HLBI307 Biologie Moléculaire

(1)

1

Cours de

Biologie Moléculaire

HLBI307

2015-2016 Eric VIVES

eric.vives@umontpellier.fr 2

Plan du cours (8 CM)

Structures des acides nucléiques

Sucre, phosphate etbases Double hélice

Propriétés physicochimiques des acides nucléiques Hybridation

Applications Réplication

Mécanismes moléculaires de la réplication chez les procaryotes Réplication chez les eucaryotes

Réparations de l’ADN Recombinaison

3

1866: Gregor Mendel identifie l’existence des gènes et les règles qui régissent leur transmission de génération en génération (hérédité).

1869: Découvert par Friedrich Miescher d’un acide faible, la nucléine, dans les noyaux de globules blancs (acide désoxyribonucléique (ADN)).

1900: Wilson remarque que les chromosomes sontidentiques en composition à la nucléine de Miechler.

1909 Levene découvre les nucléotides :hydrolyse basique de l’ADN donne quatre bases différentes (levure).

1928: Griffith découvre la transmission héréditaire d'une souche bactérienne à une autre à travers les générations, et identifie

l'ADN comme le support de cette hérédité.

1938: Hamarsten, Singer et Levene déterminent séparément le poids moléculaire de l'ADN (biréfringence et ultracentrifugation).

1940: Beadle, Tatum et Ephrussi démontrent le lien gène-enzyme (Nobel de médecine et de physiologie en 1958).

Un peu d’histoire…

4

1944: - Avery, MacLeod et MacCarty : ADN : support de l'hérédité.

L'addition d'ADN purifié d'une souche bactérienne à une autre (pneumocoques) confère à cette dernière des propriétés héréditaires différentes caractéristiques de la première.

-Todd réalise la synthèse des désoxyoligonucléotides (prix Nobel de chimie, 1957).

1950: Chargaff découvre la complémentarité des bases de l'ADN dans toutes les espèces

1953: Wilkins, Watson et Crick réalisent un modèle de l’ADN (double hélice composée 2 chaînes antiparallèle de polynucléotides) Watson et Crick déterminent le codage de l'information génétique sous forme de triplets.

(Prix Nobel de médecine et de physiologie, 1962)

1961: Jacob et Monod: ARN messager intermédiaire entre l'ADN et les protéines.

1966: Décryptage du code génétique par Khorana et Nirenberg (codons).

1995: Premier séquençage total : la bactérie Haemophilus influenza (4,5.10⁶ pdb) 1976: Mise au point du séquençage de l'ADN par Sanger et Gilbert.

1999: Séquençage total du génome de drosophile (160.10⁶ pdb). 26 juin 2000: Fin du séquençage du génome humain (en avance de 3 ans)

(2900.10^6* pdb pour 2,7 Mds de USD !).

Un peu d’histoire…

* 400 volumes de 1000 pages (20 mètres de rayonnage)

5 11nm

30nm

Niveau de structuration extrêmement élevé

3,4nm 11nm

1µm

30nm nucléosome

Super enroulement Double hélice

noyau protéique

6 Structure publiée dans Nature

25 avril 1953 Par James Watson et Francis Crick

(Prix Nobel en 1962)

L’ADN dans le chromosome

(2)

7 Structure publiée dans Nature

25 avril 1953 Par James Watson et Francis Crick

(Prix Nobel en 1962)

8

9

10

11

L’ADN dans le chromosome Equivalence A/T et G/C

12

Le support génétique

grand sillon

(3)

13

ADN

groupe phosphate

14 14

Noyau purique (Guanine)

O HO

OH OH*

Liaison β-N-osidique β-D-ribofuranose Le support génétique

NH2

O

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

1’

2’

3’

4’

5’

*absent sur l’ADN nucléoside

15

16

17

18

(4)

19 O

HOCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

2’-désoxyribose

B

HOCH2O 5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

ribose

B

HO HO OH

ADN désoxyribonucléosides

ARN ribonucléosides

A T G C

A U G C Le support génétique

20 O

HOCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HOCH2O 5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO HO OH

nucléoside nucléoside

P OH HO

O OH

P OH HO

O OH

Acide phosphorique Acide phosphorique

21 O

OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

OCH5 ’ ₂_O 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO HO OH

nucléoside nucléoside

nucléotide nucléotide

P HO

O OH

P HO

O OH

Liaison

phosphoester Liaison

phosphoester

22

23 O

OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

OCH^5 ’₂_O 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

OH

P HO

O O

P HO

O O

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P HO

O O

O OCH5 ’ 2

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO OH P

HO O O O OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

OH P HO

O OH O

OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

P HO

O OH

5’

3’ 5’

3’

Liaison

phosphodiester Liaison

phosphodiester ₂₄

ADN : support génétique

O HOCH5 ’ ₂

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

5 ’

3 ’

5 ’

désoxyribose

B

(5)

25

T δ⁺

δ^- δ⁺

δ^-

δ^- A

Etablissement des liaisons hydrogène

26

T 5’

3’

CH³

HNNH N Etablissement des liaisons hydrogène

A

^δ⁺

δ^- δ⁺

δ^-

δ^- 5’

3’

27

δ^- δ⁺

δ^-

δ⁺

G C

28

29

δ-

δ+

δ-

δ+

δ-

δ+

G C

30 - δ

+ δ

- δ

δ+

δ-

δ+

5’

3’

(6)

31

Noyau purique

Adenine ADN

ARN NH2

Adenine

6-amino-purine HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5 7

8

9

32

Noyau purique

Guanine

Guanine ADN

NH2 ARN O

2-amino-6-oxypurine HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5 7

8

9

33

Le support génétique Grand sillon

Petit sillon

5’

3’ 5’

3’

34

35

Noyau pyrimidique

Cytosine NH₂

O

ADN

ARN Cytosine

2-oxy-4-aminopyrimidine Le support génétique

HN 3

N

2 6

5 4

1

36

HN 3

N

2 6

5 4

1

Noyau pyrimidique

Thymine CH₃ ADN

O

O H

5-méthyl-2,4-dioxypyrimidine

(7)

37 l’environnement atomique est totalement

différent selon qu’une protéine interagisse

côté petit sillon ou grand sillon ³⁸

Interactions ADN-protéines

39

Interactions ADN-protéines

l’environnement atomique est totalement différent selon qu’une protéine interagisse

côté petit sillon ou grand sillon ⁴⁰

41

Noyau pyrimidique

2,4-dioxypyrimidine

Uracile ARN O

O

HN 3

HN

2 6

5 4

1

Thymine ⁴²

Bases rares (env 50) trouvées chez certains bactériophages

ou dans les ARNt 5-hydroxymethyl

cytosine NH₂

O HN 3

N

2 6

5 4

1

CH₂OH

O

5-methyl cytosine NH₂

O HN 3

N

2 6

5 4

1

CH₃

Dihydro-uracile O HN 3

HN

2 6

5 4

1

inosine (6-oxypurine)

(8)

43 O

OCH⁵^’₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO P O

O OH

Nucléotide monophosphate

Nucléotide diphosphate

Nucléotide triphosphate P O

O OH P HO

O OH

44 O

OCH⁵^’₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO P O

O OH P O

O OH P HO

O OH

α β γ

O O-CH2

5 ’ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

Adenosine O

HO P O

Adenosine-3’-5’-monophosphate cyclique (cAMP) nucléotide-5’-triphosphate

45

NH₂ O

HO O

OH OH

Noyau purique (Guanine)

Liaison β-N-osidique

β-D-ribofuranose Le support génétique

HN

N N

1 N

2 4

3

6 5

7

8

9

46

47

Adenine Adenosine

Thymine Thymidine

Guanine Guanosine

Cytidine Cytosine Nomenclature bases

Base azotée Base azotée + sucre

48

N⁹(2-hydroxyethoxyl)methyle-Guanine NH₂

O

CH2-O-CH2-CH2-OH

ACYCLOVIR Le support génétique

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

Source de développement de molécules thérapeutiques

(9)

49

NH₂ O

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

N⁹(2-hydroxyethoxyl)methyle-Guanine ACYCLOVIR^TM

CH₂ CH2 O CH2

HO

Source de développement de molécules thérapeutiques

50

Structure de l’AZT et du 3TC

O

O HN

N

Thymidine OH

O CH3

OH

O

O HN

N

AZT OH

O CH₃

N3

NH

O N

N

3TC OH

O

S 2

Présence de noyaux insaturés (bases aromatiques)(+++) Présence de liaisons hydrogène (+++) 51

Présence de phosphates(---) Stabilité

Propriétés physicochimiques des acides nucléiques

52

53

Liaison H : de 1,5 à 1,8 kcal/mole Appariement A/T (2 liaisons hydrogène; 3,5 kcal).

Appariement G/C

(3 liaisons hydrogène; 5,5 kcal). ⁵⁴

34Ao

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

34 A/10=3,4 A entre 2 plans

de pdb

o o

(10)

55

attraction répulsion Forces de Van der Waals

56

_ ..

.. _ _ ..

_ ..

Présence de phosphates

-

Présence de liaisons hydrogène

+

Présence de noyaux insaturés (bases aromatiques)

+

52

57

Stabilisation -  Liaisons hydrogène - Empilement des bases

+

Déstabilisation -  Présence de phosphates

-

Double hélice d’ADN

58

59

L' ADN est moléculairement dynamique, et peut, sous l’influence de divers facteurs,

changer de conformation,

afin de modifier le rôle fonctionnel associé à sa séquence.

Structure de l’ADN

Ces modifications peuvent favoriser des cassures de l’ADN (et les délétions potentiellement

induites par ces cassures), mais aussi des amplifications,

des recombinaisons, ou des mutations.

60

ADN-A

Enroulement ADN-B

Enroulement ADN-Z

Enroulement

(11)

61 10,5 bp/tour de 34 Å

Grand sillon large (11,7Å) Petit sillon étroit (5,7 Å) 11 bp/tour de 31 Å

Grand sillon large (11 Å) Petit sillon inaccessible (2,7Å)

12 bp/tour de 46 Å Petit et Grand sillons

équivalents Poly(GC)₂

56 62

Crystal structure of a junction between B-DNA and Z-DNA reveals two extruded bases

Ha, Lowenhaupt, Rich, Kim and Kim Nature 437, 1183-1186 (October 2005)

Z B

B Z B

ADN-Z, riche en GC2, proche des promoteurs, stimule la transcription

57

63

Crystal structure of a junction between B-DNA and Z-DNA reveals two extruded bases

Ha, Lowenhaupt, Rich, Kim and Kim Nature 437, 1183-1186 (October 2005)

Exclusion de la paire De bases AT à l’extérieur de l’hélice

64

65

Présent dans l’ADN

«déshydraté»

(cristallographie ?) ou suite à la fixation de

certaines protéines (ADN-polymérases)

Possibilité d’être une structure de prédilection

dans les hybrides ADN-ARN et dans les ARN double-brin

66

Structure de l’ARN

5’…AUGGCUUACGAAUAGCGUAAGCCAGCUUAA…3’

5’ 3’ 5’ 3’

A U A A G G C A U U C G G U A

5’… C G U A A G C C

A GCUUAA…3’ 5’3’ 5’3’

Séquences répétées-inversées ou palyndromiques

(12)

67

ARNt

Structures en tige-boucle

(stem-loop) 68

ARNm

Structures en tige-boucle (stem-loop)

69

Structures en hélice

Rotation de la liaison β-N-glycosidique

70

Structures en triple hélice

Protonation de N3 requise

72

TECHNIQUE LA PLUS COURANTE:

ELECTROPHORESE EN GEL D’AGAROSE (polyacrylamide pour tailles < 100 nts)

PRINCIPE:

Migration des molécules dans un gel sous l’action d’un champ électrique Comme les acides nucléiques ont une charge anionique par nucléotide

la migration ne sera dépendante que de la taille de la molécule Mobilité électrophorétique de l’ADN

(13)

73

Pores de grande taille : 0,15 µm de diamètre 1% agarose Séparation de molécules de grande taille

TECHNIQUE LA PLUS COURANTE:

ELECTROPHORESE EN GEL D’AGAROSE Mobilité électrophorétique de l’ADN

10 pdb correspondent 3,4 nm 1000 pdb correspondent 340 nm

soit 0,340 µm

74

Peigne Puits Moule Gel PREPARATION D

’

UN GEL D

’

AGAROSE

Démouler délicatement les puits en retirant le peigne

75

PREPARATION D ’ UN GEL D ’ AGAROSE

Immerger le gel dans le tampon d’électrodes (+BET)

Déposer les échantillons dans les puits

100v .030A

anode +

cathode -

^-⁺

76

77

ANALYSE D’UN GEL D’AGAROSE

x

d

Log ( pdb )

x x

x

d2

78 Log(pdb)x

d

Log ( pdb )

x

x x

x

Dx

ANALYSE D’UN GEL D’AGAROSE

(14)

79

Mobilité électrophorétique de l’ADN

Coupure par une nucléase

10kpb 10kpb

10kpb ⁸⁰

Mobilité électrophorétique de l’ADN

Puits

MWM

MWM 10kpb

10kpb 10kpb

Même masse moléculaire mais mobilité électrophorétique

apparente dépendante de la

structure 3D

21kpb

9kpb

6kpb

2kpb

1kpb

78

81

Spectrophotométrie

Protéines ---

DO de 1 pour une concentration de

1,5mg/ml Acides Nucléiques

_______

DO de 1 pour une concentration de

50 µg/ml (dS) 37µg/ml (sS) (1000nts = 150nM)

280 λ in nm

Absorbance

260

82

83

Le support génétique UV

81 84

Acide nucléique double-brin

(db) ---

Absorbance

λ in nm 260

db sb

Acide nucléique simple-brin

(sb) ____

+30%

Hyperchromicité de l’ADN

(15)

85

db sb

dénaturation

Temp (°C) Absorbance (260nm)

t_1/2 100% db

100% sb

50% db 50% sb Hyperchromicité de l’ADN

86 Temp (°C) Absorbance (260nm)

T_m1/2A Tm1/2B ATTTTAAATTTATAT!

TAAAATTTAAATATA!

A B CGGCCCGGGCCCGCG!GCCGGGCCCGGGCGC!

87

Le Tm augmente avec le pourcentage de GC

88

89 Temp (°C) Absorbance (260nm)

T_m1/2

Dénaturation de l’ADN

Renaturation de l’ADN Dénaturation/Renaturation de l’ADN

Processus réversible 90

c_ot Renaturation de l’ADN

Dénaturation/Renaturation de l’ADN

% de dénaturation

100%

50%

0%

Cinétique de réhybridation

(16)

91

Dénaturation/Renaturation de l’ADN Facteurs influençant l’hybridation de l’ADN

1) La concentration:

92

93

Paramètre cinétique: c₀t (en mole x sec/L)

Une solution diluée d’ADN incubée pendant un temps important aura la même capacité de réhybridation

à son brin complémentaire qu’une solution concentrée d’ADN

incubée pendant un temps court

94

Renaturation sur environ c_ot 95 mole x sec /L

% de dénaturation

100%

50%

0%

10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

10^-1

10^-2 10⁵

VS40

VS40 4 x 10³ pdb

Τ4

Τ4 1,8 x 10⁵ pdb

ε

^-coli

ε

^-coli^{4,5 x 10}⁶^pdb

Pour une quantité identique d’ADN, plus le génome est grand,

moins on aura de copies des régions complémentaires,

et plus longtemps il faudra pour les réhybrider

96

c_ot

mole x sec /L

% de dénaturation

100%

50%

0%

10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10^-2

10^-3 10⁴

ADN fortement répété (30%)

ADN moyennement répété (40%)

ADN faiblement répété (30%)

chez les eucaryotes

(17)

97

2) La température:

Temp (°C) Absorbance

(260nm)

T_m1/2 Dénaturation

Renaturation Zone favorable

à la formation de dS

Zone favorable à la formation

de sS

98

3) La force ionique:

Le support génétique _ ..

_ ..

_ .. _ ..

_ ..

.. _ Na⁺Cl^-

K⁺Cl^-

Na⁺ Na⁺

Na⁺ + Na

+ Na + Na

99

GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC!

3’-CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG-5’!

5‘- -3’!

3’-CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG-5’!GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC!

5‘- -3’!

A A!

A T!

TGC

100

101

Dénaturation/Renaturation de l’ADN Applications

PCR : Polymerase Chain Reaction

1) Chauffage à 95°C 2) Amorces + Refroidissement à env. 50°C

Amorces

102

Sujet sain Sujet malade

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane

Exemple d’application

Identification d’un sujet porteur d’une maladie génétique Dénaturation/Renaturation de l’ADN

(18)

103

Sujet sain

5‘-GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC-3’!

3’-CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG-5’!

Sujet malade

5’-GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC-3’!

3’-CGTAATCCGATATAACGTAGGCATAACGG-5’!

Exemple d’application

Identification d’un sujet porteur d’une maladie génétique

mutation

104

105

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane Incubation avec sonde complémentaire

radioactive ___*

Incubation avec sonde complémentaire radioactive ___*

5’-AGGCTATAATGCATCCG-3’!

5’-…GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC…-3’!

3’-…CGTAATCCGATATAACGTAGGCATAACGG…-5’!

5’-…GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC…-3’!

3’-…CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG…-5’!

5’-AGGCTATAATGCATCCG-3’!

106

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane Incubation avec sonde complémentaire

radioactive ___*

Incubation avec sonde complémentaire radioactive ___*

Lavage de la membrane à une température appropriée Mesure de la radioactivité présente sur le filtre

Identification de l’individu porteur de la mutation génétique mutation

*