Analyses biochimiques

Pour l’analyse de l’acidité et de la teneur en sucres nous avons mesuré la quantité de leurs principaux composants à savoir pour les sucres, le saccharose, le fructose et le glucose et pour l’acidité, le citrate et le malate. Le dosage a été fait par la méthode enzymatique qui est

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plus précise et plus économique que l’HPLC. La préparation des échantillons, l’extraction des sucres et des acides organiques et leur dosage ont été adaptés aux agrumes à partir des

protocoles élaborés par Gomez et al. (2007). Quelques modifications ont été apportées à ces

protocoles.

2.2.3.1.Préparation des échantillons

Les fruits prélevés sur la population ont été pesés, pelés, repesés, coupés et lyophilisés à l’aide d’un lyophilisateur (Christ BETA 1-8-LD). La durée de la lyophilisation a été plus au moins variable selon les échantillons. Celle-ci peut durer à jusqu’à deux semaines pour que les échantillons soient complètement secs. Les échantillons sont pesés avant et après lyophilisation afin de déterminer le pourcentage de matière sèche de chaque échantillon. Les échantillons secs sont ensuite réduits en poudre très fine à l’aide d’un broyeur à bille « Tissue lyser II » et conservés à -20°C.

2.2.3.2.Extraction des sucres et des acides

Pour extraire les sucres et les acides à partir de la poudre lyophilisée, on s’est inspiré

du protocole de Gomez et al.(2007) qui a été simplifié. L’extraction a été faite à partir de 20 mg

de poudre lyophilisée et solubilisée dans 2 mL d’eau ultra pure. La suspension est agitée avec deux billes à une fréquence de 15 Hz pendant 5 min à l’aide d’un broyeur à billes et centrifugée pendant 5 mn à 13 200 tr/min à 4°C. Pour éliminer des composés phénoliques susceptibles d’interférer lors du dosage, 10 mg de PVPP sont rajoutés à 1 600 µL du surnageant. Le mélange est agité pendant 20 min (40 tr/min) à 4°C pour être ensuite centrifugé pendant 10 min à13 200 tr/min, à 4°C. Le surnageant est récupéré et conservé à -20°C afin d’être dosé. Il est à signaler que les deux protocoles permettent d’extraire à la fois les sucres et les acides organiques.

2.2.3.3.Dosage par méthode enzymatique des sucres

La formation de NADH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide) au cours de l’oxydation du glucose-6-phosphate représente un bon indicateur pour déterminer la quantité de glucose, de fructose et de saccharose initialement présente dans une solution. Pour cela, le principe du dosage enzymatique consiste à mettre en œuvre plusieurs réactions chimiques en cascade qui permettent la transformation de trois sucres en Glucose-6-phosphate ainsi que son oxydation en NADH (figure 22).

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Figure 22. Réactions chimiques mises en œuvre au cours de dosage enzymatique des

sucres. ATP : Adénosine-5'-triphosphate, ADP : Adénosine diphosphate, NAD : Nicotinamide

Adénine Dinucléotide, HK : Héxokinase, G6PDH : Glucose-6-phosphate, PGI :

Phosphoglucose isomérase, β-F : β-Fructosidase.

Plusieurs préparatifs précèdent le dosage. En effet, il est nécessaire de préparer les solutions tampon, diluer les échantillons, préparer les points de gamme d’étalon et préparer les solutions enzymatiques avant de commencer le dosage. Afin de préparer les solutions enzymatiques, il est recommandé de préparer le tampon triéthanolamine de pH 7.6 et la solution de sulfate d’ammonium à 2.5 M à l’avance. La solution tampon est faite en mélangeant 55.9 g de triéthanolamine, 2.5 g de sulfate de magnésium et quelques gouttes d’HCl dans 500 mL d’eau ultra pure. Pour obtenir la solution de sulfate d’ammonium 16.7 g

de ce réactif sont solubilisés dans 50 mL d’eau ultra pure. Une fois que le tampon

triéthanolamine est prêt la première solution enzymatique (S1) peut être préparée. Pour cela,

30 mg de NAD, 150 mg d’ATP (Adénosine-5'-triphosphate) et 150 mg de NaHCO₃

(Carbonate de sodium) sont solubilisés dans 3 mL d’eau et 12 mL du tampon triéthanolamine. La deuxième solution (S2) est obtenue en mélangeant 33 µL de G6PDH (Glucose-6

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phosphate déshydrogénase), 33 µL d’hexokinase, 940 µL de la solution de sulfate d’ammonium et 2 mL d’eau ultra pure. La troisième solution (S3) contient 20 µL de phosphoglucose isomérase (PGI) rajoutés à 14 mL d’eau ultrapure. Quant à la quatrième solution (S4), elle est obtenue par la dissolution de 8 mg de β-fructosidase dans 3 mL d’eau ultra pure. La préparation des solutions enzymatiques est suivie par la dilution des échantillons et par la préparation des points de la gamme faite à partir d’une solution mère du glucose, fructose et saccharose de concentration 2 g/L. Ces deux étapes peuvent être faites avant ou après la préparation des solutions enzymatiques.

Pour démarrer le dosage, 150 mL des échantillons et des points de la gamme sont déposés dans les puits de la microplaque. 10 µL de la S1 sont rajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite agitée et une mesure de densité optique à 340 nm est effectuée. Pour initier les deux premières réactions chimiques permettant la quantification du glucose, 20 µL de la S2 sont distribués. La microplaque est de nouveau agitée. Après une incubation de 3 heures à température constante de 25°C, une lecture de densité optique est réalisée. Pour quantifier le fructose, 20 µL de S3 sont déposés et mélangés dans la même microplaque. Au bout de 3 heures d’incubation à 25°C, une nouvelle lecture de la densité optique est faite. Le dosage continue encore en rajoutant 20 µL de S4. Les réactions initiées par cette solution enzymatique permettent la détermination de la quantité du saccharose présente dans les échantillons. La microplaque est agitée et incubée dans une étuve pendant 3 heures à 25°C. Le dosage se termine par une dernière lecture de la densité optique à la même longueur d’onde : 340nm. Les valeurs de la densité optique sont ensuite utilisées pour la quantification des trois sucres en se référant à la gamme étalon.

Les réactions de dosage du glucose et du fructose durent chacune deux heures selon le

protocole de Gomez et al. (2007). Cette durée n’a pas été suffisante pour atteindre le plateau au

cours de notre dosage. Selon les tests effectués, 3 heures été nécessaires pour stabiliser la réaction.

2.2.3.4.Dosage par méthode enzymatique des acides organiques

Le dosage des deux acides organiques a été effectué selon le protocole élaboré par l’équipe de Laurent Gomez à Avignon (unité PSH, INRA Avignon, France). Le protocole n’est pas encore publié. Avant d’utiliser ce protocole, quelques tests ont été effectués pour valider la méthode sur agrumes. Les seules modifications apportées à ce protocole consistent

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à diminuer la durée des deux réactions de dosage de l’acide citrique et de l’acide malique à 2 heures au lieu de 3 heures pour l’acide citrique et à 2 h:45 pour l’acide malique.

2.2.3.5.Dosage de l’acide citrique

La quantification de l’acide citrique contenu dans les extraits se fait via la quantification de la disparition du NADH utilisé au cours des réactions de la dégradation de l’acide citrique (Figure 23). La première réaction régénère de l’oxaloacétate qui se transforme soit en L-malate sous l’action de L-MDH (L-Malate déshydrogénase) soit en pyruvate qui lui-même se transforme en L-Lactate sous l’action de L-LDH (L-Lactate déshydrogénase). Ces deux dernières réactions consomment de la NADH dont la quantité utilisée est proportionnelle à la quantité d’acide citrique dégradée.

Figure 23. Réactions chimiques mises en œuvre lors de dosage enzymatique de l’acide

citrique. L-MDH : L-Malate Déshydrogénase, L-LDH : L-Malate Déshydrogénase, CL :Citrate lyase

Pour doser l’acide citrique, deux solutions enzymatiques sont préparées. La première solution (S1) contient 12 mL de tampon glycyl glycine à pH7.8 (4.75 g de glycyl glycine, 880 mg d’acide L-glutamique, environ 1.5 mL de NaOH (10 N) et 60 mL d’eau ultra pure), 23 µL de malate déshydrogénase (MDH), 102 µL de lactate déshydrogénase LDH et 5 mg de Nicotinamide adénine dinucléotide (NADH). Par ailleurs la deuxième solution (S2) est

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obtenue suite à la solubilisation de 48 mg de citrate lyase dans 3 mL d’eau ultra pure. En plus des solutions enzymatiques, huit points de gamme à concentrations différentes allant de 0 à 50 mg/L sont préparés à partir d’une solution mère d’acide citrique de concentration 1 g/L. Les échantillons correspondant aux différents points de la gamme sont déposés dans la microplaque avec les échantillons qui sont dilués auparavant. 100 µL de la solution S1 sont distribués. La microplaque est ensuite agitée pendant 30 secondes. Cette agitation est suivie de 10 minutes d’attente avant de faire la première lecture de la densité optique à 340 nm (maximum d’absorption de NADH). Un ajout de 20 µL de S2 est ensuite effectué. Après deux heures d’incubation dans une étuve à 25°C, une deuxième lecture de densité optique est effectuée. Les concentrations d’acide citrique sont déterminées en se référant à la courbe d’étalonnage.

2.2.3.6. Dosage de l’acide malique

Le dosage d’acide malique par la méthode enzymatique se base sur la détermination de la quantité de NADH formée au cours de la dégradation de l’acide malique. Au cours de ces réactions de dégradation de l’acide malique, le L-malate déshydrogénase en présence de

NAD⁺ oxyde l’acide malique en NADH et en oxaloacétate. Ce dernier se transforme en

L-aspartate et en 2-oxoglutarate sous l’action de glutamate-oxaloacétate transminase (GOT) (Figure 24).

Figure 24. Réactions chimiques mises en œuvre lors du dosage de l’acide malique. L-MDH :

L-Malate Déshydrogénase, GOT : Glutamate-oxaloacétate transminase

Pour mettre en œuvre ces réactions de dosage de l’acide malique, il est nécessaire de diluer les échantillons et de préparer les points de la gamme étalon ainsi que les solutions enzymatiques.

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Les points de la gamme sont préparés à partir d’une solution mère d’acide malique dont la concentration est égale à 1 g/L. La concentration des points de la gamme va de 0 à 50 mg/L. La préparation des solutions enzymatique commence par la préparation du tampon glycylglycine à pH 10. Pour cela 4.75 mg de glycylglycine, 880 mg d’acide L-glutamique et environ 4 mL de NAOH (10 N) sont solubilisés dans un volume de 60 mL d’eau ultra pure. La première solution enzymatique (S1) est obtenue en mélangeant 6 mL de ce tampon et 6

mL d’eau ultra pure. La deuxième solution (S2) contient 54 mg de NAD⁺ dissous dans 3 mL

d’eau ultra pure. Les deux enzymes catalyseurs des deux réactions sont présentes dans les troisième et quatrième solutions. En effet, la troisième solution (S3) est préparée en mélangeant 20 µL de GOT dans 2.98 µL d’eau ultra pure. Quant à la quatrième solution (S4), elle est obtenue suite à la dilution de 20 µL de L-MDH dans 2.98 µL d’eau ultra pure.

Une fois le tampon, les solutions enzymatiques et la gamme préparés, 100µL des échantillons et des points de gamme sont déposés dans les puits de la microplaque. A ce volume initial, 100 µL de S1, 20 µL de S2 et 20 µL de S3 sont rajoutés. La microplaque est ensuite agitée. Une lecture de la densité optique est effectuée à 340 nm (longueur d’onde d’absorbance maximum du NADH), 10 minutes après l’agitation. La première mesure de la densité optique est suivie par l’ajout de 20 µL de S4. Les réactions de la dégradation d’acide malique sont alors initiées. La microplaque est agitée puis incubée dans une étuve pendant deux heures à température constante égale à 25°C. Après incubation, une nouvelle lecture de la densité optique est réalisée. Les données sont ensuite analysées pour déterminer la quantité d’acide malique présente initialement dans les échantillons.