Analyse des interactions gluten – lignine Kraft par SE-HPLC

Les matériaux gluten – lignine Kraft ont donc été analysés par SE-HPLC, dans le but de détecter l’éventuelle formation de liaisons chimiques entre le gluten et la lignine Kraft, et pour déterminer l’influence de la lignine Kraft sur le mécanisme d’agrégation des protéines. Comme précédemment les matériaux ont été soumis à deux extractions successives : une première dans un tampon contenant 1 % de SDS, et une seconde dans le même tampon contenant en plus un réducteur de ponts disulfures, le DTE, et avec l’apport de la sonication.

V.1.8.1. Comparaison des témoins de lignine Kraft et de gluten

Comme précédemment, deux détections, à 214 et 280 nm, ont été utilisées. Le gluten comme la lignine Kraft absorbent simultanément aux deux longueurs d’ondes, ce qui empêche de les différencier facilement (Figure V.15a et b). Néanmoins, comme les lignosulfonates, la lignine Kraft possède un rapport des intensités UV 214 / UV 280 constant (environ égal à 3), et bien distinct de celui du gluten (Figure V.15c). Ce rapport sera donc utilisé pour acquérir des informations sur la nature des espèces en présence, et les chromatogrammes mesurés à 214 nm seront utilisés pour quantifier les aires.

Le signal des témoins de lignine Kraft est beaucoup moins dispersé que ne l’était celui des lignosulfonates, puisqu’il est compris entre des temps de rétention de 16 à 18 min. Cette zone recouvre le signal du pic F5 du gluten. Le signal du second extrait des témoins de lignine Kraft, en traits pointillés sur la Figure V.15, est faible : l’aire des chromatogrammes du premier extrait représente en moyenne 92,2 ± 0,9 % de l’aire totale. Dans le second extrait, la sonication aide à solubiliser une partie de la lignine initialement insoluble dans le tampon, ce qui explique que le signal du second extrait ne soit pas parfaitement nul.

Figure V.15 : Chromatogrammes du premier (—) et du second extrait (---) du gluten plastifié par 35 % de glycérol et de la lignine Kraft : mesuré en UV à 214 nm (a), à 280 nm (b), et rapports UV 214 / UV 280 (c)

Comme précédemment, des signaux théoriques ont été construits, en ne supposant aucune interaction entre les deux composés. La comparaison des signaux expérimentaux et théoriques permet alors d’évaluer l’existence d’interactions entre la lignine Kraft et le gluten, et de déterminer l’influence de la lignine Kraft sur la réticulation du gluten.

V.1.8.2. Première extraction (tampon SDS 1 %)

Les chromatogrammes du premier extrait des matériaux gluten – lignine Kraft sont présentés sur la Figure V.16. Le signal de la lignine Kraft est superposé à celui du gluten, si bien qu’aucune zone des chromatogrammes ne permet d’évaluer seulement la contribution de la lignine. Ainsi, la quantification de la lignine liée par une méthode similaire à celle développée pour les lignosulfonates (paragraphe IV.1.8) est impossible ici.

De plus, le signal dans cette zone (t > 16 min) apparaît peu reproductible (annexe A-V, page 284). Le système chromatographique utilisé est en effet mal adapté à la caractérisation de la lignine Kraft. En revanche, pour des temps de rétention inférieurs à 16 min, le signal dépend uniquement de la contribution des protéines, et la reproductibilité sur trois essais distincts est excellente. Nous nous contenterons donc ici de discuter de l’influence de la lignine Kraft sur les chromatogrammes pour des temps de rétention inférieurs à 16 min.

Afin de déterminer l’influence de la lignine Kraft sur la réticulation des protéines, les aires des chromatogrammes expérimentaux pour t < 16 min ont donc été mesurées. Les valeurs sont reportées dans le Tableau V.3, en pourcentage de l’aire théorique.

Figure V.16 : Chromatogrammes du premier extrait (SDS 1 %) des matériaux préparés à partir de gluten contenant 0 à 20 % de KL : signaux expérimentaux (—), signaux théoriques (---) et contribution de la lignine Kraft au signal théorique

L’aire expérimentale est dans cette zone systématiquement supérieure à l’aire théorique, comme on peut le constater sur l’agrandissement de la Figure V.16a. Les rapports UV 214 / UV 280 expérimentaux, qui renseignent sur la nature des espèces en présence, sont toujours inférieurs aux rapports théoriques. Ceci ne peut s’expliquer que par la présence de lignine Kraft liée au gluten dans cette zone.

% KL A

(% A

)

Tableau V.3 : Aires des chromatogrammes expérimentaux pour t < 16 min, en pourcentage de l'aire théorique, selon la teneur en KL des matériaux (premier extrait)

Ainsi la hausse de l’aire expérimentale des chromatogrammes peut être attribuée à la présence de lignine Kraft liée au gluten. Il n’est cependant pas impossible que la quantité de gluten solubilisé dans ce premier extrait ait varié, mais il est impossible de le déterminer par cette méthode. Il n’est donc pas possible de conclure quant à l’influence de la lignine Kraft sur la réticulation du gluten.

Une seconde extraction a ensuite été pratiquée, après réduction des liaisons disulfures, afin de chercher à évaluer si la lignine Kraft favorise ou inhibe la réticulation du gluten.

V.1.8.3. Seconde extraction (tampon SDS 1 % + DTE + sonication)

Les chromatogrammes du second extrait des matériaux sont présentés sur la Figure V.17, avec les rapports UV 214 / UV 280 correspondants. Contrairement aux lignosulfonates, qui étaient intégralement solubles dans le premier extrait, une partie de la lignine Kraft ne peut être solubilisée qu’après sonication. Cette part de lignine Kraft insoluble dans le premier extrait contribue donc au signal mesuré dans le second extrait, pour des temps de rétention compris entre 16 et 18 min. Comme évoqué pour le signal du premier extrait, les chromatogrammes seront commentés uniquement pour les temps de rétention inférieurs à 16 min. Dans cette zone, seul le signal des protéines est attendu, ce qui explique que les rapports UV 214 / UV 280 théoriques, représentés en traits pointillés sur la Figure V.17b, soient tous égaux au rapport du matériau ne contenant pas de lignine Kraft.

Comme pour le premier extrait, les aires expérimentales ont été quantifiées, et sont exprimées dans le Tableau V.4 en pourcentage de l’aire théorique. Il apparaît clairement, comme on peut le voir sur la Figure V.17a, que les aires expérimentales sont nettement supérieures aux aires théoriques. Ici encore, les rapports UV 214 / UV 280 tendent vers le rapport propre à la lignine Kraft, représenté par une ligne pointillée noire sur la Figure V.17b.

Figure V.17 : Chromatogrammes du second extrait (SDS 1 % + DTE + sonication) des matériaux préparés à partir de gluten contenant 0 à 20 % de KL : signaux expérimentaux (—) et théoriques (---) mesurés à 214 nm (a) et rapports UV 214 / UV