Chapitre 2 : Matériels et méthodes
5. De l’échantillonnage à l’analyse
5.3. Analyse des micropolluants et des produits de dégradation
5.3.1.Une analyse ciblée des micropolluants parents
Les micropolluants ont été analysés aux laboratoires LAMA (les médicaments, pesticides et produits de
dégradation) ou Suez (les hormones) dans la fraction dissoute des échantillons (après filtration, sauf pour
les échantillons d’eau déminéralisée). Les performances des méthodes développées ont été établies en
matière de limites de quantification (LQ), comprises entre 0,02–500 ng.L
-1selon les micropolluants
(Annexe 9), de rendement de méthode, de répétabilité et de reproductibilité. Des indicateurs de
performances ont été mis en place (traceurs internes de méthodes ou dopages et suivi des rendements de
méthodes) pour se prémunir des effets matrices ou des erreurs d’analyse.
A l’arrivée dans le laboratoire, les échantillons d’eaux ont été filtrés sur filtre (fibre de verre GF/F de
porosité 0,7 μm), puis congelés (-18°C) dans des flacons de verre ambré. Les échantillons filtrés ont
ensuite été extraits sur phase solide (SPE), puis analysés par chromatographie en phase liquide couplée
au spectromètre de masse UPLC/(Q)-TOF(Waters) ou UHPLC-MS/MS. L’analyse de l’ensemble des
micropolluants excepté les hormones a été réalisée par chromatographie en phase liquide couplée au
spectromètre de masse (UPLC-MS/MS). La séparation chromatographique a été assurée par une colonne
BEH C18 de Waters (2,1x 100 mm x 1.7 μm) avec une température de four de 30°C. Des échantillons de
10μL sont ensuite injectés dans le système UPLC utilisant de l’eau avec 0.1% d’acide formique (éluant
A) et de l’acétonitrile avec 0,1% d’acide formique (éluant B) avec le gradient suivant : 95% de A et 5%
de B durant les 4 première minutes, puis diminution de la part de l’éluant A jusqu’à 80 % et augmentation
de B jusqu’à 20% pendant 2 minutes, ensuite 70% de A et 30% de B durant 5 minute, puis 60% de A et
40% de B durant les 7 minutes suivantes, ensuite B est augmenté jusqu’à 100% pendant 8 minutes et
enfin durant la dernière minute est appliquée 95% de A et 5% de B. Le débit de la phase mobile est gardé
constant au cours de l’analyse et est fixé à 0.5 mL.min
-1. Le spectromètre de masse en tandem utilisé est
un API 4000 – AB sciex. La quantification des composés est obtenue par étalonnage interne réalisée à
partir d’une droite de calibration de type quadratique contenant les composés et leurs molécules deutérées
associées pour 21 micropolluants (détails en Annexe 10).
L’analyse des 15 hormones a été réalisée par chromatographie en phase liquide couplée au spectromètre
de masse (Orbitrap, ThermoFisher). La séparation chromatographique a été assurée par une colonne BEH
C18 de Waters (2,1x 100 mm x 1,7 μm).
5.3.2.Une stratégie combinée d’analyse ciblée et non ciblée des produits de
dégradation
Dans cette thèse nous avons mis en oeuvre une stratégie innovante dite « suspected-target screening »
pour l’étude de la formation de produits de dégradation. Pour des raisons de pratiques, cette étude a été
restreinte à 11 micropolluants parents. Le choix des 11 composés se base sur un potentiel impact
toxicologique et des concentrations en sortie de traitement secondaire élevées (de l’ordre du μg.L
-1).
Au final, les micropolluants sélectionnés sont 3 pesticides (simazine, diuron, isoproturon) ; 1
antiobiotique (clarithromycine), 2 antidépresseurs (carbamazépine, diazépam) ; 1 anti-inflammatoires
(diclofénac) ; 4 bétabloquants (aténolol, métoprolol, propranolol, sotalol).
L’identification des produits de dégradation de ces composés a été menée au LAMA avec un couplage
UPLC/(Q)-TOF(Waters) car cette technologie haute résolution permet l’obtention d’une masse
moléculaire très précise (de l’ordre de 10
-4g.mol
-1) et ainsi d’identifier la présence de nouveaux
micropolluants sans disposer de leurs étalons chimiques de référence.
Deux stratégies ont été utilisées pour l’identification des produits de dégradation : une approche
qualitative non ciblée et une approche quantitative ciblée.
5.3.2.1. Approche qualitative non ciblée
Il est possible d’obtenir un « screening » d’un échantillon à partir d’une analyse par UPLC/(Q)
-TOF(Waters). Ce screening présente une quantité très importante de pics chromatographiques pour
l’identification d’un composé avec un degré de certitude plus ou moins important, nous avons mis en
« Détection de composés ciblés suspectés »
Æ Recherche des Produits de dégradation
1) Construction d’une base de données de + de 150 produits de dégradation potentiellement attendus dans le milieu
réactionnel
Basé sur des recherches bibliographiques effectuées sur 30 publications
2) Présélection de composés potentiels
Logiciel « ChromaLynx XS » : -Balayage de la base de données
-Vérification masse exacte/massifs isotopiques/précision en masse pour un produit de dégradation potentiel
-Défaut de masse (Δm) < 5%
3) Analyse de la composition élémentaire de l’ion moléculaire sélectionné
Logiciel « MassLynx Elemental Composition » : -Proposition de formules brutes
-Recherche de la structure attendue dans « Chemspider »
4) Prédiction de la fragmentation de l’ion moléculaire sélectionné
Logiciel « MassLynx Mass Fragment » -Tentative d’explication de la fragmentation
-Comparaison des ions fragments avec ceux proposés par la théorie
5) Comparaison d’un temps de rétention théorique à un temps de rétention mesuré
Modélisation à partir des temps de rétention (tr) des 11 composés parents
-tr= f(log D) , utilisé comme modèle
-Comparaison des tr relatifs théoriques et expérimentaux
6) Evaluation des données expérimentales
7) Confirmation de la molécule
Autres évidences
-Cinétique d’évolution du composé (apparition et disparition) -Contrôles–Qualité
-Possible, si le produit de dégradation est disponible -Analyses complémentaires nécessaires
Ö « Approche quantitative ciblée »