Analyse du niveau du 1-hydroxypyrène (1-HOP), métabolite des HAPs

L’analyse du 1-HOP a été réalisé conformément à la procédure décrite par Ovrebo et al., (1995). Après un traitement avec sulphatase et glucuronidase pendant 16 h à 37,8° C, les échantillons sont purifiés sur une phase solide (Millipore, Milford, MA) puis lavés à l'eau et le 1-hydroxypyrène est élué avec du méthanol. Environ 20 µl de l'éluat ont été analysés par

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HPLC avec un détecteur à fluorescence (Perkin-Elmer Ltd, Beaconsfield, Royaume-Uni) à 242 nm (excitation) et 288 nm (émission). Cinq échantillons d’urine contenant du 1-HOP à des concentrations de 10, 20, 40, 100 et 250 nmol / L ont servi de standards.

III.5.3. Analyse des niveaux de modifications de l’ADN III.5.3.1. Etude de la fragmentation de l’ADN

III.5.3.1.1. Extraction de l’ADN à partir des lymphocytes circulants

L’extraction de l’ADN est réalisée à partir des lymphocytes circulants. 10 ml de sang hépariné sont dilués au ½ avec du PBS 1x. Ensuite 10 ml de lymphoprep sont ajoutés lentement au fond du tube contenant le sang dilué et une centrifugation à 2500 rpm est conduite à 4°C pendant 20 min (Eppendorf Centrifuge 5415R ; Centrifuge 5810R). La couche de lymphocytes recueillie après la centrifugation est lavée deux fois avec du PBS 1x. Le culot de lymphocytes obtenu sert à l’extraction de l’ADN à l’aide du kit d’extraction Nucleon Bacc3 fourni par Amersham.

III.5.3.1.2. Electrophorèse de l’ADN

L’étude de la fragmentation de l’ADN extrait des lymphocytes est réalisée par électrophorèse en gel d’agarose 1% en pH alcalin (Tris-Borate-EDTA : TBE 1× PH= 8) suivant la procédure décrite par Traoré et al., (2001). Le gel contenant 1% bromure d’éthidium est soumis à une électrophorèse à 80 V pendant une heure à température ambiante. Le degré de fragmentation est estimé selon l’intensité croissante de la fragmentation par +0, +1, +2, +3.

III.5.3.2. Analyse des cassures de brins et modification de bases par le test des comètes III.5.3.2.1. Isolement des lymphocytes pour le test des comètes

Les lymphocytes sont isolés à partir de 500 µl de sang comme précédemment décrit dans l’étude de la fragmentation. Le culot de lymphocytes obtenu est dissous dans du RPMI 1640 (Roosevelt-Parc Medium Institute) supplémenté avec 50 % de BSA et 10 % de diméthylsulfoxide (DMSO). Les échantillons de lymphocytes ainsi préparés sont conservés à

Matériels et méthodes

46 III.5.3.2.2. Détermination du niveau de coupures de brins et de bases modifiées

Nous avons utilisé dans cette étude la version modifiée du test développé par Collins et al., (1993). Cette version permet l’identification non seulement des coupures de brins, mais aussi des purines modifiées grâce à l’utilisation de la formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) qui est une enzyme extraite d'Escherichia coli qui hydrolyse les liaisons N-glycosidiques des purines (adénine et guanine).

75 µl de lymphocytes sont mélangés avec 600 µl d'agarose low melting point à 0,75 % préparé dans du PBS et conservé à 37°C. 120 µl du mélange (agarose  cellules) sont déposés sur la face rugueuse d'une lame spéciale pour l’analyse des comètes. Les lames sont ensuite laissées à 4°C pendant 5 min pour permettre la solidification du gel.

Pour chaque échantillon de lymphocytes, deux gels sont préparés : l'un pour quantifier les taux de coupures de brins dans l’ADN et l'autre pour évaluer les purines modifiées dans le DNA.

Les lames sont placées dans une solution de lyse (NaCl 2,5 M, EDTA 0,1M et Tris base 10mM, pH = 10 + Triton X-100 1% ajouté extemporanément et agitée 10 min avant utilisation) pendant une heure à 4°C.

Les lames sont ensuite lavées trois fois avec le tampon (KCl 0,1M, HEPES 40 mM, EDTA 0,5 mM et BSA à 0,2g/l, pH=8) approprié à la formamidopyrimidine glycosylase (FPG). Ensuite 50 µl de la solution enzymatique sont déposés sur les gels qui doivent subir le traitement enzymatique puis recouverts d’une lamelle couvre-objet. Les autres lames reçoivent 50 µl du tampon de l'enzyme seul. Les lames ainsi traitées sont placées dans une boîte humide (pour éviter une dessiccation du gel) et incubées dans une étuve à 37°C pendant 45 min.

Immédiatement à la fin du traitement enzymatique, les lamelles sont retirées du gel et les lames sont placées dans une solution alcaline (300 mM NaOH et 1 mM EDTA pH > 13) pendant 40 min pour subir une dénaturation alcaline.

Après ce traitement alcalin et révélation des sites alcali-labiles, une électrophorèse est réalisée à 25V, 300 mA pendant 20 min à 4°C dans la même solution alcaline pour produire des comètes.

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Après l'électrophorèse, les fragments d’ADN au sein du gel sont rincés deux fois avec le tampon de neutralisation (Tris-HCl 400 mM, pH 7,5). Ce lavage permet d'éliminer l'excès de solution alcaline qui pourrait éventuellement gêner la coloration des lames. Après neutralisation, les lames sont soit colorées et les comètes visualisées, soit séchées à température ambiante après deux heures d’immersion dans l'éthanol à 90 %. Cette dernière option permet de conserver les lames sur une longue période.

Une coloration de ces lames est réalisée à l’aide de YOYO-1 (Benzoxazolium-4-quinolinum oxazole yellow homodimer) qui a une meilleure sensibilité que le bromure d'éthidium et la DAPI (4',6-diamidine-2-phenylindol dichloride).

Les comètes sont visualisées avec un microscope fluorescent couplé à une caméra Olympus qui est reliée à un ordinateur doté d'un logiciel de traitement d’image (Komet 4.0 kinetic Imaging Ltd).

Une analyse visuelle des cellules est aussi possible en regroupant, les différents niveaux de dommages dans 5 classes (0 à 4) (figure 11 ci-dessous). Cette méthode nous a permis de redéfinir l’étendue d’ADN endommagé lorsque le logiciel de traitement d’images définit mal la queue de la comète. Sur chaque gel 50 cellules sélectionnées au hasard sont visualisées.

Matériels et méthodes

48 Légende : Classe 0 : ADN non endommagé bien circulaire en couleur blanche

Classe 1 : ADN faiblement endommagé, le rond commence à s’étirer Classe 2 : ADN un peu plus endommagé, la comète est munie d’une queue

Classe 3 : Les ¾ d’ADN sont endommagés et ont migré dans la queue de la comète

Classe 4 : La totalité de l’ADN est endommagé et a migré dans la queue de la

comète.

Les comètes sont quantifiées en évaluant le pourcentage de DNA migré dans la queue de la comète. Les taux de coupures de brins sont évalués en calculant le pourcentage moyen d’ADN à l’échelle des 50 cellules sélectionnées sur les gels incubés avec le tampon de l’enzyme seul.

L'estimation du taux de purines modifiées s'obtient par une soustraction entre le pourcentage moyen d’ADN endommagé sur les lames incubées avec la FPG et le pourcentage moyen de cassure de brin.

III.5.3.3. Détermination des adduits par la méthode de post marquage au ³²P

La détermination des adduits a été réalisée à l’Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire de Strasbourg (France). La méthode de radiomarquage au ³²P combinée avec l'enrichissement a la nucléase P1, comme décrite précédemment par Binkova et al., 1998 a été utilisée avec des modifications mineures pour quantifier le niveau des adduits d’ADN. Brièvement, 7 µg d’ADN sont digérés pendant 4h à 37°C avec 290 mU nucléase micrococale

% purines modifiées = % DNA avec FPG - % DNA avec tampon

 % DNA au niveau de 50 cellules % moyen CB =

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(Sigma, St Louis, MO) et 1,2 mU de phosphodiestérase de rate (ICN Biomédicales Inc Irvine, CA), suivi d’un enrichissement des adduits à la nucléase P1. Cette étape est suivie par celle de radiomarquage avec 50 µCi de [γ-³²P] ATP et 6 U de T4 polynucléotide kinase. L’ADN radiomarqué est soumis à une chromatographie sur membrane de cellulose polyéthylèneimine avec les tampons suivants (D1 : 1M tampon phosphate, pH 6,0; en D2 : 3,5 M formiate de lithium, 8,5 M urée, pH 3,5; en D3 ; 0,8 M de chlorure de lithium, de 0,5 M Tris, 8,5 M urée, pH 8,0, et en D4 ; 1,7 M de sodium tampon phosphate, pH 6,0).

Les adduits marqués sont détectés par autoradiographie dans les 24 ou 48 h qui suivent l'exposition des films, et quantifiés avec Bio-ImagerBas2000 phosphoranalyser (Fuji, Tokyo, Japon). Les niveaux d’adduits sont exprimés sous forme de moyenne d'adduits d'ADN par 108 nucléotides non modifiés calculée à partir de deux essais indépendants.

III.5.3.4. Analyse du niveau de la 8-oxodG

La 8-oxodG est analysée comme décrit par Traoré et collaborateurs (2000). Les échantillons d’ADN sont hydrolysés et analysés par HPLC (Beckman Gold System).