Analyse fonctionnelle des mutants de LlFpg dans un contexte d’extraits cellulaires bruts

Après introduction des mutations sur le plasmide codant pour LlFpg de type sauvage, les protéines recombinantes correspondantes ont été surproduites dans une souche de E. coli pour laquelle le gène codant pour EcFpg a été délété (voir le « Matériel et méthodes »). Après avoir lysé les cellules et estimé la concentration en LlFpg et en protéines totales dans les extraits cellulaires bruts obtenus, nous avons normalisé la quantité de protéine LlFpg dans nos différents extraits contenant les différentes formes mutantes de la protéine (voir le « Matériel et méthodes »). Nous avons ensuite réalisé des tests fonctionnels sur la 8-oxo-G ou son analogue carbocyclique avec nos mutants de LlFpg dans un contexte d’extraits cellulaires bruts. La mise au point de tels tests utilisant des extraits cellulaires peut nous permettre de discriminer les mutants intéressant de ceux qui ne le sont pas en gagnant beaucoup de temps par rapport aux mêmes manipulations sur les protéines purifiées (la purification d’un mutant de Fpg dure

Figure 42 : Structure plane de la 8-oxo-G et de son analogue c8-oxo-G.

La partie 8-oxo-G des deux molécules est représentée en noir, et la partie squelette phosphate/sucre ou phosphate/cyclopentane de la 8-oxo-G et du c8-oxo-G sont représentées en vert. Le carbone remplaçant l’oxygène du désoxyribose pour le c8-oxo-G est représenté en rouge.

- Analyse de la fixation des mutants de LlFpg sur des ADNs contenant une guanine ou un c8-oxo-G dans un contexte d’extraits cellulaires bruts

Sur cette base, nous avons mesuré par électrophorèse en gel retard la capacité de nos différents mutants à se fixer sur des duplexes de 14 paires de bases G/C (sans lésion) et c8-oxo-G/C (avec un analogue de lésion) (Tableau 20 du « Matériel et méthodes ») dans un contexte d’extrait cellulaire brut (conditions alternatives n°1, voir le « Matériel et méthodes »). Ces manipulations ont donc eu pour but de vérifier si nos mutants protéiques possédaient toujours la capacité de se fixer à l’ADN, et si cette fixation était toujours spécifique des duplexes d’ADN contenant l’analogue de lésion c8-oxo-G par rapport à ceux ne contenant pas de lésion.

Un exemple de ce type de manipulations sur les extraits exprimant les mutants E2L, E2M, E2D et E2Q est présenté dans la Figure 43. Seuls les résultats obtenus avec les mutants de la position 2 de LlFpg seront présentés dans ce chapitre, par contre, le Tableau 9 du sous-chapitre suivant présentera un récapitulatif des données obtenues avec tous nos mutants.

Les bandes retardées par rapport à la migration de l’ADN libre sont attribuées à des complexes ADN/protéine (Figure 43). De tels complexes entre Fpg et les duplexes G/C et c8-oxo-G/C sont présents avec tous nos mutants de LlFpg (les résultats obtenus pour les mutants E2N, E2R et E2T ne sont pas présentés, mais donnent des résultats similaires), hormis pour l’extrait ne surproduisant pas Fpg (noté ∅∅∅∅ dans la Figure 43). Cela indique d’une part que la

Figure 43 : Gel en conditions natives correspondant à la fixation de Fpg WT ou mutantes sur un duplexe c8-oxo-G/C ou G/C.

La concentration finale en Fpg pour chaque mutant est d’environ 32 nM. La notation ∅∅∅∅ correspond à un extrait brut ne surproduisant pas Fpg. Les mutants utilisés pour ce gel sont indiqués en bas de celui-ci.

WT ∅∅∅∅ E2L E2M E2D E2Q c8-oxo-G/C + - + - + - + - + - +

G/C - + - + - + - + - + -

Complexe Fpg/ADN 1/1 n°1

ADN libre

Complexe Fpg/ADN 1/1 n°2 Complexe Fpg/ADN 2/1

souche bactérienne utilisée ne surproduit aucune protéine autre que Fpg se fixant à l’ADN (sinon on verrait d’autres bandes de complexes pour l’essai qui ne surproduit pas Fpg). D’autre part, cela indique que tous nos mutants de Fpg en position 2 ont toujours la capacité de se fixer à l’ADN.

Par contre, les complexes sont formés en quantités variables selon le mutant utilisé pour une même sonde d’ADN (ex : pistes 5 et 11, Figure 43). Si on considère que nos estimations des concentrations en protéine Fpg dans nos extraits sont fiables, ce point nous indique que nos différents mutants se fixent à l’ADN avec des affinités différentes, et donc que la mutation du résidu E2 joue sur l’efficacité de fixation de Fpg à l’ADN. A ce niveau, on peut indiquer que ce sont les mutants E2Q et E2D qui semblent être les moins touchés quant à leur efficacité de fixation à l’ADN parmi tous les mutants testés de Fpg en position 2.

D’autre part, les complexes sont formés en quantités variables selon la sonde oligonucléotidique utilisée pour un même mutant (avec ou sans lésion, ex : pistes 10 et 11, Figure 43), la quantité de complexe étant toujours plus importante avec l’ADN contenant un c8-oxo-G qu’avec celui contenant un G/C. Ceci nous indique qu’aucun de nos mutants n’a perdu sa capacité à se fixer préférentiellemnt à l’ADN endommagé par rapport à l’ADN normal.

Enfin, les complexes observés présentent différentes mobilités électrophorétiques, que l’on a attribuées à deux types de complexes de stœchiométrie protéine/ADN 1/1 et un complexe de stœchiométrie protéine/ADN 2/1 (Figure 43). Dans la plupart des cas, la bande correspondant au complexe observé avec la sonde G/C migre moins que celle observée avec la sonde spécifique c8-oxo-G/C. C’est en particulier le cas de l’extrait bactérien surexprimant la Fpg de type sauvage (données non présentées). De façon surprenante, ce phénomène n’est pas observé avec les extraits bactériens surproduisant les protéines mutantes E2L et E2D. Ces bandes correspondent vraisemblablement à différentes conformations des complexes.

Cependant en l’état actuel de nos connaissances, nous n’avons pas d’explication simple pour interpréter ce phénomène.

- Analyse de l’activité ADN glycosylase des mutants de LlFpg sur des ADNs contenant une 8-oxo-G dans un contexte d’extraits cellulaires bruts

L’activité ADN glycosylase des différents mutants de LlFpg dans un contexte d’extraits bruts a été testée sur un duplexe de 24 paires de bases contenant une 8-oxo-G appariée à une cytosine (Tableau 20 du « Matériel et méthodes »). Ces manipulations ont donc eu pour but de

vérifier si nos mutants protéiques possédaient toujours la capacité d’exciser une 8-oxo-G dans l’ADN. Un exemple de ce type de manipulations sur les extraits exprimant la LlFpg de type sauvage et ses mutants en poition 2 est présenté dans la Figure 44.

Parmi les mutants de LlFpg testés pour leur activité ADN glycosylase sur la 8-oxo-G, on peut distinguer trois classes de mutants :

- (i) Ceux qui sont peu affectés (mutants M75L, S217A, T221A et R260I), pour lesquels une concentration finale en protéine de quelques nanomolaires suffit pour détecter une activité non négligeable.

- (ii) Ceux qui sont affectés de façon significative mais qui conservent une légère activité (mutant E2D, piste 4 de la Figure 44, et mutant P1G, Serre et al., 2002), pour lesquels une concentration finale en protéine de plusieurs micromolaires est nécessaire pour détecter une activité non négligeable.

- (iii) Ceux qui sont totalement dépourvus d’activité (E2N, E2R, E2T, E2L, E2M, E2Q, E5Q, M75C, E76Y, R109I, R109S, Y173F, S217Q, I219D, Y222A et R260L).

Concernant les mutants de LlFpg en position 2, seul le mutant E2D est associé à une activité résiduelle. Par contre, ce mutant est nettement plus affecté dans son activité ADN glycosylase que les mutants de LlFpg de classe (i) (données non présentées). En effet, dans nos extraits, il faut environ 14 µM de Fpg mutante E2D pour avoir environ 50% de coupure, contre 0,8 nM de LlFpg de type sauvage.

Substrat

Produit

Figure 44 : Gel dénaturant l’ADN correspondant aux tests d’activité des mutants de Fpg dans les extraits bruts sur le duplexe 8-oxo-G/C.

La concentration en Fpg pour chaque mutant est d’environ 14 µM. La notation ∅∅∅∅ correspond à un extrait brut ne surproduisant pas Fpg, soit un contrôle négatif. Les mutants utilisés sont indiqués au dessus du gel.

La piste avec l’extrait surproduisant la Fpg de type sauvage (WT) correspond à un contrôle positif.

Type d’extrait brut ∅∅∅∅ Fpg WT Fpg E2Q Fpg E2D Fpg E2M Fpg E2L Fpg E2T Fpg E2R Fpg E2N

- Récapitulatif des analyses fonctionnelles des mutants de LlFpg dans un contexte d’extraits cellulaires bruts

Finalement, les données d’activité ADN glycosylase et de fixation pour nos différents mutants de LlFpg dans un contexte d’extraits cellulaires sont récapitulées dans le Tableau 9.

LlFpg ^{P1G E2N E2R E2T E2L E2M E2D E2Q E5Q M75C M75L E76Y}

Activité ADN glycosylase

oui

(faible) non non non non non oui

(faible) non non non oui non

Fixation

à l’ADN oui oui oui oui oui oui oui oui non non oui non

LlFpg ^R109I R109S Y173F S217A S217Q I219D T221A Y222A R260I R260L WT Activité

ADN glycosylase

non non non oui non non oui non oui non oui

Fixation

à l’ADN non non non oui oui non oui oui oui non oui

On peut ainsi définir quatre classes de mutants :

- (i) Les mutants non affectés par la mutation (en rouge dans le Tableau 9).

- (ii) Les mutants P1G et E2D, qui sont affectés uniquement dans leur activité ADN glycosylase et pas dans leur fixation à l’ADN, mais qui conservent tout de même une légère activité (en orange dans le Tableau 9).

- (iii) Les mutants totalement défectueux en activité ADN glycosylase, mais toujours capables de se fixer à l’ADN (en vert dans le Tableau 9).

- (iiii) Les mutants incapables de se fixer à l’ADN, et donc totalement défectueux en activité ADN glycosylase (en bleu dans le Tableau 9).

II.1.2.2. Validation des résultats obtenus avec les extraits cellulaires bruts