Pour étudier l’expression de Sqh dans les CP, j’ai d’abord analysé sa localisation subcellulaire dans des
follicules de stades 3 à 4. J’ai utilisé un anticorps spécifique dirigé contre la forme active de Sqh (Sqh1P)
98 Figure 24. Localisation majoritairement apicale de la forme active de Sqh (Sqh1) et de Sqh:GFP au sein des groupes de 3CP. Images confocales des follicules entre les stades 3-4 de l’ovogenèse. Les CP sont identifiées par immunomarquage de la Fasciclin III (Fas3+) en rouge. A) Follicule contrôle de génotype : upd-Gal4/+ ; +/CyO. (A-A1) La forme active de Sqh (Sqh1P) est marquée en verte. (A2) Le marquage Sqh1P est montré en fausse couleur (Royal) pour indiquer l’intensité du signal. La couleur blanche indique la saturation du marquage. B) Follicule contrôle de génotype : upd-Gal4/sqhAX3 ;
sqhprom-sqh :GFP/+. C) Follicule avec une réduction de l'expression d’upd spécifiquement dans les CP en utilisant le système UAS-Gal4, génotype : upd-Gal4/sqhAX3 ; sqhprom-sqh :GFP/UAS-updARNi. (B-B1, C-C1) L’expression de la GFP, en vert, met en évidence la localisation de la protéine de fusion Sqh:GFP et (B, C) le DAPI en bleu marque les noyaux des cellules. Barre d’échelle : 2µm.
99 fortement dans les CP. Le marquage anti-Sqh montre une faible accumulation de la protéine
phosphorylée au niveau du cytoplasme des CP et une forte accumulation dans leur domaine apical
(Fig. 24A-A2).
J’ai également suivi une deuxième stratégie pour visualiser le patron d’expression de Sqh dans les CP
en caractérisant l’expression de Sqh:GFP dans la lignée sqhAX3/sqhAX3 ; sqhprom-Sqh:GFP/sqhprom-
Sqh:GFP. Afin d’éviter une surexpression de la protéine Sqh due à l’introduction du transgène sqh:GFP,
cette lignée contient un allèle amorphe de sqh (sqhAX3) qui, à l’état homozygote, conduit à une létalité
embryonnaire. Cette létalité est supprimée par la présence du transgène Sqh:GFP qui exprime une
protéine de fusion Sqh:GFP sous contrôle du promoteur du gène sqh.
Des follicules de stades 3-4 de mouches sqhAX3 /upd-Gal4; sqhprom-Sqh:GFP/+ ont été marqués à l’aide
de l’anticorps anti-Fas3 et d’un anticorps dirigé contre la GFP. Les CP présentent un marquage
cytoplasmique faible de Sqh:GFP avec une accumulation élevée du signal au niveau du domaine apical
(Fig. 24B-B2), similaire au marquage Sqh1P (Fig. 24A-A2), mais également des niveaux assez forts dans
la partie basale des CP.
Je me suis ensuite concentrée sur l’analyse de l’accumulation de Sqh:GFP dans le domaine apical des
CP surnuméraires puisque ce domaine change de forme drastiquement au cours du remodelage des
CP, transitant d’une forme polygonale à 4-5 côtés à une forme de lentille au cours de l’enveloppement.
Afin de pouvoir délimiter les JA des CP, j’ai utilisé un anticorps anti-Cadhérine. Des images confocales
de haute résolution à partir de vues directes de pôles (Fig. 25A) contenants 3CP ont été produites sur
des ovaires de mouches sqhAX3 /upd-Gal4; sqhprom-Sqh:GFP/+. Grâce au marquage Cadhérine, j’ai pu
identifier les différentes catégories du remodelage subapical de la CP sur 21 cas analysés (4SP n=4,
3SP n=7, 2SP n=10) (Fig. 25C-H, C2-H2). Deux distributions de Sqh:GFP ont été identifiées par la
détection de la GFP dans le domaine subapical des CP en cours d’enveloppement (Fig. 25B, C-H,
100 Figure 25. Distributions corticale et uniforme de Sqh:GFP au cours du remodelage subapical des groupes de 3CP. A) Schéma de la façon de visualisation du domaine subapical des CP dans cette expérience (sauf F). B) Schéma de la distribution corticale et uniforme de Sqh:GFP (vert) montrant les régions corticale et médiale du domaine subapical. Les JA sont montrées en magenta. i1 correspond au contact entre les 2CP enveloppantes. o3 correspond au contact entre la CP qui est progressivement enveloppée et les CF adjacentes. C-H2 sauf F) Projections de 2-3 coupes (z=0,3µm) d’images confocales d'immunomarquages Cadhérine (Cad) et GFP au niveau du domaine subapical des CP prises comme schématiser en (A). F) Image obtenue à partir d’une reconstruction 3D des images prises latéralement du domaine subapical des CP. (C-C2, F-F2) Le marquage Cadhérine en magenta ou gris permet d’identifier la forme de la CP progressivement internalisée en commençant par des formes >4SP (4SP et 5SP, C-C2, F-F2, respectivement), une forme 3SP (D-D2, G-G2), une forme 2SP (E-E2, H-H2). (C-C1, D-D1, E-E1) Distribution corticale de sqh :GFP en vert ou gris. (F-F1, G-G1, H-H1) Distribution médiale de sqh :GFP en vert ou gris. (C-H2) Barre d’échelle 2µm.
101 Une distribution corticale dans laquelle Sqh:GFP est majoritairement présente au niveau du cortex
(région corticale) et s’accumule faiblement dans la région médiale (Fig. 25B, C-E, C1-E1) et une
distribution uniforme dans laquelle Sqh:GFP est présente dans tout le domaine subapical de façon uniforme (Fig. 25B, F-H, F1-H1).
Ces deux distributions de Sqh:GFP ont été observées indépendamment des étapes du remodelage des
CP dans la partie apicale (Fig. 25C-H2) et ont également été repérées avec une distribution corticale
majoritaire dans les CP qui enveloppent (n=20/21) (Fig. 25C-H2 et donnés non montrés). Ces résultats
suggèrent que la distribution de Sqh varie dans le domaine subapical des CP pendant tout le processus
d’enveloppement et n’est pas coordonnée entre les CP enveloppantes et la CP qui est enveloppée
dans un groupe de 3CP (Fig. 25G-G2). D’autre part, je n’ai pas observé d’accumulation de Sqh:GFP au
niveau des JA qui remodèlent (Fig. 25B o3, G-G2). Je n’ai pas non plus observé de structure en forme
d’anneau renforcé en Sqh:GFP dans les différents cas analysés. 10 cas de CP surnuméraires avec une
configuration 2SP ont été analysés mais une structure apicale de Sqh :GFP en forme d’anneau n’a été
observée dans aucun d’entre eux. Comme la configuration 2SP des CP surnuméraires est maintenue
pendant plusieurs heures (>2h, voir manuscrit), il est possible qu’il faille analyser plus de cas pour
pouvoir repérer cette structure potentiellement furtive.
Des analyses en temps réel permettraient d’accéder à une dynamique de Sqh au cours du remodelage
du domaine subapical des CP ainsi qu’au niveau de leurs JA.
Afin de déterminer si Sqh joue un rôle dans l’élimination des CP surnuméraires, des analyses de perte
et de gain de fonction ont été réalisées.
B. La fonction de sqh ne semble pas requise dans les CP pour l’élimination des CP surnuméraires.