Récepteur soluble de la transferrine : Intérêt chez l’hémodialysé chronique (Étude transversale - HMIMV de rabat)

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Au Maroc, les maladies rénales touchent plus d’un million de personnes. Ils aboutissent au dialyse chez 4000 malades chaque année, actuellement on compte, d’après le registre MAGREDIAL près de 9000 patients dialysés, ce chiffre progresse de 5 à 8% par an. A ce rythme, en 2012, environ 13500 patients auront besoin de dialyse. Ces statistiques édifiantes tirent la sonnette d’alarme et doivent inciter les professionnels de la santé à s’engager fortement dans la prise en charge adéquate de ce type de pathologies, de son retentissement et de ses complications.

L’anémie est une des complications inéluctables du patient IRC hémodialysé, cette association anémie-IRC est évoquée pour la première fois en 1836 par BRIGHT qui décrit la pâleur progressive des patients urémiques [1]. La sévérité de cette complication à caractère multifactoriel est grossièrement proportionnelle à la gravité et au stade de l’insuffisance rénale [2].

La prise en charge de l’anémie des patients IRC hémodialysés a été révolutionnée par l’introduction de la rHu-EPO dans les années 90. L’apport de cette molécule a été spectaculaire par l’amélioration des capacités physiques et intellectuelles des patients, la correction des anomalies cardiaques comme l’hypertrophie ventriculaire gauche et la quasi-disparition des besoins transfusionnels. Néanmoins, ce traitement a changé la problématique du statut martiale et la balance du métabolisme de fer est passée du risque de surcharge en fer liée à la transfusion itérative au risque de carence martiale par déficit fonctionnel. Ils ont résulté des situations de résistance à l’rHu-EPO en raison d’une stimulation importante de l’EPO qui augmente d’autant les besoins en fer. De plus, la présence fréquente d’un syndrome inflammatoire diminue également la biodisponibilité de fer par séquestration macrophagique.

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Pour corriger l’anémie et ainsi améliorer la qualité de vie des patients, il est donc nécessaire de porter le diagnostic de cette carence martiale. L’enjeu est aussi économique, puisqu’il faut éviter que cette carence n’entraîne pas une surconsommation de la rHu-EPO. L’évaluation du statut martial et notamment le dépistage du déficit fonctionnel en fer chez l’hémodialysé chronique reste problématique dans la mesure où les marqueurs classiques du bilan martial sont souvent pris en défaut pour les raisons déjà évoquées. Les nouvelles recommandations sur le traitement de l’anémie chez cette catégorie de patients incluent de nouveaux paramètres (pourcentage de globules rouges hypochromes, teneur réticulocytaire en hémoglobine) qui ne sont malheureusement pas disponibles dans tous les laboratoires. Certaines études ont évaluées un nouveau paramètre de bilan martial, le récepteur soluble de la transferrine. C’est un paramètre qui a la propriété de refléter non pas les réserves en fer mais la concentration intracellulaire en fer, notamment des précurseurs érythroblastiques. Il reflète donc l’apport effectif du fer à la moelle. Il dépend aussi de l’activité érythropoïétique qui est stimulée par la rHu-EPO.

Nous nous sommes intéressés à ce paramètre chez la population d’IRC hémodialysé suivis dans le service de néphrologie, dialyse et transplantation rénale de l’HMIMV et dans un autre centre privé de dialyse. Nous avons étudiés son rôle comme marqueur du statut martial et de l’érythropoïèse et nous l’avons comparé aux marqueurs habituels du bilan martial.

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I- METABOLISME DU FER

A- Physiologie

1. Répartition du fer dans l’organisme

Le stock en fer global de l’organisme est d’environ 4 g (l’équivalent du poids d’un petit clou) chez l’homme adulte normal. Le fer se répartit quantitativement dans l’organisme entre des sites d’utilisation et des sites de stockage. Soixante-dix pour cent du fer de l’organisme est utilisé dans la moelle osseuse, pour être incorporé dans l’hème au cours de la synthèse de

l’hémoglobine. Le muscle est le deuxième site d’utilisation de fer (10-20 % du

fer total), où il est nécessaire à l’activité de certaines protéines (myoglobine en particulier). Le foie peut capter et stocker des quantités importantes de fer (1g), notamment lorsque ce dernier est présent en excès dans le plasma [3] (Fig. 1).

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Après avoir pénétré dans la cellule, le fer doit être correctement réparti entre trois pools différents, représentés par le pool fonctionnel, le pool de réserve et le pool de transfert [5].

1.1 Pool fonctionnel

Ce pool correspond à la quantité de fer nécessaire et suffisante pour assurer les différentes voies métaboliques indispensables à la survie propre des cellules. Ce pool concerne également les communications intercellulaires. Il s’agit, plus particulièrement, du fer incorporé dans les protéines héminiques dont l’hémoglobine, la myoglobine et les cytochromes mais aussi du fer cofacteur de multiples réactions enzymatiques comme, par exemple, la ribonucléotide réductase [5].

1.2 Pool de réserve

Dans les conditions physiologiques, le pool du fer de stockage représente environ 1g chez l’adulte, soit 25% du stock total. Ces réserves se situent essentiellement dans les cellules du système monocytaire-macrophagique et dans les hépatocytes sous deux formes quantitativement égales :

 La ferritine hydrosoluble qui constitue une réserve échangeable,  L’hémosidérine non hydrosoluble, plus riche en fer, produit de dégradation partielle de la ferritine dans laquelle le fer est peu mobilisable et qui constitue une réserve martiale stable [6].

1.3 Pool de transfert

Encore appelé pool de fer de « bas poids moléculaire » ou pool de fer labile, il ne représente que 0.1% du total de fer, soit environ 4 mg. Dans le plasma, il n’ya pas de fer libre en circulation, car cette forme est trop toxique, il est

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presque exclusivement lié à la transferrine ou sidérophiline. Ce pool constitue une plaque tournante à partir de laquelle le fer est transporté soit vers le pool fonctionnel, soit vers le pool de stockage [7].

2. Mouvement du fer : Apports et besoins

Le métabolisme du fer se fait en circuit clos, avec échange entre les différents compartiments de l’organisme [7]. Les apports, qui compensent simplement les pertes, représentent une part minime de la masse totale.

2.1 Pertes de fer

Les pertes sont faibles de 1 à 2 mg/jour, l’organisme étant avare de son fer. Ces pertes sont essentiellement liées à la desquamation cellulaire, digestive et cutanée. Cependant une très faible quantité de fer est aussi perdue par les voies biliaire et urinaire. Chez la femme s’y ajoutent les pertes gynécologiques qui représentent environ 12 à 15 mg par cycle menstruel, et les pertes liées au transfert du fer au fœtus lors de la grossesse, ainsi que celles en rapport avec l’allaitement. Enfin, lors du don de sang puisque, 500 mg de fer sont retirés chaque fois que 1 litre de sang est soustrait [8, 9, 10].

2.2 Apport de fer

Un à deux mg de fer sont quotidiennement absorbés au niveau du duodénum, ce qui représente environ 10 % du fer contenu dans une alimentation normale. La captation de fer peut s’adapter, au moins en partie, aux besoins de l’organisme qui peuvent varier dans différentes situations physiologiques : augmentation lors de la croissance, la grossesse et l’allaitement. Le pourcentage de fer extrait de l’alimentation par le tube digestif peut alors augmenter.

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Le fer alimentaire présent sous forme héminique (viande rouge, poisson par exemple….) a une biodisponibilité supérieure à celle du fer non héminique (végétaux, œufs, produits laitiers) et se lie à un récepteur membranaire qui permet son internalisation. L’hème est alors dégradé sous l’action de l’hème-oxygénase libérant le fer dans l’entérocyte. L’absorption du fer non héminique nécessite une phase de solubilisation qui est facilitée par l’acidification se produisant au niveau de l’estomac. Ainsi le fer héminique représente environ 2/3 du fer absorbé alors qu’il ne constitue qu’un tiers des apports [11].

2.3 Mouvements internes

La boucle la plus importante est réalisée par le circuit de l’érythropoïèse. L’incorporation du fer pour la synthèse quotidienne de l’hémoglobine est identique à la qualité libérée par l’hémolyse physiologique, c’est-à-dire 20 à 50 mg/jour. Le macrophage reconnaît diverses modifications biochimiques au niveau de la membrane des globules rouges sénescents. Il phagocyte alors le globule rouge à éliminer, induisant la formation d’un érythrophagolysosome dans lequel un complexe enzymatique constitué de cytochrome réductase, d’héme-oxygénase et de biliverdine réductase, va cataboliser l’hémoglobine. Ce catabolisme libère du CO, de la bilirubine et du fer. Ce fer recyclé, alors à l’état ferreux Fe2+, va être soit capté par l’apoferritine intracellulaire pour former de la ferritine (stock de réserve en fer), soit être exporté par la ferroportine vers le plasma où il sera oxydé en fer ferrique Fe3+ par la céruléoplasmine, une ferroxydase cuivre-dépendante, pour être fixé par la transferrine qui le distribue alors aux tissus qui en ont besoin, essentiellement les précurseurs érythroblastiques [12].

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3. Régulation de l’homéostasie martiale

Les mécanismes de régulation des mouvements du fer sont restés très longtemps méconnus. Depuis quelques années, la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’homéostasie du fer a considérablement progressé grâce au clonage et à la caractérisation d’un grand nombre de protéines effectrices impliquées dans le métabolisme du fer [5, 13]. L’absorption intestinale est une étape capitale, car la régulation de l’homéostasie du fer n’est possible qu’à ce niveau [6].

3.1 Régulation de l’absorption intestinale du fer

L’absorption intestinale du fer varie d’une manière inversement proportionnelle à la quantité de fer stockée et, en revanche, de façon proportionnelle à l’activité de l’érythropoïèse. À cet égard, Finch [14] a proposé l’existence de deux régulateurs: un régulateur stock-dépendant qui serait contrôlé par le contenu en fer de l’organisme et un régulateur érythro-dépendant régulé par les besoins de l’érythropoïèse. Ces derniers agiraient sur un processus de contrôle intestinal commun (informeraient les cellules cryptiques) mais de façon séquentielle et avec des effets quantitatifs différents. Ainsi, le facteur stock-dépendant permettrait d’augmenter l’absorption intestinale du fer lorsque les besoins restent limités à 1 ou 2 mg par jour. Son intervention serait typiquement nécessaire lors des pertes menstruelles. Des besoins plus importants, de l’ordre de 3 à 4 mg par jour, déclencheraient l’activation du facteur érythro-dépendant. Ce serait notamment le cas lors des soustractions sanguines volontaires (donneurs de sang) ou curatives. Ces deux régulateurs doivent être représentés par des agents plasmatiques solubles capables de communiquer avec

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les différents sites impliqués dans l’utilisation, la mobilisation et l’absorption du fer; sites relativement éloignés les uns des autres [5].

L’absorption du fer alimentaire s’effectue au niveau de la partie proximale de l’intestin grêle, par les entérocytes matures des villosités duodénales (Fig. 2).

Le fer alimentaire non héminique est réduit par Dcytb puis absorbé au niveau de la bordure en brosse intestinale, par l’action coordonnée d’une réductase et du transporteur de fer Nramp2/DMT1. L’absorption du fer héminique s’effectue par le transporteur apical spécifique HCP1 [15]. Le catabolisme successif de l’hème par HO-1 libère le fer ferreux, qui peut ainsi rejoindre le pool de fer non héminique internalisé par Nramp2/DMT1. Le fer est ensuite soit stocké dans la ferritine (ou l’hémosidérine), soit exporté au pôle basolatéral de l’entérocyte (par l’action coordonnée de la ferroportine et de l’héphaestine, voire de la céruléoplasmine) pour rejoindre la circulation sanguine [16] (Fig. 2).

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Figure 2 : Représentation schématique de l’absorption du fer au niveau du tube digestif [17]

CYBRD1 : Cytochrome b réductases 1 ; DMT1 : dimetal transporter 1; FPN : ferroportine; HEPH : Hephaestine; Tf : transferrine ; HO : Hème oxygénase ; CO : monoxyde de carbone ; BVD : biliverdine ; Ferr : ferritine; HJV : hémojuvéline ; TfR2 : récepteur à la transferrine 2.

3.2 Protéine HFE

Le modèle de programmation des cellules de la crypte. Modulé par HFE, le contrôle de la pénétration du fer liée à la transferrine en présence de Rtf et de Rtf2 se ferait au niveau des cellules cryptiques intestinales. Ce contrôle aboutirait à la programmation de l’expression des gènes impliqués dans l’absorption du fer non héminique au niveau des entérocytes matures. Au cours de la maturation des entérocytes, des expressions différentielles de gènes se produisent (par exemple, HFE et Rtf ne sont plus synthétisés dans les

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entérocytes matures alors que l’inverse se produit pour DMT1). Pour certaines protéines telles que Rtf et DMT1, la présence d’IRE sur les gènes codant ces protéines (soumis donc à une régulation post-transcriptionnelle de ces gènes) expliquent au moins en partie leur régulation différentielle dans un même entérocyte [18].

3.3 Hepcidine

Synthétisée par le foie sous forme d’un précurseur de 84 acides aminés, l’hepcidine est une hormone peptidique de 25 acides aminés, sécrétée dans le plasma et éliminée dans les urines. Elle possède une structure très particulière, compacte, conférée par quatre ponts disulfures formés à partir de huit cystéines conservées dans l’évolution [19].

D’abord identifiée pour son activité antimicrobienne, l’hepcidine s’est révélée jouer un rôle central dans le métabolisme du fer, en inhibant l’absorption intestinale du fer alimentaire et le recyclage du fer héminique des macrophages. L’action de l’hepcidine passe par sa liaison à la ferroportine et par l’internalisation intralysosomale de l’exporteur, conduisant ainsi à sa dégradation [20, 21]. L’expression de l’hepcidine est augmentée par un régime riche en fer et par l’inflammation (chronique ou aiguë) et le gène est au contraire réprimé par l’hypoxie, la carence en fer et l’anémie (Fig. 3) [19].

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Figure 3 : Schéma illustrant la relation entre la concentration plasmatique en Hepcidine et la disponibilité en fer [21]

3.4 Le système IRE-IRP

Il existe un système moléculaire, contrôlant la régulation post-transcriptionnelle de certains gènes, dont l’activité est directement corrélée à la charge intracellulaire libre en fer. Ce système fait intervenir une séquence spécifique de l’ARNm, nommée IRE, sur laquelle se lie une protéine cytoplasmique, baptisée IRP.

Les éléments, appelés IREs, sont des séquences nucléotidiques particulières avec des structures secondaires en épingle à cheveux. Elles sont présentes au niveau des régions 5’ ou 3’ non traduites de certains ARNm. Les IRPs sont, d’où leur nom, des protéines cytoplasmiques qui vont lier la séquence IRE si la concentration cellulaire en fer est basse et, au contraire, ne peuvent s’y associer si la concentration cellulaire est élevée (Fig. 4).

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Une augmentation de la concentration cellulaire en fer a pour conséquence :  D’une part, de diminuer la quantité d’ARNm du récepteur 1 de la transferrine ; ces derniers sont, en effet, rapidement détruits par une ribonucléase (ceci a pour effet de limiter l’entrée du fer dans la cellule).

 D’autre part, d’augmenter la traduction des ARNm de la ferritine, permettant ainsi de produire suffisamment de protéine pour stocker les atomes de fer présents en excès et limiter leur toxicité potentielle.

À l’inverse, lorsque la cellule est carencée en fer, les IRPs présentent alors une forte affinité pour les IREs. Ceci facilite l’entrée du fer en permettant une expression plus importante du récepteur 1 de la transferrine et une diminution de la synthèse de ferritine, rendue inutile puisqu’il n’existe pas d’atome de fer en excès [5].

La force de ce système est qu’il régule le taux de protéines directement liées au métabolisme du fer, dont le récepteur 1 de la transferrine (entrée du fer), la ferritine (stockage du fer), la ferroportine (export du fer), DMT1 (absorption de fer) et l’ALAS (synthèse de l’hème) [23].

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Figure 4 : Représentation schématique des principes de la régulation post transcriptionnelle par le système IRE/IRP [17]

4. Erythrophagosytose et recyclage du fer héminique

La reconnaissance spécifique d’un globule rouge vieilli par un macrophage tissulaire est suivie de l’internalisation du globule rouge par phagocytose. La maturation de l’érythrophagosome permet le recrutement des enzymes nécessaires à la dégradation des constituants du globule rouge. L’hémoglobine provenant de l’érythrocyte est dégradée en biliverdine et CO par l’hème oxygénase, libérant ainsi le fer. Ce fer peut être stocké sous forme de ferritine ou peut être exportée par l’intermédiaire de la ferroportine dans le milieu extérieur. Le fer sous forme ferreux est oxydé en forme ferrique par la céruléoplasmine avant d’être transporté par le récepteur à la transferrine. Ce fer peut de nouveau servir pour l’érythropoïèse. La ferroportine est régulée par l’hepcidine (Fig. 5).

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Ce processus permet de recycler 25 à 30mg de fer par jour, correspondant aux besoins en fer nécessaires pour produire environ 200 milliards de nouveaux érythrocytes/ jour [24].

Figure 5 : Fer et système des phagocytes mononuclées [17]

Clp : céruloplasmine ; HO : hème oxygénase; CO : monoxyde de carbone ; BVD : biliverdine ; FPN : ferroportine ; Tf : transferrine.

5. Erythropoïèse

L'érythropoïèse est la production continue de globules rouges régulée par la moelle osseuse permettant de compenser quotidiennement la perte de 1/120ème de la masse globulaire totale due à l'hémolyse physiologique. 100 à 250 milliards de globules rouges sont ainsi produits chaque jour chez le sujet normal. En cas de besoins accrus, la production peut être multipliée de façon considérable, jusqu'à 10 fois [25].

La voie de l’érythropoïèse est un enchaînement de processus associant divisions cellulaires, apoptose et différenciation. Elle commence avec le progéniteur engagé dans la lignée myéloïde, dénommé CFU-GEMM. Les

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premiers stades de la lignée érythroblastique sont les BFU-E précoces, suivis des BFU-E tardives et des CFU-E, auxquelles succèdent les premières cellules identifiables morphologiquement sur le frottis médullaire, de l’érythroblaste à l’érythrocyte. L’EPO stimule l’érythropoïèse à partir du stade de BFU-E tardive. L’ensemble du processus qui conduit de la BFU-E précoce aux réticulocytes, puis aux hématies, dure environ 20 jours en situation stable. En délivrant aux cellules cibles un signal de survie et de prolifération, l’EPO est l’élément clef de la régulation de l’érythropoïése [26].

B- Perturbations du métabolisme martial

1. Carences

La carence martiale est de loin la cause la plus fréquente d’anémie microcytaire hypochrome sidéropénique. Selon l’OMS la carence martiale concerne 20% de la population mondiale.

La sidéropénie peut relever d’une insuffisance d’apport, d’une malabsorption digestive ou de pertes excessives, notamment hémorragiques, le plus souvent répétées et distillantes [27].

2. Surcharges

Les surcharges de l’organisme en fer ou hémochromatoses sont définies par le dépassement d’une masse de réserve considérée comme normale (de 10 à 15 mg/kg) et sont classiquement divisées en deux catégories [23].

i) Les hémochromatoses primaires sont des maladies héréditaires dans lesquelles une mutation sur un gène codant pour une protéine effectrice du métabolisme du fer provoque un trouble de l’absorption ou de la redistribution du fer. l’exemple le plus représentatif est l’hémochromatose

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de type 1 causé par une mutation sur le gène de la protéine HFE régulant l’absorption intestinale du fer [28, 29, 30, 31, 32].

ii) Les formes secondaires sont dues schématiquement à deux grands mécanismes [17, 33, 34]:

- La répétition d’apports transfusionnels (1 ml de GR apportant environ 1 mg de fer) nécessaire dans les situations d’hypoplasie médullaire (aplasies congénitales ou acquises, IRC réfractaires à l’érythropoïèse...), de dysérythropoïèse à moelle riche (β-thalassémies majeurs…).

- L’hyperabsorption digestive secondaire à une érythropoïèse inefficace et accélérée qui nécessite des apports en fer augmentés.

3. Déficits fonctionnels

En dehors de ce schéma dichotomique de l’état des réserves (carence ou surcharge), il y a tout un ensemble de situations moins faciles à classer. Ce sont les situations où l’organisme n’arrive pas à fournir assez de fer aux tissus, donc essentiellement aux érythroblastes, pour la synthèse de l’hémoglobine malgré des réserves non épuisées [35].

3.1 Fer et inflammation

Les mécanismes physiopathologiques en cause ne sont encore, à l’heure actuelle, que partiellement élucidés. Schématiquement, l’anémie inflammatoire ou anémie des maladies chroniques peut s’expliquer par la combinaison de trois phénomènes résultant d’une sécrétion d’IL- 1, de TNF-α et d’interféron :

 Une inhibition et une résistance à la sécrétion d’érythropoïétine responsables d’une érythropoïèse anormale ;

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 Des anomalies du métabolisme du fer avec une diminution de la redistribution du fer vers la moelle en raison d’une séquestration macrophagique et d’une baisse de l’absorption intestinale du fer. On attribue maintenant ces effets à l’hepcidine.

 Une diminution de la durée de vie des globules rouges [36].

Cette production d’IL-1 stimule également la sécrétion d’apolactoferrine qui, une fois couplée au fer, empêche l’utilisation de ce dernier pour la synthèse de l’hème. L’anémie qui en résulte est classiquement modérée, normocytaire normochrome, voire à terme microcytaire hypochrome.

Du plus, au cours du syndrome inflammatoire, la concentration de la ferritine augment sans lien avec une augmentation des réserves (protéine "positive" de l’inflammation) et le catabolisme de la transferrine est accélérée (protéine "négative" de l’inflammation). Il ya a donc une diminution de la biodisponibilité du fer pour les érythroblastes, définissant une carence fonctionnelle contrastant avec ferritinémie élevée et une transferrine sérique diminuée. Il est donc difficile de mettre en évidence cette carence fonctionnelle avec les marqueurs classiques du bilan martial.

3.2 Fer et érythropoïèse accélérée

Le terme de déficit fonctionnel a été largement utilisé dans la littérature en néphrologie en référence aux patients IRC qui reçoivent de l’EPO. En effet, chez ces patients, l’administration d’une érythropoïétine augmente la production de globules rouges et donc l’utilisation du fer [37]. Ce dernier peut devenir insuffisant même si les stocks ne sont pas épuisés. Le bilan martial classique se

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trouve en défaut, tout comme lors du syndrome inflammatoire, pour évaluer cette situation [38].

II- LES MARQUEURS BIOLOGIQUES DU METABOLISME

MARTIAL

Nous avons vu que les échanges de fer s’opèrent entre trois compartiments métaboliques principaux : fonctionnel, de transport et de réserves. A chaque compartiment correspond des tests d’exploration spécifiques qui relèvent de la biochimie et de l’hématologie.

A- Lesquels ?

1. Paramètres évaluant le compartiment fonctionnel

L’exploration biologique du fer fonctionnel consiste à évaluer le fer hémoglobinique. Deux sortes de paramètres étroitement associés doivent être distinguées, le taux d’Hb et les indices érythrocytaires (VGM, TCMH et IDGR)

[39].

De nouveaux marqueurs se développés et sont candidats à une évaluation plus spécifique de la carence martiale. Il s’agit du pourcentage de globules rouges hypochromes et du contenu réticulocytaire en hémoglobine. Ces paramètres mettent en évidence, non pas une diminution du stock en fer de l’organisme, mais une baisse de la disponibilité du fer pour les tissus utilisateurs.

2. Paramètres évaluant le compartiment de transport

Pour ce type de fer, l’exploration biologique est focalisée sur les dosages suivants : le fer sérique, la transferrine, le CST, et le Rs-Tf.

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2.1 Le fer sérique

Chez le sujet normal, le fer circulant sous une autre forme que l’hémoglobine est presque exclusivement du fer lié à la transferrine (et très peu à la lactoferrine ou à la ferritine). Par contre à l’état pathologique, on peut trouver aussi du fer d’origine hémoglobinique (hémolyse), du fer lié à la ferritine en quantité élevée (nécrose hépatique, surcharge), une forme atypique de fer non lié à la transferrine (hémochromatose) ou du fer chélaté sous forme de ferrioxamine

[39].

2.2 La transferrine

La transferrine ou sidérophiline est une glycoprotéine assurant le transport du fer depuis les entérocytes intestinaux jusqu’aux érythroblastes médullaires et la récupération du fer après destruction des érythrocytes par le système macrophagique. Il s’agit d’une β globuline synthétisée par le foie et présentant une très forte affinité pour les ions Fe3+. Chaque molécule possède deux sites de fixation du fer indépendants, si bien que l’on peut trouver à tout moment dans le plasma trois formes moléculaires distinctes de transferrine : di ferrique (ayant fixé le fer sur les deux sites), mono ferrique (n’ayant fixé le fer que sur l’un ou l’autre des deux sites), apo transferrine (n’ayant pas fixé de fer) (Fig. 6) [39].

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Figure 6 : Représentation schématique de la transferrine [40] 2.3 Le Rs-Tf

C’est un paramètre d’utilité importante dans l’exploration du statut martial. Objet de ce travail, nous lui consacrons tout un chapitre pour bien l’étudier en détail.

2.4 Ferritine érythrocytaire

La ferritine érythrocytaire est un résidu de la ferritine érythroblastique, dont la concentration est influencée par deux facteurs essentiels :

 La saturation en fer de la transferrine,

 Le niveau de synthèse de l’Hb.

Afin de s’affranchir de l’influence du VGM et de l’hématocrite, la concentration est rapportée à l’érythrocyte, d’où la nécessité d’une numération globulaire effectuée le jour du dosage. Les résultats, exprimés en attogramme/cellule (10-18 g/cellule), sont obtenus après le calcul suivant :

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Ferritine du lysat x Hb du sang total Ferritine érythrocytaire =

GR du sang total x Hb du lysat Néanmoins, son dosage demeure peu pratiqué car plus délicat [6].

2.5 Les paramètres calculés

Ils sont représentés par la CTST, le CST, l’index du Rs-Tf.

3. Paramètres évaluant le compartiment des réserves

Ce compartiment contient le fer séquestré sous forme non toxique, ferritine et hémosidérine, comme cela a été précisé. Seule la ferritine est accessible au dosage.

3.1 Ferritine sérique

La ferritine est un hétéropolymère constitué de 24 sous-unités formant une coque, pouvant accueillir en son centre jusqu’à 4 500 atomes de fer (Fig. 7). Ses sous-unités sont de deux types : la chaîne légère ou L-ferritine (FTL) (ferritin light chain) qui est la plus impliquée dans le stockage du fer proprement dit, et la chaîne lourde ou H-ferritine (FTH1) (ferritin heavy chain), qui a une activité ferroxydase permettant l’intégration du fer dans la ferritine [41]. L’association de 2 chaines peut donner lieu à 25 formes moléculaires possibles (L24, L23H1,..., H24) qui constituent la famille des isoferritines et déterminent la grande hétérogénéité moléculaire de la ferritine [42]. Dans les tissus, dont la capacité de stockage en fer est élevée comme le foie ou la rate, la ferritine est surtout constituée de L-ferritine. Outre son rôle cytoplasmique dans le stockage du fer, la ferritine (50% de réserve soit 15% du fer total) peut être sécrétée, et sa quantité dans le plasma sera alors le reflet de la charge en fer hépatique, ou se lier à l’ARN ou l’ADN (Fig. 7) [41].

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Figure 7 : Représentation schématique de la structure de la ferritine

[43, 44]

3.2 Ferritine glycosylée

La ferritine sérique est constituée par 60 à 80% de ferritine glycosylée (provenant d’un phénomène de sécrétion-glycosylation par les monocytes-macrophages) et de ferritine non glycosylée, issue de l’excrétion des cellules parenchymateuses. La demi-vie de la ferritine glycosylée est plus longue et sa détermination reflète la lyse tissulaire lors des surcharges en fer ou des affections malignes.

Le dosage de la ferritine glycosylée trouve son indication dans l’interprétation d’une hyperferritinémie difficile à cerner. Dans les hyperferritinémie d’origine inflammatoire, le pourcentage de glycosylation reste normal. Plusieurs maladies s’accompagnent d’une augmentation préférentielle de la ferritine non glycosylée : hépatite aiguë, tumeur, maladie de still.

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Le dosage différentiel des ferritines glycosylée et non glycosylée repose sur l’affinité élective de la ferritine glycosylée pour la concanavaline A [6]. Cette technique délicate, mise au point par différentes équipes (Worwood, Cazzola) n’est pratiquée que dans quelques laboratoires spécialisés [45, 46].

3.3 Fer médullaire

Le gold standard pour l’étude des réserves en fer de l’organisme reste la coloration de Perls au bleu de Prusse sur ponction de moelle osseuse qui met en évidence l’hémosidérine contenue par les érythroblastes et permet de voir également le fer macrophagique [47]. Cependant, cette technique de référence demande un prélèvement invasif et sa lecture est sujette à une grande variabilité interindividuelle. De plus, elle perd sa valeur après administration parentérale de fer [48].

B- Aspects analytiques

1. Exploration du compartiment fonctionnel 1.1 Phase pré analytique

Ce dosage requiert un prélèvement sanguin réalisé sur un tube avec EDTA comme anticoagulant.

1.2 Phase analytique 1.2.1 Taux d’Hb

Il s’agit d’un dosage spectrophotométrique bien standardisé consistant à transformer l’Hb en cyanméthémoglobine et à lire l’absorbance à 540 nm. Un standard international est largement utilisé pour la calibration. En fait, cette mesure est depuis longtemps intégrée dans les automates électroniques de cytologie.

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Le taux d’Hb ne doit pas être interprété isolément, mais en relation avec les deux indices érythrocytaires ci-dessous [39].

1.2.2 VGM

Il s’agit d’un indice mesuré pendant une courte période au cours de laquelle les globules rouges en suspension dans un liquide de dilution passent à travers un orifice et déclenchent une impulsion électronique. Le nombre d’impulsions enregistrées correspond au nombre de globules rouges et l’amplitude de l’impulsion permet de mesurer le VGM. Le VGM est aussi donné par les automates électroniques de cytologie [39].

1.2.3 TCMH

Indice calculé en divisant le taux d’Hb (exprimé en g/l) par le nombre de globules rouges (exprimé par µl) [39]. La TCMH est aussi donnée par les automates électroniques de cytologie.

1.2.4 IDGR

Certains automates donnent un indice érythrocytaire appelé IDGR. Un IDGR augmenté (> 15%) traduit une anisocytose et incite à examiner attentivement les frottis [39].

1.2.5 Pourcentage de GR hypochromes

De nouveaux modules utilisant la technologie de cytométrie en flux, permettent d’évaluer le pourcentage de globule rouges circulants dont la teneur en hémoglobine est faible (CCMH<28 g/dl). Ce paramètre est plus sensible que la TCMH qui ne s’abaisse que lorsque l’hypochromie concerne un grand nombre de cellules. Des études ont montré qu’un pourcentage supérieur à 10% était bien corrélé à la carence martiale [49, 50].

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1.2.6 Contenu réticulocytaire en Hb

Si le pourcentage d’hématies hypochromes permet de détecter un état d’érythropoïèse inefficace en raison d’un déficit en fer, la méthode idéale pour effectuer ce dépistage de manière plus précoce, étant donne la longue durée de vie du globule rouge, serait l’étude des globules rouges nouvellement formé tout juste relargués dans le sang périphérique par la moelle osseuse : les réticulocytes. Ces cellules représentent la première forme circulante de globules rouges, présents dans le sang pour une durée qui n’excède pas 24 heures en moyenne avant de perdre leurs mitochondries et ribosomes pour devenir des cellules matures de la lignée rouge. De nouveaux automates permettent l’analyse des cellules réticulocytaires sans modifier leurs différents indices cellulaires. Il s’agit d’une technique de cytométrie de flux qui permet d’étudier le volume réticulocytaire moyen et la concentration en hémoglobine des réticulocytes. A partir de ces mesures, il est possible de calculer la teneur en hémoglobine de chaque réticulocyte, celle-ci étant égale au produit du volume cellulaire par la concentration en hémoglobine au sein de chaque cellule.

Le contenu en hémoglobine des réticulocytes semble être un meilleur indice que le volume réticulocytaire ou que la concentration cellulaire en hémoglobine, car il est plus stable [51]. La mesure du contenu en Hb des réticulocytes disponible sur certain analyseur (Siemens Medical Solution Diagnostics et Sysmex) constitue un examen spécifique et utilisable en routine. Les valeurs usuelles s’étendent de 28 à 35 pg/cellule [52, 53].

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1.3 Phase post analytique

 Hb

- Homme : 13- 17,5 g/dl - Femme : 11,5- 16 g/dl - Femme enceinte : 10,5-11g/dl - Enfant (à partir d’un an) : 11,5- 14,5 g/dl  VGM

80- 100 fl (10-15 l)  TCMH

27-29 pg/GR

L’intérêt de l’exploration de ces paramètres réside presque exclusivement dans le diagnostic de l’anémie par carence en fer (anémie hypochrome ferriprive) où ils sont abaissés (sauf l’IDGR qui est augmenté). Ces résultats indiquent une diminution de la livraison du fer aux érythroblastes, mais ne signifient pas obligatoirement qu’il n’existe plus de réserves en fer. A noter que la TCMH est le premier paramètre à baisser, suivi par le VGM puis par le taux de l’Hb. Ces paramètres peuvent être aussi de quelque utilité dans l’évaluation de la réponse à une thérapeutique martiale [39]. En effet, la TCMH est également le premier marqueur à se corriger en cas de supplémentation en fer.

2. Exploration du compartiment de transport 2.1 Fer sérique

2.1.1 Phase pré analytique

Le prélèvement doit être réalisé sur tube sec (les anticoagulants peuvent entraîner des interférences), à jeun le matin entre 8h et 10h et toujours à la même

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heure s’il s’agit d’un suivi. Le fer sérique présente en effet d’importantes variations nycthémérales [39].

2.1.2 Phase analytique

Le fer fait partie des éléments traces et son dosage présent donc deux difficultés :

i) Contamination éventuelle (matériel de prélèvement, cupules de dosage… soulignant l’intérêt de la bonne gestion de la phase pré analytique),

ii) Détermination précise des faibles concentrations.

La méthode de référence a été décrite par l’ICSH. Elle consiste en une précipitation des protéines sériques avec relargage du fer de la transferrine par un agent réducteur. Après centrifugation, le fer ferreux est détecté dans le surnageant par une technique faisant appel à un chromogène (ferrozine ou férène, plus sensible). A partir de cette technique, diverses variantes ont été développées, visant à automatiser, éviter la précipitation des protéines, minimiser les interférences avec les chromogènes et travailler sur des quantités minimes de sérum [6].

L’interprétation de la sidérémie est souvent délicate. Le fer sérique suit un rythme circadien, avec un maximum le matin (entre 8 – 12 H) et un minimum vers 20 H. Ces variations sont considérablement amoindries en cas de franches hypo ou hypersidérémies. La sidérémie diminue également au cours des règles. La prise médicamenteuse de fer ou un repas riche en fer augmente la concentration post prandiale de fer sérique [6].

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2.1.3 Phase post analytique

- Nouveau-né : 10 à 36 µmol/l - Nourrisson, enfant : 11 à 23 µmol/l - Homme : 10 à 30 µmol/l - Femme : 8 à 28 µmol/l [39]

S’il est certain que le dosage de le sidérémie fournit un message aisément appréhendable pour les patients. Sa variabilité et son défaut de sensibilité en tant qu’indicateur d’hémochromatose ou de carence martiale limitent considérablement son intérêt clinique.

L’hyposidérémie s’observe dans deux situations :

i) Les anémies par carence martiale : Au début de l’installation d’une carence en fer, la sidérémie est maintenue constante aux dépens de réserves échangeables. La synthèse de la transferrine augmente dans un 2ème temps. Ce n’est que tardivement que la sidérémie diminue avec apparition d’une anémie hypochrome,

ii) Les syndromes inflammatoires : Par le jeu des cytokines inflammatoires, les états inflammatoires induisent la synthèse d’hépcidine et détournent le fer libre de son utilisation habituelle pour l’érythropoïèse au profit de sa mise en réserve. Ils agissent sur la synthèse des différentes protéines liant le fer (la transferrine diminue et la ferritine augmente) [54].

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2.2 Transferrine

2.2.1 Phase pré analytique

La transferrine est dosée sur un échantillon de plasma ou sérum obtenu à partir d’un prélèvement sanguin réalisé respectivement sur tube contenant l’heparinate de Li comme anticoagulant ou tube sec sans anticoagulant.

2.2.2 Phase analytique

Le dosage préconisé pour la transferrine est un dosage immunochimique direct par immunoprécipitation en phase liquide (immuno-néphélémétrie, immuno-turbidimétrie) [39].

2.2.3 Phase post analytique

- Nouveau-né : 1,6 à 2,8 g/l - Nourrisson, enfant : 2 à 4 g/l

- Adulte : 2 à 3,2 g/l [55]

La quantité totale de transferrine présente dans l’organisme est inversement corrélée avec l’état des réserves en fer. Ainsi, la synthèse de la transferrine augmente lorsque les réserves diminuent, et ceci bien avant l’apparition de l’anémie. C’est par ailleurs le degré de saturation en fer de la transferrine circulante qui conditionne sa fixation sur les récepteurs membranaires des érythroblastes. Cette fixation est meilleure et la livraison du fer se fait avec plus d’efficacité lorsque prédominent les formes di ferriques [39].

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2.3 Paramètres calculés

La CTST et CST sont deux paramètres calculés suivant les relations :  CTST = Tf (en µmol/l) x 2

CTST = Tf (g/l) x 25

 CST = fer sérique (µmol/l) / CTST (µmol/l)

2.3.1 Valeurs usuelles

 CTST

Adulte (H et F) : 60-95 µmol/l Enfant (1 an – puberté) : 55-100 µmol/l

 CST

Homme : 20- 40 % Femme : 15- 35 % Enfant (1 an – puberté) : 15- 40 %

2.3.2 Utilité pratique

Le CST (et non la CTST qui est plutôt corrélée avec les réserves, comme nous le verrons plus loin) est un bon indicateur du transport du fer et de son alimentation tissulaire. Toute diminution de ce coefficient au dessous de 15% traduit sans aucun doute une diminution de la livraison du fer à l’érythropoïèse (ce qui ne signifie pas forcément que l’on se trouve en présence d’une anémie carentielle, car cela se voit aussi dans les anémies inflammatoires). A l’opposé, toute augmentation de ce coefficient au-delà de 55% témoigne d’un danger de

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surcharge tissulaire en fer du type hémochromatose. Son emploi reste fréquent dans le « screening » de l’hémochromatose génétique [39].

3. Exploration du compartiment de réserve : Dosage de la ferritine sérique

3.1 Phase pré analytique

La ferritine est dosée sur un échantillon de plasma ou de sérum obtenu à partir d’un prélèvement sanguin réalisé respectivement sur tube contenant l’heparinate de Li comme anticoagulant ou tube sec sans anticoagulant.

3.2 Phase analytique

Le dosage de la ferritine est réalisé par immunoenzymologie, chimi- ou électrochimiluminescence, immunonéphélémétrie et immunoturbidimétrie. Les standards doivent être calibrés par rapport au 2ème étalon international (OMS 80-578). Cependant, selon la nature de l’immunogène utilisé (hétérogénéité des ferritines de foie et de rate), le type d’anticorps (poly ou monoclonal) et la nature du marqueur ; les résultats peuvent différer d’une technique à l’autre, particulièrement dans les valeurs élevées. Il est donc recommandé d’assurer le suivi des patients par le même réactif.

En cas de traitement martial, il est conseillé de doser la ferritine à quelques jours de distance [6].

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3.3- Phase post analytique

Tableau I : les valeurs moyennes de la ferritine [55]

Homme Femme Enfant 0-10 j 10-31 j 1-3 m 3-6 m 6-15 m Ferritine (ng/ml) 30-300 20-200 50-400 90-600 140-400 40-220 15-100 j : jour ; m : mois

La ferritine sérique présente, chez l’homme normal, une corrélation étroite avec le fer des réserves. Toute diminution en deçà des valeurs précédentes évoque une baisse des réserves en fer et une évolution possible vers l’anémie hypochrome ferriprive. Le mécanisme est différent dans l’inflammation et l’infection où, le fer étant transféré directement de l’Hb aux réserves réticulo-histiocytaires, la ferritine sérique peut être normale ou même augmentée. Lorsque les réserves en fer augmentent, la ferritine sérique augmente aussi, mais cette élévation n’est pas spécifique puisqu’elle est retrouvée dans d’autres éventualités non liées au métabolisme du fer, telles que la nécrose hépatique et certaines tumeurs [39].

 L’hypoferritinémie est un indicateur fiable de la carence martiale (la seule circonstance pathologique où il existe une baisse de la ferritine). C’est le premier signe biologique et infra clinique de la carence avant la baisse des constantes érythrocytaires (TCMH et VGM) et le stade ultime d’anémie microcytaire hypochrome. Lors des traitements supplétifs, les paramètres érythrocytaires s’élèvent en premier avant la correction de

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l’anémie. L’augmentation de la ferritine qui témoigne de la restauration des réserves nécessite deux à quatre mois de traitement. Néanmoins, la carence martiale peut être masquée par l’augmentation de la ferritine lors d’un syndrome inflammatoire associé. Dans ce cas, l’augmentation du taux du Rs-Tf présente un grand intérêt diagnostique.

 L’hyperferritinémie associée à un taux de fer sérique bas évoquant un syndrome inflammatoire, la ferritine est une protéine de la phase aiguë de l’inflammation.

L’hyperferritinémie associée à un taux de fer sérique normal ou augmenté peut relever d’étiologies diverses :

 Une lyse cellulaire conséquente induisant une hyperferritinémie. C’est le cas des hépatites aigues où la ferritine peut dépasser 10000 µg/l mais aussi des hépatites chroniques, des hémolyses, des nécroses médullaires et myocardiques ainsi que des rhabdomyolyses,

 L’alcoolisme caractérisé par l’hyperferritinémie, un fer sérique élevé et un CST augmenté.

Les causes rares sont représentées par les hyperthyroïdies, les tumeurs malignes (carcinome hépatocellulaire, pulmonaire et mammaire), les maladies hématologiques malignes (LMNH, leucémies, syndrome hyperferritinémie-cataracte lié à la présence de mutation dans l’IRE du gène L-ferritine) [54].

C- Etude critique des paramètres classiques du bilan

martial

Pour rappel, nous allons envisager un à un les différents indicateurs classiques du statut martial en signalant les limites de chacun.

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1. Hémogramme

Le dosage de l’hémoglobine, à la recherche d’une anémie, n’est perturbé qu’à un stade tardif de la carence et témoigne déjà des réserves effondrées. Il ne présente donc qu’un faible intérêt dans un bilan systématique de première intention.

Les autres paramètres érythrocytaires tels que VGM, TCMH bien que variant plus précocement que l’Hb, restent insuffisants pour le diagnostic précoce de la carence martiale. De plus une macrocytose d’origine alcoolique par exemple rend ininterprétable la valeur du VGM.

2. Fer sérique

Trop souvent prescrit en première intention dans le cadre d’un bilan de dépistage d’une carence martiale, son dosage est en pratique très décevant du fait de nombreuses variabilités :

 Variabilité individuelle liée d’une part au rythme circadien (concentration maximale à midi, minimale à minuit, avec une amplitude de 30 à 40% en moyenne) [39] et d’autre part de l’extrême labilité du pool sérique circulant [56],

 Variabilité interindividuelle et en fonction du sexe,

 Enfin et surtout, variabilité en fonction de nombreux facteurs de méprise : hémolyse, nécroses, syndrome inflammatoire.

En résumé, la sidérémie est une investigation qui manque à la fois de spécificité et de sensibilité pour le dépistage des carences martiales, tout en conservant un intérêt certain dans celui des surcharges en fer.

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En pratique, le dosage isolé du fer ne se justifie que couplé à celui de la transferrine afin d’apprécier son coefficient de saturation. Dans l’exploration du fer, il faut tout faire sauf le fer.

3. Transferrine

Sa détermination immunologique sert à calculer la capacité totale de fixation puis, couplée à celle du fer sérique, le coefficient de saturation de la transferrine

[57]. Ce dernier étant entaché par les variations de la sidérémie et de la

transferrine elle-même.

Les variations en sont plus précoces que celle de l’Hb (augmentation de la CTST et diminution du CST en cas de carence). Mais l’interprétation devient difficile en cas de pathologies associées qui peuvent fausser sa véritable signification : par exemple dans le cadre d’une carence martiale associée à un syndrome inflammatoire, la concentration de la transferrine peut être normale, son augmentation par la carence étant masquée par sa diminution. Ces facteurs de variations sont essentiellement :

 Un syndrome inflammatoire,  Une insuffisance hépato-cellulaire,  Une dénutrition,

 Une hyperandrogénie,

 Les fuites urinaires, gastro-intestinales et cutanées.

A l’inverse, une imprégnation oestrogénique peut élever la transferrine et faire évoquer une carence en fer qui n’existe pas (Tableau II) [57].

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Tableau II : Principaux facteurs de variation de la transferrine [57] Facteurs de variation variations observée

Variations pré analytiques et analytiques

Efforts violents

Garrot si pose prolongée

Variations analytiques / Variations biologiques Age nouveau-né personnes âgées Sexe féminin Grossesse Médicaments Contraceptifs oraux Danazol L-asparaginase D-péniccillamine Variations intra-individuelles _/ Variations pathologiques

Inflammations chronique et aigue Insuffisance hépato-cellulaire

Dénutrition

Fuites urinaire, gastro-intestinale et cutannée

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Syndrome inflammatoire (Insuffisance rénale) Hépatopathies

Néoplasies viscérales ou hémopathies malignes Thalassémie majeure Ethylisme chronique Hyperthyroïdie Cytolyse hépatique Nécrose tissulaire Hémolyse

Syndrome d’activation des macrophages

4. Ferritine

Malgré les imperfections méthodologiques de sa détermination, le dosage de la ferritine sérique constitue un examen biologique primordial dans la carence martiale. En effet, une hypoferritinémie signe toujours une carence: une ferritine inférieure à 12 µg/l confirme une déplétion en fer. Par contre, une ferritinémie normale ou augmentée ne permet pas d’exclure une carence martiale dans un contexte où existe une cause d’augmentation de la ferritine [58]. Ainsi, avant d’interpréter un dosage de ferritine, il faut s’assurer de l’absence de syndrome inflammatoire associé (Tableau III).

Tableau III : Causes d’élévation de la ferritine sérique [58]

En somme, il apparaît que tous les paramètres cités précédemment ne semblent pas performants pour le diagnostic d’une carence martiale, particulièrement dans certaines situations de méprise (coexistence d’un

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syndrome inflammatoire). Le besoin d’un test plus spécifique et plus précoce se fait sentir.

C’est dans ce contexte qu’une équipe japonaise, détectant pour la première fois en 1986, le récepteur soluble de la transferrine dans le sérum de sujets sains, propose une méthode immuno-radiométrique de dosage et décrit les variations de cette protéine dans certaines maladies hématologiques [59]. Depuis, de nombreuses publications concernant le sujet, sont apparues et il semblerait que le Rs-Tf puisse jouer un rôle prépondérant dans le diagnostic précoce de la carence martiale. Il est temps de discuter de ce marqueur du bilan martial, certes non récent à l’échelon international mais tout nouvellement introduit dans la pratique quotidienne du laboratoire de biochimie de l’HMIMV.

D- Le récepteur soluble de la transferrine

1. Le récepteur de la transferrine (Rtf) : Structure et origine

La plupart des cellules des mammifères expriment à la surface de leurs membranes des récepteurs pour la transferrine [60, 61]. L’expression la plus large a lieu sur les cellules nécessitant un apport important et continu en fer [61]. Le Rtf est une protéine très ubiquitaire, présente sur toutes les cellules à l’exception des érythrocytes matures [62]. Les précurseurs érythroblastiques portent 2/3 à 4/5 de ces récepteurs.

Le Rtf est une glycoprotéine transmembranaire de structure homodimérique, de masse moléculaire égale à 190 KDa. Chaque monomère contient 760 acides aminés répartis en trois domaines (Fig. 8) [62]:

i) Le domaine cytoplasmique comporte l’extrémité amino-terminale. Il contient 61 acides aminés. La sérine en position 24 est un site de phosphorylation. Une séquence peptidique particulière

(tyrosine-thréonine-41

arginine-phénylalanine) est considérée comme signal indispensable à l’endocytose [63]. L’acylation par l’acide palmitique en position 52 résulte d’une modification post-traductionnelle. les récepteurs non acylés subissent une endocytose plus rapide.

ii) Le domaine transmembranaire contient 28 acides aminés à prédominance hydrophobique. Il fonctionne durant la phase de synthèse comme signal de translocation à travers le réticulum endoplasmique.

iii) Le domaine carboxyterminal extracellulaire contient 671 acides aminés. Les deux monomères sont unis par deux ponds disulfure en position 89 et 98. Il existe trois sites de N-glycosylation en position 251, 317 et 727 et un seul site de O-glycosylation sur un résidu thréonine en position 104. Chaque molécule de récepteur peut fixer deux molécules de transferrine, mais le site de liaison est actuellement inconnu.

Figure 8 : Structure du récepteur de transferrine [64]

Le rôle du Rtf est de lier la transferrine di-ferrique et d’internaliser le fer transferrinique [61]. L’affinité du récepteur pour son ligand varie avec le

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contenu en fer de la transferrine. En effet, au pH physiologique, l’affinité est maximale pour la transferrine di-ferrique [65, 66]. Le passage dans le milieu intracellulaire du fer apporté par la transferrine se fait par un mécanisme d’endocytose [65]. Le complexe transferrine-Rtf est internalisé par suite de l’invagination de la membrane cellulaire qui s’organise en puits tapissés d’une couche de molécules de clathrine. L’invagination aboutit à la formation d’une vésicule d’endocytose ou endosome dont le pH est acide, le fer est libéré. Une vésicule reformée ramène vers la membrane cellulaire le complexe apotansferrine-Rtf où il sera disponible pour un nouveau cycle d’endocytose (Fig. 9).

Figure 9 : Cycle d’endocytose-recyclage du récepteur de la transferrine [62]

Une deuxième voie métabolique mineure consiste en la production de nombreuses vésicules par invagination de la membrane de la vésicule d’endocytose [63, 65]. Cette structure est appelée « endosome multivésiculaire », chaque microvésicule portant un récepteur à la surface est appelée « exosome ».

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2. Le Rs-Tf 2.1 Synthèse

Les précurseurs médullaires érythroïdes constituent la source principale des Rs-Tf [62, 63].

Le Rs-Tf résulte du clivage protéolytique à la surface de l’exosome dans la structure multi vésiculaire. La présence d’une chaîne glycanique en position 104

protège le récepteur de la protéolyse [61]. L’élimination du site de O-glycosylation sur un résidu thréonine en position 104 augmente la

susceptibilité du récepteur de la transferrine au clivage [61, 67]. Ce clivage postérieur à l’ancrage du récepteur dans la membrane cellulaire a lieu entre l’arginine en position 100 et la leucine en position 101 par une sérine protéase (Fig. 10) [64].

Figure 10 : Production du récepteur soluble de transferrine [64] 2.2 Structure

Le Rs-Tf est une forme tronquée du récepteur membranaire [61, 68] ayant perdu ses domaines cytoplasmiques et transmembranaires. Il s’agit d’une forme

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monomérique de 85000 daltons portant une seule molécule de transferrine (Fig. 10) [61, 58]. La concentration des Rs-Tf est proportionnelle à la quantité totale de récepteurs membranaires [61, 66, 69]. Les récepteurs circulants représentent 6% de la totalité des récepteurs tissulaires sous forme essentiellement tronquée [65]. Chez les sujets normaux, il existe moins de 1% de récepteurs intacts.

2.3 Dosage

2.3.1 Prélèvement

Le dosage peut être réalisé sur sérum ou plasma hépariné de préférence. D’autres anticoagulants peuvent être utilisés (EDTA, citrate), mais on doit tenir compte de l’effet de dilution lié à l’anticoagulant.

Les échantillons peuvent être conservés 8 jours à +4°C et 3 semaines à -20°C. Au-delà, les échantillons doivent être congelés à -80°C et n’être décongelés qu’une seule fois [66].

2.3.2 Méthodes de dosage

La première méthode de dosage mise au point par des japonais [59] était une méthode immuno-radiométrique (IRMA) utilisant des anticorps monoclonaux anti-récepteur libre.

En 1987, Huebers [70] utilise une technique ELISA mais avec des anticorps polyclonaux d’origine placentaire. La même technique ELISA, mais cette fois ci avec des anticorps monoclonaux a été utilisée en 1989 par Flowers [71].

Depuis, de nombreuses techniques ont été décrites [60, 61, 72]. Elles diffèrent par :

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 La nature des anticorps, monoclonal ou polyclonal ;

 La nature du standard : récepteur soit libre, soit complexé à la transferrine ou récepteur tronqué isolé du sérum [73] ;

 Le marquage : I125_{, sel d’europium, enzyme (phosphatase alcaline}

ou peroxydase) ;

 Le signal mesuré : radioactivité, photométrie, fluorescence, néphélémétrie, luminescence ;

 Le chromogène utilisé pour les techniques photométriques.

Actuellement, les techniques qui dominent le marché en France font appel principalement à des techniques ELISA en micropuits [74]. L’automatisation totale est disponible depuis peu sur certains automates d’immunochimie (néphélémétries) et de chimiluminescence avec comme avantage la stabilité de la calibration, le dosage au coup par coup, une excellente précision et un rendu rapide des résultats.

Des adaptations immuno-turbidimétriques [75] sur automates de biochimie sont également disponibles.

2.3.3 Variations biologiques et Valeurs de références

Variations biologiques

En période néonatale, la concentration du Rs-Tf est étroitement liée à l’activité érythropoïétique. Chez le nouveau-né, les valeurs de Rs-Tf sont deux fois plus importantes que celles de l’adulte [76]. Puis la concentration diminue progressivement de la période néonatale à l’adolescence pour atteindre les valeurs de l’adulte vers l’âge de 16 ans [77]. Chez le sujet âgé, la concentration

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de Rs-Tf est généralement plus faible [77, 78]. Par ailleurs ; il n’existe pas de différence liée au sexe.

Des variations durant la grossesse en fonction de l’âge gestationnel ont été observées. Durant le premier trimestre, les concentrations ne diffèrent pas significativement des valeurs observées chez les femmes en dehors de toute grossesse. Les valeurs augmentent pendant le deuxième trimestre pour atteindre une concentration maximale durant le troisième trimestre [79].

Des différences de concentration sont observées en fonction de la race, les sujets de race noire ayant des concentrations plus élevées de 10% [73] que les sujets de race blanche.

Des concentrations plus élevées sont aussi notées pour des individus vivant à haute altitude par rapport à des sujets vivant au niveau de la mer.

Valeurs de référence

Les valeurs de référence varient de façon importante entre les différentes trousses. Ceci est lié au choix des calibrants et à l’immunoréactivité des réactifs utilisés.

La première technique de dosage de Rs-Tf qui utilise des anticorps monoclonaux donnait des valeurs moyennes de 250 µg/l chez les adultes des deux sexes.

Une technique ELISA utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre le Rs-Tf placentaire donnait des valeurs 20 fois plus élevées (moyenne égale à 5,6 mg/l) avec une différence liée au sexe [71]. Une autre technique ELISA employant des anticorps polyclonaux retrouvait des valeurs similaires [80].

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Avec l’apparition de nouveaux tests sur le marché, on observe toujours une grande disparité quant aux valeurs normales : 0,70-2,80 mg/l [81], 1,3-3 mg/l

[82], 0,83-1,76 mg/l [83]. Il est donc nécessaire d’assurer le suivi d’un patient

avec le même réactif et il devient impératif de développer un standard international [84].

2.4 Applications cliniques

Le dosage du Rs-Tf revêt une importance indéniable dans des situations où les paramètres biochimiques classiques de l’exploration du fer sont pris en défaut.

2.4.1 Rs-Tf et carence en fer

Une élévation du taux du Rs-Tf a été rapportée par plusieurs auteurs [71, 79]. Chez des patients ayant une carence en fer, durant la déplétion des réserves, on observe une chute de la ferritine. La concentration en Rs-Tf reste constante tant que les réserves en fer ne sont pas épuisées. L’augmentation des Rs-Tf est proportionnelle à l’importance du déficit en fer dans les tissus (fer fonctionnel) et intervient plus précocement que la chute de l’hémoglobine [61].

2.4.2 Rs-Tf et les carences en fer associées à une maladie chronique

La ferritine ne reflète pas les stocks de fer en présence d’inflammation. Elle perd sa sensibilité et peut conduire à une sous-estimation du déficit.

Le dosage du Rs-Tf apparaît donc comme un très bon outil, sa concentration reste normale dans les maladies chroniques et elle augmente lors d’une carence en fer isolée ou associée à une maladie chronique.

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2.4.3 Rs-Tf et érythropoïèse

L'activité érythropoïétique est le déterminant le plus important des valeurs sériques de Rs-Tf. Les taux diminués de Rs-Tf sont observés en cas d'hypoplasie érythroïde (Fig. 11), comme celle induite par les transfusions itératives, l'insuffisance rénale chronique par diminution de production d’EPO, une aplasie ou hypoplasie médullaire ou après une chimiothérapie intensive [85].

Figure 11 : Hypoplasies érythroïdes à Rs-Tf bas [85]

Des taux élevés de Rs-Tf sont observés en cas de stimulation de l'érythropoïèse (Fig. 12), lors d'une anémie par dysérythropoïèse congénitale, hémolyse (acquise ou sphérocytose héréditaire, drépanocytose), beta thalassémie majeure ou intermédiaire, une anémie mégaloblastique ou une polyglobulie secondaire [85].

AA : anémie aplasiques, IRC : insuffisants rénaux

chroniques,

Chimio : chimiothérapie intensive

AHAI : anémie hémolytique auto-immune,

SH : sphérocytose héréditaire, THAL : β-thalassémie majeure, HbH : hémoglobinose H, PG : polyglobulie

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Figure 12 : Hyperplasies érythroïdes à Rs-Tf élevé [85] Dans l’insuffisance rénale chronique

Chez les insuffisants rénaux traités par l’rHu-EPO [86], le dosage du Rs-Tf permet de suivre la réponse à l’érythropoïétine et d’évaluer la probabilité de réponse à la mise en place du traitement [72, 86]. La concentration initiale du Rs-Tf et sa variation au cours des premières semaines permet de classer les malades en répondeurs et non répondeurs au traitement.

Une concentration en Rs-Tf augmentée avec une valeur basse de ferritine (<50 ng/ml) prédit un manque de réponse au traitement, et suggère d’instaurer au préalable un traitement substitutif par le fer pour reconstituer les stocks. En revanche, une ferritine normale avec un Rs-Tf bas prédit une bonne réponse [61].

III- INSUFFISANCE RENALE CHRONIQUE TERMINALE

A- Définition

L’insuffisance rénale chronique terminale correspond à une altération des fonctions d’épuration des déchets du métabolisme cellulaire, du maintien de l’homéostasie du milieu intérieur et des fonctions endocrines.