-0.5 cm), R7 (3-3.5 cm), R1 0 (4.5-5 cm)) et RS2 à celle plus profonde (R14 (8-9 cm), R16 (10-11 cm), R23 (17-18 cm), R28 (22-23 cm)). De même que pour le lac de Cadagno, dans cette analyse, (voir figure 5.2.8), les deux sous-groupes 1 et 6 sont caractérisés par des séquences appartenant aux différentes profondeurs. Les sous-groupes 5 et 12 sont également représentés uniquement par des séquences appartenant à la partie plus superficielle du sédiment, et au contraire, le sous-groupe 11 à la région plus profonde. La seule différence qu'il a été possible de mettre en évidence entre les deux lacs est le sous-groupe 7, qui dans le Rotsee est représenté par des séquences spécifiques de la partie plus superficielle .
•
Sous-groupe 1 Sous-groupe 5c
s._)LJ<3-Ç. U~•Pe 6c c
Sous-groupe 11RS1
c
RS2
0 5 10 15 20 25
Pourcentage des clones
Figure 5.2.8: Pourcentage des clones selon la profondeur dans les différents sous-groupes des Delta-proteobacteria pour le Rotsee.
Les figures suivantes (à partir de 5.2.9 jusqu'à 5.2.15) montrent les arbres phylogéniques des différents sous-groupes des Delta-proteobacteria.
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C10S9
C10S55 C16-18S24
C14S59
c16-18s68
C14S50 a:z C16-13S23
eiS.I8s66
C7S1
u C14S73
C7S23
IL.- - - - -So .. ,....;r<Ho~U(IC.IR.Ird.) l _ - - - · s .,..,""K"'"I"'I.l(5C-K,lrd.)
C2 (0.5-1 cm) C7 (3-3.5 cm) C10 (4.5-5 cm) C14 (8-9cm)
C16-18 (10-11 + 12-13 cm)
R$1:
R1 (0-0.5 cm) R7 (3-3.5 cm) R10 (4.5-5 cm)
RS2:
R14 (8-9 cm) R16 (10-11 cm) R23 (17-18 cm) R28 (22-23 cm)
Sous-groupe 1 (43C, 14R, 13 ref.)
Figure 5.2.9: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du groupe des Delta-proteobacteria, Sous-groupe 1.
Sous-groupe 1:
(voir figure 5.2.9)
Dans le premier sous-groupe des Delta-proteobacteria on trouve 43 séquences du lac de Cadagno, 14 du Rotsee et 13 séquences de référence. Le nombre des clones identifiés correspond respectivement à 37.4% et 43.8% des séquences identifiées dans le groupe des Delta-proteobacteria. De plus, dans ce sous-groupe il a été déjà mis en évidence que pour les deux lacs, des séquences de chaque profondeur sont présentes (voir figure 5.2.7 et 5.2.8). Le fait que dans le Rotsee le pourcentage soit majeur pourrait signifier une mineure variabilité des Delta-proteobacteria. Cette dernière affirmation devrait en tout cas être vérifiée en analysant un nombre plus élevé de clones (voir 5.2.6).
En examinant le dendrogramme du haut vers le bas, on peut également mettre en évidence d'autre caractéristiques intéressantes.
Les 14 premières séquences (voir tableau 5.2.3), qui montrent entre elles un pourcentage d'identité supérieur à 97.8%, ont toutes été isolées dans le lac de Cadagno, à une profondeur supérieure à cinq centimètres (autour du pic de concentration en hydrogène sulfuré). Vu qu'aucune des séquences de référence n'est assez proche, on peut les considérer comme de nouvelles espèces potentielles et il serait donc intéressant de construire une sonde moléculaire spécifique qui puisse les mettre en évidence afin de mieux les caractériser.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C10S31 1 C10S55 2 99.7
CIOS9 3 99.7 99.5
C14S17 4 99.2 98.9 98.9 C14S50 5 99.5 99.2 99.2 99.7 C14S59 6 98.9 98.6 98.6 98.1 98.4
C14S9 7 100 99.7 99.7 99.2 99.5 98.9
C16-18S23 8 99.2 98.9 98.9 99.5 99.7 98.1 99.2 C16-18S24 9 100 99.7 99.7 99.2 99.5 98.9 100 99.2 C16-18S26 10 99.7 99.5 99.5 98.9 99.2 98.6 99.7 98.9 99.7 C16-18S60 11 99.5 99.2 99.2 98.6 98.9 98.4 99.5 98.6 99.5 99.2 C16-18S61 12 99.7 99.5 99.5 98.9 99.2 98.6 99.7 98.9 99.7 99.5 99.2 C16-18S66 13 98.9 98.6 98.6 99.2 99.5 97.8 98.9 99.2 98.9 98.6 98.4 98.6 Tableau 5.2.3: Pourcentage de similitude entre les différentes séquences
A la suite de ces séquences, on trouve une séquence partielle du lac de Cadagno (C16-18S64) identifiée à une profondeur entre 1 0 et 14 centimètres, qui montre un pourcentage d'identité de 1 00% avec une séquence environnementale (AF523966) découverte dans le
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
sol d'une forêt humide, très contaminée par du soufre, des métaux et des sels (6). A la surface du sédiment du Rotsee (entre 0 et 5 centimètres), il a été également possible d'isoler une séquence (RS1 31) ayant un pourcentage d'identité de 99.99% avec ce clone (C16-18S64 ).
Les cinq séquences suivantes (C7S1, C16-18S11, C16-18S78, C14S6, et C16-18S76) ont été isolées à partir du sédiment de Cadagno à une profondeur de 3-3.5 cm et au dessous de 8 cm respectivement (au dessous du pic de concentration en hydrogène sulfuré), mais il n'a pas été possible de les caractériser avec des séquences connues de la base de données EMBL. Ainsi, elles pourraient représenter de nouvelles espèces environnementales.
Quatre séquences (RS1 4, RS1 27
=
RS1 20 et RS1 16), qui ont été isolées dans les 5 premiers cm du sédiment du Rotsee, avaient au contraire un pourcentage d'identité entre 99.78% et 99.98% avec la séquence AJ306771 (non publié, séquence déposée dans la base des donnée EMBL en 2001 par Schloetelburg, C.) qui est une souche environnementale. Deux autres séquences proches de ce dernier groupe, on montré entre elles un pourcentage d'identité de 100%. Il a donc été décidé de les considérer comme une seule espèce (RS1 12=
RS1 17).Un autre groupe formé par cinq clones (C10S22, C16-18S59, RS1 25 et C10S41), était proche de Syntrophus sp. (AF126282). En particulier, le clone C10S41 a montré un pourcentage d'identité de 99.99% avec ce microorganisme, qui a été mis en culture et reconnu comme un nouveau genre et donc une nouvelle espèce: Smithiella propionica gen. nov., sp. nov., capable d'oxyder le propionate (26). Mais ces 5 séquences étaient également proches d'une séquence partielle d'une bactérie environnementale (AJ831750), qui a été identifiée le long de la colonne d'eau et dans les sédiments de Cadagno (42) (annexe 1 ), avec des pourcentages d'identité supérieurs ou égaux à 99.98%. Enfin, il faut aussi remarquer que la séquence du Rotsee a été détectée à une profondeur inférieure à 5 cm dans le sédiment et que celles du lac de Cadagno, au contraire, appartenaient à une profondeur supérieure.
Les cinq séquences suivantes, provenant des couches plus profondes des sédiments, ont entre elles un pourcentage d'identité de 100% et devraient donc appartenir à une seule
espèce qu'on appellera C14S4 (= RS1 6 = C16-18S25 = C16-18S75 = C16-18S77). De plus, il n'a pas été possible de trouver des séquences proches de C14S4 dans la base de données EMBL. C14S4 a donc été considérée comme appartenant à un nouveau groupe phylogénique à analyser ultérieurement, afin de mieux le caractériser.
Un autre groupe est composé de quatre séquences partielles du Rotsee, ainsi que d'une séquence de Cadagno ayant un pourcentage d'identité de 100% (RS2 2, RS1 3, C7S30) et de 99.83% (RS2 10
=
RS2 4) avec la bactérie non cultivable AJ306775 (non publié, séquence déposée dans la base des donnée EMBL en 2002 par Schloetlburg C. ).Enfin, le dernier groupe est composé de huit séquences de référence dont 4 souches types (M3447, (13); AJ441316, (48); U45989, (17); M34402, (13)) et 4 bactéries non cultivables (AF141328, (39)). Trois de celles-ci ont été découvertes dans la colonne d'eau du lac de Cadagno (AJ831748, AJ831749, AJ831753, (42) ou voir annexe 1). Ce dernier groupe comprend 13 séquences partielles du sédiment de Cadagno et une du Rotsee. Il faut aussi remarquer que C 14S66 et RS 1 2 représentent la même séquence identifiée dans les deux lacs. De plus, les clones C14S30, C14S73, C10S1, C7S23 et C7S27 ont un pourcentage d'identité de 100%, et ont été extraits du sédiment entre 3 et 9 cm de profondeur, donc au dessus du pic maximal de concentration en hydrogène sulfuré.
5. ANALYSE PHYLOGENIQUE DES BACTERIES SULFATO-REDUCTRICES
AJ316022 U. Desulfomonile sp. 16S rRNA 73 AJ316024 U. Desulfomonile sp. 16S rRNA
AJ316020 U. Desulfomonile sp. 168 rRNA Sous-groupe 3: Desulfomonile sp. (7C, - R, 7 ref.)
64
AJ316021 U. Desulfomonile sp. 168 rRNA
C16-18S39 C14S36 55 C10S33 c16-18s79
. - - - -- U28172 Desulfuromonas palmitatis . - --AJ237601 Desulfobacterium anilini
C10S39 Sous-groupe 4 (2C, - R, 2 ref.)
Sous-groupe 6 (8C, 9R, -ref.)
~---···Sous-groupe 7 (4C, IR, 2 ref.) .--- - -- AF41817 4 Desulfoarculus baarsii DSM 2075
64
Figure 5.2.1 0: Arbre phylogénique (385 pb, Neighbor-joining) du groupe des Delta-proteobacteria, Sous-groupe 2, 3 et 4.
Sous-groupe 2:
(voir figure 5.2.1 0)
Dans ce deuxième sous-groupe des Delta-proteobacteria, on trouve deux séquences du lac de Cadagno (C10S17 et C16-18S71), qui ont entre elles un pourcentage d'identité de 99.96% et qui, au niveau phylogénique, ne présentent aucune similitude avec une espèce connue de la base de données EMBL. Elles représentent donc un groupe environnemental nouveau.
Sous-groupe 3:
(voir figure 5.2.1 0)
Le troisième sous-groupe des Delta-proteobacteria comprend 7 séquences extraites du sédiment du lac de Cadagno (C16-18S58, C16-18S73, C10S19, C16-18S39, C14S36, C10S33, C16-18S79), et 7 séquences provenant de la base de données EMBL (AF282178, AF230531, (40); M26635, non publié, séquence déposée en 1999 par Woese et al., dans la base de données EMBL; AJ316020, AJ316021, AJ316022, AJ316024, (42) ou voir annexe 1 ). Ces 14 séquences partielles ont entre elles un pourcentage d'identité supérieur à 99.97%, ce qui nous permet d'affirmer avec une haute probabilité qu'elles appartiennent toutes au genre Desulfomonile sp. De plus, C16-18S39, C14S36, C10S33 et C16-18S79 représentent potentiellement la même espèce (pourcentage d'identité égal à 100% ). On peut donc mettre en évidence que dans le sédiment du lac de Cadagno, il existe 4 différents groupes phylogéniques à l'intérieur du genre Desulfomonile sp., qui ont été identifiés entre 5 et 13 cm de profondeur, donc autour de la profondeur de 8 cm (majeure concentration d'hydrogène sulfuré libéré). Afin de mieux les caractériser il serait intéressant de construire des sondes moléculaires spécifiques, avec lesquelles on pourrait mieux les différencier et les quantifier, soit verticalement soit en fonction des saisons.
Sous-groupe 4:
(voir figure 5.2.1 0)
Le dernier sous-groupe, représenté dans la figure 5.2.1 0, est composé de deux séquences isolées du lac de Cadagno, et deux séquences de EMBL (U2817, non publié, séquence déposé en 1995 par Coates, J.O. dans la base de données EMBL; et AJ237601, (19)). Les clones C14S48 et C10S30 ont entre eux un pourcentage d'identité de 99.75%. De plus, ils présentent des similitudes respectives de 99.96% et 99.74% avec Desulfobacterium anilini (AJ237601, (19)). Enfin, C14S48 a été extrait à une profondeur de 8-9 cm, donc dans un environnement riche en hydrogène sulfuré.