EMERGENCE DES BACTÉRIES MULTIRÉSISTANTES
2. Bactériostase et bactéricidie
2.2. Étude de la bactériostase
La CMI peut être déterminée par différentes méthodes selon des recommandations américaines (Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI]) ou européennes (European Committee on Antimicrobial Susceptiblity Testing [EUCAST]). À noter qu'il y a à l'heure actuelle une harmonisation entre les recommandations françaises du CASFM et de celles de l'EUCAST.
2.2.1. Détermination de la concentration minimale inhibitrice par dilution en milieu liquide
La CMI peut être déterminée par macrodilution (en tubes, avec un volume final 1 ml [souvent 2 ml]) ou par microdilution (en microplaques de 96 puits, avec un volume final de 100 litres) en milieu liquide. Cette dernière technique constitue la méthode de référence internationale (norme ISO 20776-1) pour les bactéries aérobies non exigeantes.
8
Une série de tubes ou de puits est ensemencée avec 5 à 105 UFC/ml de la bactérie à étudier en bouillon Mueller-Hinton (MH) à teneur ajustée en ions Ca2+ (25 à 50 mg/l) et Mg2+ (12,5 à 25 mg/l). Ensuite, des quantités croissantes d'antibiotiques sont ajoutées de façon à réaliser une gamme de concentrations en progression géométrique de raison 2. Un tube sans antibiotique servira de témoin. Après 16 à 24 heures d'incubation en aérobiose à environ 35 °C, la CMI correspond à la concentration d'antibiotique présente dans le premier tube ou puits où il n'y a pas de culture visible.
À noter que pour les bactéries exigeantes (par exemple Streptococcus spp.,
Haemophilus spp., Campylobacter spp., Corynebacterium spp.), le
CASFM/EUCAST recommande la méthode de microdilution en bouillon MH-F. Ce milieu MH est enrichi avec 5 % de sang de cheval lysé et 20 mg/l de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).
Alors que la méthode de macrodilution est peu employée en routine du fait de sa lourdeur, celle de microdilution est très utilisée car très pratique et automatisable.
2.2.2. Détermination de la concentration minimale inhibitrice par dilution en milieu gélosé
Le principe est identique à celui de la dilution en milieu liquide, mais cette fois-ci l'antibiotique est incorporé dans la gélose MH ou MH-F. Ainsi, chaque boîte de Pétri correspond à une concentration donnée d'antibiotique. Il est possible de tester ainsi sur plusieurs souches déposées sous forme de spot sur la même série de boîtes avec un inoculum de 104 UFC/spot (Figure 2) La CMI correspond alors à la concentration d'antibiotique présente dans la première boîte où la culture bactérienne n'est pas visible après une incubation de 16 à 24 heures en aérobiose à environ 35 °C.
9
Figure 2: Détermination de la CMI en milieu solide par dilution en gélose [3]
Alors que cette méthode est bien standardisée et fiable, elle nécessite un temps et une main-d'œuvre importants, notamment pour la préparation des boîtes.
2.2.3. Détermination de la concentration minimale inhibitrice par diffusion en milieu gélosé
Une autre approche est d'utiliser des bandelettes de plastique imprégnées d'un gradient prédéfini de concentrations croissantes d'antibiotique. C'est le principe utilisé dans les méthodes commercialisées E-tests® (bioMérieux) et MICE Tests® (Oxoid) (Figure 3).
Ces bandelettes sont appliquées directement à la surface d'une gélose inoculée avec la bactérie (selon les recommandations du fabricant, généralement avec une suspension de 0,5 McFarland). Le gradient préformé exponentiel d'antibiotique est immédiatement transféré sur la gélose (quelques secondes). Après incubation de 16 à 24 heures à environ 35 °C, une zone d'inhibition ellipsoïdale symétrique centrée le long de la bandelette se forme (Figure 3).
La CMI des antibiotiques bactéricides correspond à la concentration d'antibiotique lisible au point où l'ellipse croise la bandelette (100 % d'inhibition). Pour les antibiotiques bactériostatiques, une zone de traîne se forme au niveau de l'ellipse. La lecture de la CMI correspond à 80 % d'inhibition, avec prise en compte des macrocolonies (les microcolonies sont occultées).
10
Cette technique est facile à réaliser en routine et permet d'obtenir des CMI avec une bonne concordance avec les CMI réalisées par dilution en milieu gélosé, pour la plupart des espèces bactériennes et des antibiotiques. Elle est très utilisée en routine, notamment pour l'étude de la sensibilité de S. pneumoniae aux bêta-lactamines, et est utilisable pour certaines bactéries à croissance difficile (par exemple anaérobies, Helicobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae). Un des inconvénients principaux est son coût.
Figure 3: Détermination de la CMI en milieu solide par diffusion en gélose (technique E-Test) [3]
11 2.3. Étude de la bactéricidie
2.3.1. Détermination de la concentration minimale bactéricide en milieu liquide
Dans un premier temps, une gamme de concentrations d'antibiotique est réalisée comme pour la détermination de la CMI. Le même jour, une numération de l'inoculum de départ est effectuée en réalisant 4 dilutions successives de 10 en 10 qui seront chacune ensemencées en strie à l'aide d'une anse calibrée sur une gélose MH. Cette gélose est incubée 16 à 24 heures à environ 35 °C, puis les colonies seront dénombrées et le nombre d'unités formant colonie (UFC) à la dilution au 1/10 000e correspondra à 0,01 % de l'inoculum de départ (ou à la dilution au 1/1000e soit 0,1 % chez les Anglo-Saxons). Après 16 à 24 heures à environ 35 °C, tous les tubes qui ont une concentration d'antibiotique supérieure ou égale à la CMI seront repiqués sur gélose MH en stries à l'aide d'une anse calibrée (même volume que pour la numération de l'inoculum de départ). Après 16 à 24 heures à environ 35 °C, les colonies présentes sur chaque strie sont comptées, cette numération étant comparée à la numération de l'inoculum de départ (Figure 4).
12
La CMB est la plus faible concentration d'antibiotique pour laquelle le nombre de colonies bactériennes est inférieur ou égal au nombre de colonies présentes sur la dilution de l'inoculum de départ au 1/10 000e (c'est-à-dire ≤ 0,01 % de l'inoculum de départ) ou au 1/1000e (soit ≤ 0,1 % de l'inoculum de départ) chez les Anglo-Saxons.
À noter que la détermination de la CMB peut aussi être réalisée en microplaques 96 puits.
2.3.2. Cinétique de bactéricidie
La détermination de la vitesse de bactéricidie (time kill curves des Anglo-Saxons) peut être étudiée. Elle consiste à suivre avec repiquages à intervalles réguliers (par exemple 0, 3, 6, 12 et 24 heures) les bactéries survivantes. De fait de sa lourdeur, elle n'est pratiquement jamais utilisée en routine.
3. Antibiogramme
La détermination des CMI en méthode manuelle est fastidieuse à réaliser, et l'étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques en routine est effectuée grâce à la technique de l'antibiogramme.