Analyse des interactions protéines – lignosulfonates par SE-HPLC

Les interactions entre les deux types de protéines du gluten, les gliadines et les gluténines, et les lignosulfonates ont été caractérisées par chromatographie d’exclusion stérique. Comme précédemment, deux extractions successives ont été effectuées : une première dans un tampon SDS 1 %, puis une seconde en présence de DTE et après sonication, pour réduire les liaisons disulfures qui stabilisent les protéines et les entraîner en solution. Comme décrit au paragraphe IV.1.8, des signaux théoriques ont été construits à partir des signaux des témoins de protéines et de lignosulfonates, et sont comparés aux signaux expérimentaux.

IV.2.5.1. Première extraction (SDS 1 %)

Les chromatogrammes du premier extrait des matériaux gliadines – NH4-LS et gluténines – NH4-LS sont présentés en annexe A-IV (pages 280 et 282), avec les rapports UV 214 / UV 280 correspondants.

Comme pour le gluten, il est intéressant de noter que le signal des protéines, gliadines comme gluténines, est nul au-delà d’un temps de rétention de 17,5 min. Dans cette zone, le signal est donc uniquement dû à la présence de lignosulfonates. Le signal expérimental est toujours inférieur au signal théorique, traduisant la liaison d’une partie des lignosulfonates aux protéines. Comme précédemment, cette portion des chromatogrammes a donc été utilisée pour quantifier la proportion de lignosulfonates liés aux protéines, selon l’équation IV.2 (paragraphe IV.1.8.2). Les résultats sont présentés dans le Tableau IV.6.

% NH

4

-LS

Gliadines Gluténines

% NH4-LS liés ^a % NH4-LS insolubles ^{b ΔGS (%)} c % NH4-LS liés ^a % NH4-LS insolubles ^{b ΔGS (%)} c 5 0,5 2,3 ± 0,1 3,2 1,1 2,9 ± 0,1 8,2 10 0,6 nd 28,0 2,4 5,4 ± 0,0 4,0 15 1,1 nd 42,1 3,0 6,0 ± 0,1 28,2 20 0,9 nd 27,8 2,8 5,9 ± 0,0 20,2

Tableau IV.6 : Résultats de l'analyse SE-HPLC des matériaux gliadines - NH4-LS et gluténines - NH4-LS

a

Calculé à partir de l’analyse SE-HPLC selon l’équation IV.2

b

Déterminé par dosage UV (paragraphe IV.2.4)

c

Calculé à partir de l’analyse SE-HPLC selon l’équation IV.5

nd : non déterminé (matériaux solubles)

La quantité de lignosulfonates liés aux gliadines est faible, puisqu’elle atteint au maximum 1,1 % en masse. Le maximum est atteint pour une teneur totale en NH4-LS de 15 %, puis semble saturer ensuite, de la même manière que pour les matériaux gluten – NH4-LS (paragraphe IV.1.8.2).

La quantité de lignosulfonates liés aux gluténines est quant à elle plus importante. Elle croît jusqu’à environ 3 % en masse, pour une quantité totale de 15 %, avant de saturer lorsque la teneur totale atteint 20 %. La quantité de NH4-LS liés est corrélée linéairement à la quantité de NH4-LS insolubles dans l’eau, déterminée par dosage UV au paragraphe IV.2.4, comme on peut le voir sur la Figure IV.23. Néanmoins, la quantité de lignosulfonates liés est systématiquement inférieure à la quantité de lignosulfonates insolubles, ce qui confirme le rôle des interactions hydrogène et hydrophobes pour insolubiliser une partie des lignosulfonates.

Figure IV.23 : Corrélation entre la quantité de NH4-LS liés déterminée par SE-HPLC et la quantité de NH4-LS insolubles dans l'eau déterminée par dosage UV (paragraphe IV.2.4) pour les matériaux gluténines - NH4-LS

Il apparaît donc que les lignosulfonates peuvent former des liaisons aussi bien avec les gliadines qu’avec les gluténines. Mais la quantité de liaisons formées est presque trois fois supérieure avec les gluténines. La quantité de liaisons formées avec le gluten, déterminée au paragraphe IV.1.8.2, était intermédiaire, ce qui semble logique puisque le gluten est constitué d’un mélange de gluténines et de gliadines.

Pour les temps de rétention inférieurs à 17,5 min, les signaux expérimentaux des matériaux gliadines – NH4-LS et gluténines – NH4-LS sont supérieurs aux signaux théoriques, traduisant une hausse de la quantité de protéines solubilisées. Comme précédemment, la variation de solubilité des protéines dans le premier extrait, ΔGS, a été calculée pour chacun des échantillons, selon le calcul décrit au paragraphe IV.1.8.2 (équation IV.5). Les résultats sont consignés dans le Tableau IV.6.

Dans tous les cas, l’introduction de lignosulfonates implique une hausse de la quantité de protéines solubles dans le premier extrait, c’est-à-dire une limitation de la réticulation des matériaux par liaisons disulfures intermoléculaires. Pour les gliadines, la hausse est particulièrement brutale entre 5 et 10 % de NH4-LS, tandis que pour les gluténines, elle est aussi importante mais pour une quantité de NH4-LS plus grande, comprise entre 10 et 15 %.

Il ressort donc de l’analyse SE-HPLC que les lignosulfonates perturbent la réticulation des protéines. Mais la quantité nécessaire pour limiter la réticulation des gliadines est nettement plus faible que celle requise pour perturber la polymérisation des gluténines.

IV.2.5.2. Seconde extraction (SDS 1 % + DTE + sonication)

Les matériaux ont ensuite été soumis à une seconde extraction, en présence d’un réducteur de ponts disulfures, le DTE, et d’ultrasons, pour permettre de rompre les liaisons disulfures intermoléculaires qui stabilisent les protéines, et ainsi les solubiliser. Les chromatogrammes du second extrait des matériaux gliadines – NH4-LS et gluténines – NH4-LS sont disponibles en annexe A-IV (pages 281 et 283).

Pour les matériaux préparés à partir de gliadines, le profil du chromatogramme du matériau contenant 5 % de NH4-LS est tout à fait conforme au signal théorique. En revanche, quand la teneur en NH4-LS atteint puis dépasse 10 %, le signal du second extrait diminue drastiquement. Cette seconde extraction confirme donc que l’ajout de 10 % de lignosulfonates permet de limiter la

réticulation des gliadines, au point que la quasi-intégralité des matériaux devient soluble dans le premier extrait.

Pour ces matériaux, les rapports UV 214 / UV 280 expérimentaux sont nettement inférieurs aux rapports théoriques, et tendent progressivement vers le rapport propre aux lignosulfonates. Des lignosulfonates sont donc présents dans ce second extrait, ce qui implique la formation de liaisons covalentes avec les gliadines. Celles-ci apparaissent avoir deux conséquences : d’une part la limitation de la réticulation des gliadines, et d’autre part l’insolubilisation d’une partie des lignosulfonates dans le premier extrait.

Pour les matériaux gluténines, les signaux expérimentaux sont tous légèrement supérieurs aux signaux théoriques, particulièrement pour des temps de rétention inférieurs à 15 min. Les rapports UV 214 / UV 280 tendent également vers le rapport propre aux lignosulfonates. Les lignosulfonates qui se sont liés aux gluténines, entrainant la baisse de signal du premier extrait, se retrouvent donc dans le second extrait, solubilisés avec les gluténines grâce à l’action du DTE et de la sonication. Aucun signal n’est détecté pour des temps de rétention supérieurs à 17,5 min, zone dans laquelle sont pourtant attendus majoritairement les lignosulfonates, ce qui signifie qu’ils sont toujours liés aux gluténines, et confirme la nature covalente des liaisons.

La Figure IV.24 récapitule l’évolution des aires théoriques et expérimentales des chromatogrammes des deux extraits, selon la teneur en NH4-LS. Pour les matériaux préparés à partir de gliadines, l’ajout de 10 % de NH4-LS rend toute réticulation impossible, et la totalité du matériau est alors soluble dès la première extraction. Pour les matériaux gluténines, l’ajout de NH4-LS entraîne une hausse de la quantité soluble dans le premier extrait, essentiellement car les lignosulfonates y sont solubles. Néanmoins, cette hausse est moins importante qu’attendu, en raison de l’insolubilisation d’une partie des lignosulfonates, qui se lient de manière covalente aux gluténines, et ne sont finalement solubilisés que lors de la seconde extraction.

Figure IV.24 : Aires des chromatogrammes expérimentaux et théoriques du 1^er et du 2^nd extrait des matériaux gliadines – NH4-LS (a) et gluténines – NH4-LS (b) selon la teneur en NH4-LS, en pourcentage de l’aire totale

IV.2.6. Conclusions sur les matériaux gliadines – lignosulfonates et gluténines –

Dans le document Contribution à l'étude du gluten comme matériau : apport de lignines de différentes natures. (Page 173-176)