État des connaissances sur les tests biologiques de CHC

2.3.1. L’Alpha-foetoprotéine (AFP)

L’AFP est le biomarqueur le plus largement utilisé pour le dépistage du CHC. Des taux élevés persistants d’AFP constituent un facteur de risque pour le développement du CHC et peuvent être utilisés pour aider à définir les populations à risque (Tsukuma, Hiyama et al. 1993). Cependant, le taux d’AFP est également élevé en cas d'insuffisance hépatique chronique, en particulier chez les patients ayant une élévation significative des transaminases, ainsi que chez

certains patients atteints de tumeurs malignes non liées au CHC, telles qu'un cholangiocarcinome, un cancer des testicules ou des ovaires.

De multiples études de l’AFP ont été réalisées. L’étude de Marrero et al. a montré que l’AFP à un seuil de 10,9 ng/ml avait une sensibilité de 66% et une spécificité de 81%, pour le diagnostic du CHC au stade précoce (Marrero, Feng et al. 2009).

Une autre étude avait suggéré que la valeur limite supérieure à retenir était de 20 ng/ml. Ce seuil a une sensibilité d'environ 60% et une spécificité d'environ 90% (Gupta, Bent et al. 2003). Des données plus récentes suggèrent que le changement des taux d’AFP suivis dans le temps a pu augmenter la sensibilité et la spécificité par rapport à un taux d’AFP à un seuil unique de 20 ng/ml (Tayob, Lok et al. 2016).

Dans une étude de Lin et al, une valeur seuil de 20 ng / mL de l’AFP chez des patients cirrhotiques a montré une sensibilité de 41 à 65% et une spécificité de 80 à 94% pour le CHC, et ce quel que soit le stade.(Lin, Keeffe et al. 2004).

Cependant, seules 10 à 20% des tumeurs sont associées à des concentrations sériques d’AFP anormales à un stade précoce. En tant que test diagnostic, l'AFP supérieure à 20 ng /ml a une bonne sensibilité mais une faible spécificité, tandis que des seuils plus élevés de 200 ng /ml, ont une faible sensibilité de 22% et une spécificité élevée. Ces informations ont été principalement obtenues chez des patients atteints d’hépatite active, ce qui peut constituer un facteur confondant. Chez les patients traités par antiviraux, la précision diagnostique de l’AFP a augmenté ainsi considérablement en raison de la réduction du nombre de faux positifs (Trevisani, D'Intino et al. 2001, Yamashita, Forgues et al. 2008, Hoshida, Nijman et al. 2009, Villanueva, Minguez et al. 2010, Shim, Kim et al. 2014, Wong, Chan et al. 2014, Kim, Seock

et al. 2015, Yang, Kim et al. 2015, Nishikawa, Nishijima et al. 2016).

La sensibilité et la spécificité de l’AFP seule sont insuffisantes pour la détection précoce du CHC. Il y a cependant une amélioration lors d’une combinaison AFP – échographie (Tzartzeva, Obi et al. 2018). Les recommandations de surveillance divergent entre les guidelines européennes et nord-américaines.

2.3.2. L’AFP-L3

L’AFP-L3 est une fraction de l’alpha-foetoproteine. Elle a également été utilisée comme marqueur de risque du CHC. Elle se révèle plus spécifique bien que généralement moins sensible que l’AFP pour détecter le CHC (Leerapun, Suravarapu et al. 2007, Marrero, Feng et

al. 2009). Une étude réalisée sur des patients atteints de CHC a montré que l'incidence du CHC

était significativement plus élevée chez les patients présentant des concentrations élevées d'AFP-L3 par rapport à ceux présentant des concentrations élevées d'AFP (Sterling, Jeffers et

al. 2007).

2.3.3. Des-gamma-carboxy-prothrombine (DCP)

La des-gamma-carboxy-prothrombine sérique est également connue sous le nom de prothrombine induite par l’absence de vitamine K/ antagoniste II (PIVKA-II). Elle est induite par l'absence de vitamine K. Sa valeur pour le diagnostic du CHC a été confirmée dans une série d'essais cliniques.

Il a été recommandé d’ajouter la DCP au panel de routine des marqueurs tumoraux du CHC à l’issue d’une étude ayant pour objectif d’évaluer l’apport clinique du DCP dans le diagnostic du CHC par comparaison avec l’AFP, un marqueur tumoral utilisé couramment. Il a ainsi été montré que la DCP avait une meilleure sensibilité clinique que l'AFP et que la différence était statistiquement significative. La DCP avait la meilleure sensibilité (96,9%) pour distinguer le groupe CHC du groupe témoin lorsque la valeur seuil utilisée était de 60 mAU / ml (Svobodova, Karlikova et al. 2018).

Une méta-analyse a récemment montré que la sensibilité, la spécificité, les odds ratio diagnostiques de la DCP étaient de 0,71 (IC 95% : 0,59-0,80), 0,93 (IC 95% : 0,87-0,96), et 30 (IC 95% : 13-72), respectivement. Il a été conclu que la DCP était un marqueur idéal à prendre en compte pour la détection du CHC chez les patients ayant une hépatite chronique B (Chen, Wu et al. 2018). La DCP a été largement utilisée comme marqueur alternatif de l'AFP au Japon. Cependant, la valeur diagnostique de la DCP peut varier en fonction des patients.

La DCP a permis un diagnostic de CHC plus précis que l'AFP, en particulier aux stades précoces. La combinaison des deux marqueurs n’a cependant pas permis d’améliorer la précision du diagnostic de CHC à un stade précoce. (Li, Zhang et al. 2014). L’étude de Marrero

et al. a montré que l'étiologie de la maladie du foie affecte de manière significative la

performance de la DCP mais pas celle de l'AFP, pour le diagnostic de CHC à un stade précoce. La sensibilité de la DCP pour le diagnostic de CHC à un stade précoce chez les patients ayant une étiologie virale est de 79%, alors que la combinaison AFP - DCP n'était pas meilleure que chacun des marqueurs pris individuellement. Pour une étiologie non virale, la DCP était supérieure aux autres marqueurs dont la combinaison avec l’AFP n’améliorait que peu la performance de cette dernière. La DCP semblait plus performante chez les patients avec une

étiologie virale tandis que la combinaison AFP-DCP n’améliorait pas la performance globale (Marrero, Feng et al. 2009).

2.3.4. Les glycans

La glycobiologie a joué un rôle déterminant dans divers domaines de la biologie et de la médecine et a contribué au décryptage de plusieurs maladies humaines. La glycosylation est une modification post-traductionnelle qui a lieu dans le réticulum endoplasmique, caractérisé par l'addition des glycanes aux protéines ou aux lipides. Les glycanes sont des polysaccharides constitués de plusieurs oses (ou monosaccharides) liés entre eux par des liaisons osidiques. On distingue deux catégories de glycanes: les homoglycanes constitués du même monosaccharide et les hétéroglycanes formés de différents monosaccharides. (Lauc, Pezer et al. 2016). Les altérations de la glycosylation des protéines membranaires ainsi que les protéines sécrétées sont directement associées à la transformation maligne et à la progression des cancers.

En fait, les glycanes sont impliqués dans différents processus moléculaires et cellulaires intervenant dans le cancer, tels que la signalisation et la communication cellulaire, la dissociation et l'invasion de cellules tumorales, les interactions cellule-matrice, l'angiogenèse tumorale, la modulation de l'immunité, la formation et la migration de métastases. Les glycanes ont donc d'importantes applications potentielles pour améliorer le diagnostic précoce et la stratification du risque. Ils peuvent servir de marqueurs et de cibles thérapeutiques spécifiques (Meany and Chan 2011, Pinho and Reis 2015).

Les altérations de la glycosylation des protéines sériques sont fortement associées à la progression de la maladie du foie (de Oliveira, Ornelas Ricart et al. 2017). En particulier des protéines corefucosylés pourraient aider à distinguer le CHC de la cirrhose. C’est le cas de l’AFP-L3, une glycoforme de l’AFP caractérisé par la présence d’un résidu supplémentaire d’alpha1-6 fucose fixé à l’extrémité réductrice de la N-acétylglucosamine par deux types de glycosyltransférase: la N-acétylglucosaminyltransférase III et la fucosyltransférase VIII. (Nakagawa, Miyoshi et al. 2008, Lee, Cha et al. 2014). Les valeurs sériques élevées de l’AFP-L3 sont liés à un potentiel malin plus élevé du CHC, à un temps de doublement plus court du volume de la tumeur et à une augmentation de l'angiogenèse tumorale. Les valeurs de AFP-L3 sont également corrélées aux caractéristiques pathologiques du CHC, telles que le modèle de croissance tumorale infiltrante, l'infiltration de la capsule et l'invasion vasculaire (Tada, Kumada et al. 2005).

Des études récentes ont montré que, chez les patients ayant une cirrhose, des changements dans le profil de glycosylation de certaines protéines peuvent être utilisés comme marqueurs

ultra-précoces du CHC. (Zhu, Lin et al. 2014, Yin, Tan et al. 2015, Zhu, Warner et al. 2018). Une altération de l'état de glycosylation des protéines peut aussi être observé en cas d’ hépatites virales B ou C. Une étude a montré que chez les patients atteints d’hépatite chronique B, les lectines Hippeastrum hybrid, Griffonia simplicifolia II et Euonymus europaeus sont significativement augmentés, au contraire les lectines Lens culinaris agglutinin, Vicia villosa et Amaranthus Caudatus sont significativement diminuées. Chez les patients ayant une hépatite chronique C, deux lectines: Wheat germ agglutinin et Sambucus nigra, sont significativement augmentés (Qin, 2017 #70}.

2.3.5. Apolipoprotéine A1 (apoA1)

L’ApoA-I, un composant majeur des lipoprotéinesdehaute densité, est synthétisée à part égale par le foie et l'intestin. Plusieurs études ont montré que L’ApoA1 augmente avec la consommation d’alcool tant qu’il n’y a pas de fibrose ≥ F2 (Malmendier, Mailier et al. 1983, Poynard, Abella et al. 1986, Bedossa, Poynard et al. 1989, Poynard, Bedossa et al. 1995, Mathurin, Vidaud et al. 1996, Paradis, Laurent et al. 1996, Paradis, Mathurin et al. 1996). Un index biologique simple pour la détection de la maladie alcoolique du foie chez les buveurs a combiné un test spécifique de maladie hépatique sévère (temps de prothrombine), un test sensible d’une maladie hépatique alcoolique (gamma-glutamyl transpeptidase sérique) et un test de fibrose hépatique (ApoA1 sérique)(Poynard, Aubert et al. 1991).

L’ApoA1 diminue avec la fibrose à partir de F2(Imbert-Bismut, Ratziu et al. 2001).L’ApoA1 est plus basse chez les volontaires sains qui ont une augmentation de transaminases après paracetamol à dose modérée. Elle est plus élevée et associée à une normalisation plus rapide des transaminases chez les sujets ayant une hépatite médicameuteuse (Peta, Tse et al. 2017).

L’ApoA1 est plus basse 10 ans avant la survenue d’un cancer du foie (Peta, Ziol et al. 2019, Poynard, Peta et al. 2019). Une diminution de l’ApoA1 sérique a été associée à la survenue de plusieurs cancers, dont le CHC et le cholangiocarcinome. Une méta-analyse qui porte sur 14 études de cohorte avec 9295 patients inclus, a permis de conclure qu’une faible concentration d’ApoA1 pourrait constituer un facteur pronostique défavorable en cas tumeurs malignes et servir de marqueur non invasif, chez des patients atteints de cancer (Zhang and Yang 2018). L’étude de Nderitu incluant 509.436 patients a permis de montrer que des concentrations d’ApoA1 <1.25 g/l étaient associés a un risque accru de CHC (HR =1.78 ;1.31-2.41) (Nderitu, Bosco et al. 2017). Les études ne prenant pas en compte la consommation d’alcool et la sévérité de la fibrose hépatique ne permettent pas d’estimer une éventuelle relation entre ApoA1 et CHC indépendante de ces 2 facteurs dont on sait depuis 30 ans qu’ils influencent

l’APoA1 (Malmendier, Mailier et al. 1983, Poynard, Abella et al. 1986, Bedossa, Poynard et

al. 1989, Poynard, Bedossa et al. 1995, Mathurin, Vidaud et al. 1996, Paradis, Laurent et al.

1996, Paradis, Mathurin et al. 1996).

Principalement exprimée dans les cellules du foie et de l’intestin, l’apoA1, est un composant majeur des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans le sérum. Tandis que la diminution de l’ApoA1 est associée à la sévérité de la fibrose, l’ApoA1 pourrait avoir des actions anti-tumorales. Elle inhibe l’activation des neutrophiles et l'expression des molécules d'adhésion par les cellules endothéliale. Elle diminue également l’activation par contact des monocytes par les lymphocytes T en inhibant la production d'interleukine-1 et le tumor necrosis factor (TNF).

L’ApoA-1 (ou des peptides mimétiques) pourrait inhiber la formation de la vascularisation tumorale (Gao, Gu et al. 2012), induire un micro-environnement prévenant la progression tumorale (Zamanian-Daryoush, Lindner et al. 2013) et potentiellement servir d’agent thérapeutique (Yeh, Cheng et al. 2016).

Sans surprise pour les hépatologues travaillant sur les marqueurs de fibrose, des valeurs basses d’ApoA-1 ont été constatées chez des patients ayant un CHC (Mustafa, Petersen et al. 2013, Ma, Gao et al. 2016);Ma, 2016 #121} incluant ou pas des thromboses portales (Xu, Wei et al. 2011). Ces travaux méconnaissent néanmoins le rôle de la sévérité de la fibrose et de la consommation d’alcool comme facteurs de confusion.

2.3.6. Haptoglobine

L'haptoglobine est une protéine produite par le foie. Son rôle est de lier l'hémoglobine libre dans le sang. Il se forme alors un complexe qui est rapidement éliminé de la circulation par le foie avec destruction et recyclage, notamment du fer provenant de l'hémoglobine.

Haptoglobine non fucosylée

Comme l’ApoA1, l’haptoglobine sérique dans sa forme majoritaire non-fucosylée est une protéine avec des performances diagnostiques et pronostiques chez les sujets ayant une maladie chronique du foie que ce soit pour estimer la sévérité de la fibrose hépatique, ou détecter de façon précoce, le carcinome hépatocellulaire.

L'haptoglobine est un des composants du FibroTest, de l’ActiTest, du DILI-test et des nouveaux marqueurs de détection précoce du CHC, LCR1 et LCR2 (Poynard, Peta et al. 2019).

L'haptoglobine est impliquée dans des processus critiques des cellules cancéreuses, tels que la signalisation cellulaire, la différenciation et l'invasion cellulaire, les interactions ligand-récepteur et la formation de métastases.

Haptoglobine fucosylée

L'haptoglobine fucosylée est impliquée dans les glycosylations aberrantes qui accompagnent le développement du CHC (Clerc, Reiding et al. 2016). Dans une étude de Shang et al, les taux sériques d’haptoglobine fucosylée étaient significativement augmentés chez les patients avec CHC, indiquant son utilité potentielle en tant que biomarqueur prédictif du CHC. Cette étude a démontré que la performance du rapport haptoglobine/haptoglobine fucosylée pour prédire le CHC (AUC = 0,845) étaiet supérieurs à celle de l'haptoglobine fucosylée seule. Ainsi, le rapport haptoglobine/haptoglobine fucosylée pourrait constituer un glyco-biomarqueur potentiel pour le dépistage de CHC, même avec un faible taux d’AFP. De plus, la combinaison de l’AFP avec l'haptoglobine fucosylée pourrait améliorer la sensibilité et la spécificité du diagnostic de CHC (Shang, Sun et al. 2016, Shang, Li et al. 2017).

Une étude d’analyse quantitative automatisée à l'aide du logiciel Byologic a montré que les glycopeptides biantennaires étaient les plus abondants sur chacun des sites N184, N207 et N241 de l’haptoglobine, tandis que les glycopeptides triantennaires étaient moyennement abondants, avec une contribution totale de 10 à 28%. Bien que les glycopeptides tétraantennaires aient une faible contribution (<5% sur chacun des sites), ils ont été trouvés particulièrement augmentés chez les patients atteints de CHC précoce et de cirrhose par rapport au contrôles sains. En outre, cinq N-glycopeptides spécifiques aux sites N184 et N241 étaient significativement augmentés en début de CHC par rapport à la cirrhose sans CHC (p <0,05). Dans le cas des cirrhoses sans CHC, les cinq glycopeptides étaient N-glycanes-sialylés, tri ou antennaires et sans aucun fucose ou avec deux fucoses présents. L'augmentation des tétra-antennes glycoformes avec hyper-fucosylation (jusqu'à 5 fucoses) a été observée chez une partie des patients avec CHC mais n'avaient pas de valeur diagnostique pour distinguer de manière significative le CHC précoce de la cirrhose (Zhu, Chen et al. 2019). L’étude de Zhang

et al. a montré que les différents types de fucosylation : le biantennal monofucosylé,

monofucosylé tétraantennal glycanes, et triantennaires bifucosylés permettaient une discrimination significative entre CHC et cirrhose sans CHC (p< 0,05) (Zhang, Zhu et al. 2015).

La même étude a utilité la méthode ESI-LC-MS de détection dans le sérum des glycanes fucosylés d'haptoglobine, permettant une sensibilité accrue. Ceci implique l'isolement de

l'haptoglobine à l'aide d'une colonne d'affinité basée sur HPLC, suivie de l'élimination du glycane, extraction et désialylation. Les glycanes fucosylés sont ensuite dérivés par la méladrazine, ce qui améliore considérablement leur détection dans l’ionisation par électrospray. La séparation des glycanes dans une colonne HILIC montre que huit glycanes d'haptoglobine peuvent être détectés en utilisant moins de 1 µL de sérum, avec une excellente reproductibilité et quantification. Le rapport entre les pics fucosylés et leurs formes non fucosylées correspondantes montre que les glycanes fucosylés sont régulés positivement dans le cas d'échantillons provenant des patients avec CHC par rapport à ceux de cirrhose. La forme tétra-antennaire bifucosylée en faible abondance peut être détectée et peut être particulièrement un bon marqueur pour le CHC (Zhang, Zhu et al. 2015).

Une autre étude a décrit les méthodes non basées sur la spectrométrie de masse utilisées pour découvrir les marqueurs de CHC, y compris immuno-essais, électrophorèse capillaire, électrophorèse sur gel 2D et dosages de lectine-ELISA. Le rôle clé de l'extraction des lectines est également décrit, divers glycopeptides core fucosylés et hyperfucosylés étant identifiées en tant que marqueurs potentiels du CHC (Zhu, Warner et al. 2018).

2.3.7. Gamma glutamyl transpeptidase

Les gamma-glutamyl-transpeptidases (GGT) sont des enzymes hépatiques dont la principale fonction est d’assurer la détoxification de l'organisme favorisant le métabolisme de certains acides aminés, plus précisément, de transférer le groupe gamma-glutamyl vers les acides aminés ou les peptides comme l’aspartate aminotransférase ou l’alanine aminotransférase. Le rapport GGT/plaquettes (GPR) peut évaluer le degré de fibrose hépatique. Une étude réalisée chez les patients ayant une hépatite chronique B, a montré que le risque relatif de développement du CHC s’élevait avec l’augmentation de ce rapport (Park, Kim et al. 2017).

2.3.8. Combinaisons de marqueurs de risque

GALAD

Un modèle de diagnostic a été proposé, intégrant les niveaux de chacun des trois biomarqueurs AFP, AFPL-3 et DCP, ainsi que le sexe et l'âge du patient (GALAD). Ce modèle peut faciliter la détection et le diagnostic du CHC. Les sérums ont été collectés de manière prospective chez 670 patients ayant une maladie hépatique chronique ou un carcinome hépatocellulaire. Une régression logistique a été utilisée pour déterminer les facteurs indépendants associés au CHC. Un modèle a été construit et évalué en termes de sensibilité, de spécificité et de proportion de diagnostics corrects. Le modèle final comprenant sexe, âge, AFP, AFP-L3, et DCP (GALAD) a

été construit et soumis à des validations externes. Une version optimisée pour la sensibilité et la spécificité, le modèle GALAD avait des performances par AUROC supérieures à 0,88, et quel que soit le stade de la maladie (Johnson, Pirrie et al. 2014).

LCR1

L’étude de Poynard et al. portait sur la mise au point d’un test sanguin "à haut risque de carcinome hépatocelllulaire" (LCR1) permettant de mesurer le risque cumulé de CHC à 10 ans chez les patients atteints d'une maladie chronique du foie, sans cirrhose. LCR1 comporte six composants : l'ApoA1 et l'haptoglobine, comme marqueurs d’hépatoprotection, la GGT comme marqueur des facteurs de cytotoxicité (comme l’alcool ou les facteurs métaboliques), ajustés à l’alpha2-macroglobuline pour prendre en compte la gravité de la fibrose, ainsi que l'âge et le sexe. LCR1 a été conçu comme un marqueur très précoce du risque de cancer du foie, chez les patients sans cirrhose. Si validé, la surveillance par imagerie, qui est actuellement limitée aux patients avec cirrhose aux USA et étendu éventuellement au stade F3, sera proposée aux sujets sans cirrhose, quelque soit leur stade de fibrose (Poynard, Peta et al. 2019).

LCR2.

Dans la même étude, pour augmenter la spécificité et pour la prévision du cancer à 5 ans, les 6 composants de LCR1 ont été combinés (LCR2) avec l’AFP, marqueur référent de haute spécificité pour le diagnostique de CHC. Les résultats ont montré que LCR2 était plus sensible que l'AFP seule, avec une AUROC dépendant du temps supérieure à celle de l’AFP seule dans le base de données intégrée (n = 4053): 0,869 (0,833‐0,904) versus 0,718 (0,664-0,772; p <0,001), respectivement. Dans le contexte d'utilisation de 2027 patients avec cirrhose (n = 755) ou sans cirrhose mais LCR1 supérieur au seuil optimal (n = 1272), l'AUROCt de LCR2 était de 0,796 (0,749-0,843) contre 0,696 (0,639-0,752), pour l'AFP seule (P <0,001). Le seuil optimal était de 0,044. Parmi les patients sélectionnés par LCR1 (sans cirrhose ou avec cirrhose), à 5 ans, 23 patients ayant un CHC avec LCR2 bas (<0,044) avaient une survie sans cancer de 98,1% (IC à 95% de 97,3à 98,9) versus 87,3% (95% IC 84.4‐90.1) (P <0.001) pour 69 patients ayant un CHC et un score LCR2 élevé (≥ 0,044). LCR2 pourrait donc être utilisé chez les patients sans cirrhose présentant une LCR1 élevée et chez les patients avec cirrhose. (Poynard, Peta et al. 2019).

Validation indépendante de l’algorithme combinant FibroTest, LCR1 et LCR2

L’étude de Peta et al est une première validation indépendante de l’algorithme combinant FibroTest, LCR1 et LCR2. Les patients d’une cohorte prospective de l’hôpital de Bondy,

France, ayant un programme de surveillance standard de CHC ont été inclus quand ils avaient eu des serums congelés à -80°C, de façon répétée dans le temps. Un total de 159 patients ont été suivis pendant une médiane de 5,1 ans, et 51 ont développé un CHC (31 avec une cirrhose et 20 sans cirrhose). Ces cas ont été appariés à 108 contrôles (56 avec cirrhose et 52 sans cirrhose). La sensibilité de l'algorithme FT-LCR1-LCR2 était supérieure à la surveillance standard 51/51; 100% (IC 95% 93,0-1,00) versus 31/51; 60,8 (46,1‐74,2; p <0,001) et la survie à 5 ans sans CHC était de 90% (81‐99) contre 77% (67‐86; P = 0,003) selon le FT-LCR1-LCR2. Lorsque l'algorithme a été répété chez ces 159 patients, en moyenne 1,5 ans plus tard, les cas développant un cancer ont présenté une augmentation annuelle significative de LCR2 =