Analyses chimiques du bois de cœur

4.2.2. Analyses chimiques du bois de cœur

Pour rester dans la limite des moyens financiers disponibles, seuls 157 échantillons parmi les 217 récoltés ont été analysés chimiquement. Le choix de ces échantillons a été réalisé de sorte à avoir un nombre équivalent d’individus dans chaque population (soit 20 individus par population, excepté 30 à Ouvéa et 7 à Pindaï), en privilégiant les échantillons issus d’arbres dont le diamètre était le plus proche possible de la moyenne, afin d’éviter au maximum l’effet « âge de l’arbre » sur la variabilité des compositions chimiques.

4.2.2.1. Extraction des échantillons

La méthode d’extraction des échantillons a été l’extraction au solvant car elle se prête mieux à l’analyse de nombreux petits échantillons que l’entraînement à la vapeur qui nécessite en moyenne 10 fois plus de copeaux. C’est donc la concrète qui a été extraite.

Une fois bien homogénéisé par mélange manuel, 1 gramme de copeaux est pesé à l'aide d'une balance de précision, puis placé dans un flacon de 15 mL avec 10 mL de solvant : le chloroforme (CHCl3). Enfin, 1mL d’une solution étalon (octanol en solution dans de l’éthanol à 2 g/L) est introduit dans le flacon afin de pouvoir estimer le rendement de l’extraction et donc celui du bois prélevé. L’extraction a été fixée à 48 heures pour chaque échantillon afin que toute la concrète soit mobilisée. Préalablement à l’injection dans le chromatographe, les échantillons ont été filtrés sur filtre papier. Ils ont enfin été dilués 3 fois dans du chloroforme dans un flacon de chromatographie d’un volume de 1 mL afin d’avoir la concentration idéale pour une meilleure détection et intégration par le chromatographe.

4.2.2.2. Injection et analyse des échantillons

L’analyse des échantillons a été réalisée sur un chromatographe en phase gazeuse de type Perkin Elmer AutoSystem XL, équipé d’un injecteur automatique Autosampler A/S Perkin Elmer utilisant une seringue de 5µL, lavée avant l’injection au solvant puis à la solution analysée et d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) à H2 (45 mL/min) et air (450 mL/min) et d‘une valve PSI, split. La colonne utilisée est une PE-5 N9931 6079 (5 % diphényl, 95 % diméthyl polysiloxane) de 60 m de longueur, 0,25 mm de diamètre interne et de 0,25 µm d’épaisseur du film de phase. Le gaz vecteur a été l’Hélium à un flux de 12 mL/min et le volume injecté de 1 µl par échantillon. Le logiciel qui pilote le système est Turbochrom 4.1 (Perkin Elmer).

Le programme du chromatographe appliqué à tous les échantillons a été le suivant : - température initiale de 80ºC,

- température finale de 245ºC, et - gradient de température de 3°C/min.

Chaque analyse a donc duré près de 55 minutes. La température de l’injecteur et du détecteur a, par ailleurs, été fixée à 280°C.

La validité de chaque analyse a été vérifiée par l’observation de chaque chromatogramme. En effet, dans le cas d’extraits trop ou pas assez concentrés, la séparation des pics par le chromatographe n’est pas la même, rendant leurs comparaisons statistiques moins précises. Le cas échéant, l’extrait a été à nouveau dilué ou concentré afin d’être de nouveau analysé. En général, la bonne concentration des extraits est telle que la somme des surfaces intégrées est comprise entre 1.10⁶ et 1,5.10⁶ (unités du logiciel).

4.2.2.3. Interprétation des chromatogrammes.

La sélection des pics les plus pertinents, les séparations et regroupements ont été établis sur une base essentiellement quantitative : lorsque plusieurs pics, correspondant à plusieurs molécules se superposent, ils sont regroupés sous une même dénomination, d’autre part, on élimine les molécules trop faibles ou insuffisamment concentrées. Dans notre analyse, 33 pics ou groupes de pics bien distincts et facilement repérables ont ainsi été retenus. On opère pour chaque fichier de données une intégration de l’ensemble des pics y compris celui de l’étalon n-octanol afin d’obtenir l’aire de ce dernier, qui servira au calcul des rendements, et une intégration sans l’étalon pour avoir l’aire totale de la concrète et les compositions relatives réelles. L’intégration des pics de chacune des 150 analyses a été contrôlée et validée. La

Figure 4.4

Exemple de chromatogramme obtenu lors des analyses (échantillon LIFOU 13)

Etalon octanol

hydrocarbures

Sesquiterpènes oxygénés = mono-alcools

répétitivité des temps de rétention est bonne. Des tests de répétitivité n’ont pu être menés sur nos échantillons du fait du fort coût unitaire de ce type d’analyse.

Les premiers pics à apparaître sont ceux correspondant aux molécules les plus volatiles. Les derniers concernent les molécules les moins volatiles sachant que certaines trop peu volatiles n’apparaissent pas sur le chromatogramme bien qu’elles soient présentes dans la concrète. Pour résumer, apparaissent donc tout d’abord les hydrocarbures qui sont suivis des mono-alcools (ou sesquiterpénols oxygénés) puis des diols (figure 4.4). Les noms précis des molécules ont pu être déterminés pour 10 pics sur les 33 sélectionnés. Cette identification a été effectuée grâce au calcul des indices de Kovats (temps de rétention) et en s’appuyant sur les résultats d’études précédentes en Chromatographie Gazeuse et Spectrométrie de Masse (Phytochemical Services Australia pour Cosmécal). Ces 10 molécules sont des molécules importantes, communes dans les compositions chimiques des huiles essentielles de Santal.

4.2.2.4. Les variables analysées

L’intégration des pics pour chaque chromatogramme permet d’obtenir les aires des pics (Ap) (proportionnelles à la quantité de molécules dans la concrète), l’aire de l’étalon n-octanol (Ae), ainsi que l’aire totale de la concrète (Ac) qui est la somme des aires de chaque pic (aire de l’étalon comprise).

Le pourcentage d’un pic dans un chromatogramme (Pp) est défini comme suit :

100 ×     = Ap_Ac Pp

Ces pourcentages sont souvent préférés aux aires des pics pour mener des analyses statistiques (Buttaud, comm.pers.). Nous avons donc choisi de mener toutes les analyses statistiques de ce chapitre sur les pourcentages d’aires des pics.

Le rendement de la concrète se calcule de la manière suivante :

( )

( )

où Me est la masse de l’étalon (masse standard de 0.182 µg par échantillon) et Mb la masse de bois (masse de l’échantillon), qui est précisément de 1g pour chaque échantillon. R s’exprime donc en g par kg de bois. Cependant nous n’avons pas analysé les rendements car la masse de l’échantillon peut être influencée par divers facteurs indépendants de l’arbre, dont le taux d’humidité ambiant lors de la récolte. Ces facteurs peuvent conduire à des interprétations erronées du rendement de la concrète.

Dans le but d’étudier les origines possibles de la variation chimique, nous avons inclus à cette étude d’autres types de données :

- le diamètre à 1.30 m et la hauteur de chaque arbre prélevé

- des facteurs abiotiques : la pluviométrie moyenne au sein des populations échantillonnées, ainsi que le type de sol.

- les données des microsatellites nucléaires pour chaque arbre prélevé.