Puce à ADN : pourquoi et pour qui ?

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A. Ferrarini S. Jacquemont M. Beck Popovic L. Bonafé

D. Martinet

^historique

Les analyses cytogénétiques font partie du bilan étiologique chez les patients avec retard du développement et/ou retard mental, syndromes malforma<tifs, syndromes autistiques ain

si que pour la définition de la carte chromosomique de certai

nes tumeurs. Les réarrangements chromosomiques jouent un rôle prédominant dans ces maladies et plusieurs méthodologies ont été développées ces cin

quante dernières années. La première évidence d’un lien entre une pathologie clinique et une anomalie de nombre des chromosomes a été décrite en 1959, le syndrome de Down est alors associé à une trisomie 21.¹³ Dès les années 1970, les technologies s’affinent et des aberrations chromosomiques de structure sont détectées. De nouveaux syndromes sont décrits, ils sont caractérisés par un phé

notype clinique cons tant associé à des variations génomiques identiques, com

me par exemple le syn dro me de PraderWilli associé à une délétion sur le chro

mosome 15, en 15q11.2q13 ou le syndrome de Williams à une délétion sur le chromosome 7, en 7q11.23.⁴

pourquoiuneapprocheparpuces àadn

?

Les limites importantes des technologies standards sont qu’elles sont dépen

dantes : 1) du pouvoir de résolution de la technique d’analyse des chromosomes et 2) de l’information clinique associée. Le caryotype peut détecter des anoma

lies de l’ordre de 4 à 5 mégabases (Mb) (seuil de résolution de 500 bandes par génome haploïde). La technique d’hybridation in situ fluorescente (FISH) permet d’aller plus loin dans le degré de résolution et détecte des réarrangements de quelques centaines de milliers de bases (kb) (figure 1). Toutefois la FISH ne peut être appliquée que si l’information clinique est évocatrice, suggérant la présen

ce d’anomalies dans une ou des régions spécifiques du génome. En effet, il n’est possible de déterminer la présence d’une anomalie génétique chez un patient, comme par exemple un patient avec syndrome de Williams, que si l’analyse FISH Array CGH : why and to whom

Structural genomic abnormalities play a key role in the pathogenesis of human disorders and represent one of the first causes of mental impairment, complex syndromes and tumors.

In order to detect these chromosomal abnor

malities, many methodologies have been de

veloped with limits. The new ARRAY based Comparative Genomic Hybridization (ARRAY CGH) is a revolutionary approach which allows to characterize very small genetic abnormali

ties undetectable by the standard approaches and in the absence of any associated clinical information. The aim of this article is to des

cribe why the application of a new array CGH methodology is necessary in the etiological search for genetic diseases, what the limits of the standard approaches are and to whom arrayCGH analyses can be applied in a pedia

tric environment. Examples of our practice will be presented.

Rev Med Suisse 2010 ; 6 : 390-6

Les anomalies génomiques structurelles jouent un rôle détermi

nant dans la pathogenèse des maladies et sont fréquemment retrouvées chez les patients avec troubles du développement, syndromes malformatifs ainsi que dans les tissus tumoraux. Le caryotype et l’hybridation in situ fluorescente sont les outils standards pour la détection des réarrangements chromosomi

ques mais ces approches ont des limites. L’analyse par puces à ADN est une révolution méthodologique qui permet d’étu

dier l’ensemble du génome et d’identifier des réarrangements généti ques de petites tailles non décelés par les techniques classiques. L’objectif de cet article est de décrire pourquoi l’ap

plication de cette nouvelle méthodologie est actuellement in

dispensable lors de la recherche étiologique de maladies gé

nétiques, quelles sont les limites des approches standards et pour qui l’analyse par puces à ADN est appliquée en clinique pédiatrique.

Puce à ADN : pourquoi et pour qui ?

mise au point

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est ciblée dans la région d’intérêt, à savoir la région anor

male en 7q11.23 associée à ce syndrome.

C’est pourquoi une nouvelle approche diagnostique était nécessaire. Son but était la détection, sur l’ensemble du génome, de déséquilibres chromosomiques de très petites tailles et ceci sans avoir spécifiquement une clinique évo

catrice. L’analyse par puces à ADN (array CGH) répond au

jourd’hui à cette demande, le caryotype moléculaire est né (figure 1). Il est ainsi possible d’effectuer une étude pan

génomique à la recherche de pertes ou de gains de séquen

ces d’ADN. La résolution, 100 à 1000 fois supérieure à celle du caryotype conventionnel, permet de caractériser des variations structurales submicroscopiques non décelées par les méthodologies habituelles avec une résolution de quelques milliers de bases (kb) (figure 1).

principe

La technologie par «puces à ADN» utilise le principe de l’hybridation génomique comparative (CGH) et consiste à cohybrider une même quantité d’ADN d’un patient et d’un témoin contrôle, marqués chacun par un fluorochro me de couleur différente, sur un réseau de séquences d’ADN (puce à ADN) représentant l’entier du génome. La lecture des signaux fluorescents est réalisée grâce à un scanner la

ser automatisé. Une analyse bioinformatique des données

est ensuite effectuée à l’aide d’un logiciel qui enregistre l’intensité des différentes fluorescences. Après normalisa

tion de ces données, un rapport sous forme de représen

tation graphi que est effectué à l’aide d’un logiciel, les rap

ports d’hybridation étant proches de «0» pour toutes les régions sans anomalie structurelle (figure 2). Une dévia

tion significative de cette valeur sur plusieurs signaux d’une même région génomique suggère la présence d’anomalies, perte ou gain d’ADN. Cette analyse est répétée à l’ensem

ble du génome. Il est alors possible de voir le caryotype avec une loupe contenant un grossissement d’environ 1000 fois (figure 1).

limitedel

’

approchepar pucesàadn Tous les variants détectés ne sont pas pathogènes. En effet, nous savons depuis peu que deux génomes pris au hasard diffèrent l’un de l’autre par quelques milliers de réarrangements structurels submicroscopiques.⁵ La majeure partie de ces variants n’ont pas d’incidence pathologique.

Par conséquent, la principale limite actuelle est la détection de variants génomiques non validés. La difficulté est de faire la part entre un variant que l’on peut considérer comme non délétère, car sans conséquence pathologique, et un variant pathogène. Seule la démonstration d’une associa

tion entre les résultats génomiques, en l’occurrence la pré

Figure 1. Représentation des méthodologies appliquées en cytogénétique et de leur seuil de détection

Le caryotype conventionnel et le caryotype moléculaire sont des analyses pangénomiques, les analyses par hybridation in situ fluorescente (FISH) et par génétique moléculaire sont des analyses ciblées. Le seuil de détection est une valeur en dessous de laquelle la méthodologie ne peut pas détecter une anomalie. Le seuil de détection du caryotype conventionnel est d’environ 5 millions de bases (Mb), celui de la FISH de quelques centaines de milliers de bases (kb), celui de la puce à ADN de quelques kilobases (kb) (valeur variable en fonction du type de puce utilisé) et celui de la génétique moléculaire d’une base. Soit pour une étude pangénomique, une détection pour le caryotype moléculaire d’environ 1000 fois supérieure à celle du caryotype conventionnel.

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sence d’un variant défini, et la description d’une clinique détaillée permettra à l’avenir de valider le caractère clini

que de ces variants. Des bases de données spécifiques sont aujourd’hui mises à disposition, DECIPHER (DabatasE of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources) et ECARUCA (European Cyto

geneticists Association Register of Unbalanced Chromo

some Aberrations), leur but est de fournir les informations indispensables à la compréhension des variations géno

miques observées.

puces àadn

:

pourqui

?

Selon les directives de l’American College of Medical Ge

netics, l’analyse par puces à ADN devrait être appliquée en association avec le caryotype standard, notamment pour l’évaluation de patients avec retard mental et/ou autisme et/ou anomalie congénitale. En pédiatrie, les principales indications des différentes analyses cytogénétiques sont résumées dans le tableau 1.⁶ Cette technologie peut être également appliquée comme complément à un résultat de caryotype normal et en présence de malformations mul

tiples dans les domaines de la néonatologie et du diag

nostic prénatal.

Chez les patients avec retard du développement et/ou retard mental ou syndrome malformatif, les méthodologies

standards ont permis de détecter une anomalie chromo

somique dans 5 à 10% des cas alors que par puces à ADN actuelles, une anomalie serait retrouvée dans 15 à 20% des cas.⁷ Ces dernières années, cette nouvelle méthodologie a Figure 2. Principe de la méthodologie par «puces à ADN»

Indications en pédiatrie Types Etudes d’analyses

Bilan Caryotype Analyse de la carte

• Dysmorphie conventionnel chromosomique

• Retard mental/développement (46 chromosomes)

• Autisme

• Malformations multiples

Signes cliniques évocateurs Image d’hybri- Analyse ciblée d’une

• Syndrome de Prader-Willi dation in situ région particulière

• Syndrome de Williams-Beuren fluorescente

• Syndrome de Di-George (FISH)

• Autres syndromes décrits

Sans signe clinique Caryotype Analyse pangénomique

• Dysmorphie moléculaire (entier du génome)

• Retard mental/développement (puce à ADN)

• Autisme

• Malformations multiples (w traits dysmorphiques) Tumeur solide

• Neuroblastome

Tableau 1. Principales indications pour les analyses cytogénétiques en pédiatrie

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permis la définition de nouveaux syndromes présentant des anomalies génomiques récurrentes, soit sous forme de perte (syndromes microdélétionnels), soit sous forme de gain (syndromes microduplicationnels) (tableau 2).⁸¹¹ Ces syn

dromes ont parfois la particularité de ne pas se manifester par des signes cliniques systématiques et/ou évocateurs.

Les cliniciens se retrouvent aujourd’hui dans une situation de reverse semiology où le génotype est associé à un phéno

type c’estàdire qu’à partir d’anomalies génomiques dé

tectées sur l’analyse puces à ADN, un phénotype commun entre les patients est retrouvé.

analyseparpucesàadndanslapratique pédiatrique

:

l

’

expérience ducentre hos

-

pitalieruniversitairevaudois

Au Centre hospitalier universitaire vaudois (CHUV), cette approche est utilisée depuis 2007 dans divers domaines de la pédiatrie (génétique médicale, pédiatrie moléculaire, oncologie pédiatrique et recherche appliquée). Dans le cadre de sujets présentant un retard mental et/ou retard du développement, près de 200 patients ont été investi

gués par cette technologie. Dans environ 30% des cas, il a

Tableau 2. Exemples de nouveaux syndromes microdélétionnels et microduplicationnels (non exhaustifs) détéctés par analyse puces à ADN et décrit en fonction de corrélations génotype-phénotype

(Source DECIPHER syndrome).

* Réf. DECIPHER-NCBI Build 36 ; MB : mégabases ; RM : retard mental ; CIA : communication inter-auriculaire ; pb : paire de bases.

Réarrangement Taille de l’anomalie Phénotype

chromosomique et position génomique*

(en millions de paires de bases) Syndromes microdélétionnels

del 1q21.1 1,3 Mb RM léger-modéré, microcéphalie, traits dysmorphiques, anomalies cardiaques, cataracte Chr 1 : pb 144.9 à pb 146.2

del 2p15-16.1 3,9 Mb RM modéré-sévère, CIA, microcéphalie, traits dysmorphiques (racine du nez large, Chr 2 : pb 57.5 à pb 61.5 oreilles bas implantées, palais gothique), hypoplasie du nerf optique

del 3q29 1,8 Mb Retard mental, autisme, microcéphalie

Chr 3 : pb 197.9 à pb 198.9

del 8p23.1 3,6 Mb Malformation cardiaque, hernie diaphragmatique, retard du développement Chr 8 : pb 8.1 à pb 11.8

del 9q34 0,7 Mb Retard sévère, malformation cardiaque (conotroncale), microcéphalie, hypotonie Chr 9 : pb 139.5 à pb 140.2

del 15q13.3 1,9 Mb RM léger-modéré, traits dysmorphiques, épilepsie

Chr 15 : pb 28.5 à pb 30.4

del 15q24 1,7 Mb RM léger-modéré, traits autistiques, traits dysmorphiques, épilepsie Chr 15 : pb 72.1 à pb 73.9

del 16p13.11 0,7 Mb RM modéré à sévère, épilepsie

Chr 16 : pb 15.4 à pb 16.1

del 16p11.2 0,7 Mb Autisme, troubles du langage, obésité

Chr 16 : pb 29.4 à pb 30.1

del 17q21.3 0,5 Mb RM léger-modéré, hypotonie, ptose, traits dysmorphiques, anomalies des yeux et des Chr 17 : pb 40.9 à pb 41.5 oreilles

del 22q13 0,1 Mb Autisme, retard important du langage, macrocéphalie

Chr 22 : pb 49.3 à pb 49.5 Syndromes microduplicationnels

dup 1q21.1 1,3 Mb RM léger-modéré, microcéphalie, CIA

Chr 1 : pb 144.9 à pb 146.2

dup 3q29 1,8 Mb RM léger-modéré, microcéphalie, traits dysmorphiques (longs sourcils, nez large, Chr 3 : pb 197.9 à pb 198.9 oreilles, bouche et yeux larges), obésité

dup 7q11.23 2,2 Mb CIA, retard de langage, retard de développement variable

Chr 7 : pb 71.9 à pb 74.2

dup 16p11.2 0,7 Mb Schizophrénie, retard du développement

Chr 16 : pb 29.4 à pb 30.1

dup 17p11.2 3,7 Mb Hypotonie, retard de croissance, RM, traits autistiques, apnée du sommeil, anomalies Chr 17 : pb 16.6 à pb 20.4 cardiovasculaires

dup 22q11.2 3,7 Mb RM, retard de croissance, hypotonie, traits dysmorphiques Chr 22 : pb 16.9 à pb 20.6

dup Xq28 0,6 Mb RM sévère, spasticité, prédisposition aux infections, langage absent ou pauvre Chr X : pb 152.4 à pb 153.0

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été possible de mettre en évidence des variations structu

relles du nombre de copies génomiques. Ces variations peuvent apparaître soit de novo, soit héritées. Et pour 20%

de tous ces cas, le réarrangement détecté a été défini comme étant la cause délétère à l’origine de la maladie du patient.

exemplespratiques

Définition d’un nouveau syndrome de duplication 7q11.23

Un enfant de sept ans est adressé pour évaluation dans le cadre d’un retard des acquisitions (acquisition de la marche à 27 mois et langage à sept ans limité à quelques mots), épilepsie myoclonique, hyperactivité. Pas de trait dysmor

phique, sauf la présence d’oreilles proéminentes. A l’IRM cérébral : légère atrophie de la substance blanche, dysplasie hippocampique et ventriculomégalie. Le caryotype stan

dard est normal ; l’analyse par puces à ADN montre la pré

sence d’une duplication de 1,8 Mb de la région 7q11.23 (fi

gure 3). L’analyse FISH chez la mère, qui a aussi présenté des troubles du langage, retrouve la même duplication. Une collaboration multicentrique permet de mettre en éviden ce un phénotype commun pour cette microduplication 7q11.23.

Les signes fréquents sont l’hypotonie, le retard de langage, le retard mental modéré. La présence des autres signes tels que les anomalies congénitales (canal artériel persistant (persistent ductus arteriosus – PDA), hernie diaphragmatique, cryptorchidie, anomalies aspécifiques de la substance blan

che) et les traits dysmorphiques (philtrum court et lèvres fines) est très variable.¹²

Définition d’un nouveau syndrome de microdélétion 16p11.2

Un adolescent de seize ans est adressé pour une obé

sité morbide (IMC L 40). Dans les antécédents, on note des troubles de la scolarité sans retard mental. L’anam

nèse familiale montre que la mère présente aussi une obé

sité sévère avec un IMC L 40 pour laquelle elle a bénéficié d’une chirurgie bariatrique. L’examen clinique montre es

sentiellement une obésité avec un acanthosis nigricans qui signe une hyperinsulinémie. Le bilan étiologique exclut une mutation dans le gène MC4R responsable d’obésité mor

bide. L’analyse par puces à ADN permet de mettre en évi

dence une délétion de 600 kb en 16p11.2. Dans le ca dre de l’enquête familiale, la mère bénéficie d’un examen qui met en évidence la même délétion. Une étude comparant la fréquence de cette délétion chez des patients obè ses et des contrôles nous a permis de démontrer une association forte entre l’obésité (avec ou sans trouble neurodévelop

pemental) et cette microdélétion en 16p11.2. Cette der

nière représente, avec les mutations dans MC4R, une des formes génétiques les plus fréquentes d’obésité sévère.¹³

Recherche fondamentale : une technique de gene hunting

Dans cinq familles, la recherche des bases moléculaires de l’omodysplasie, une chondrodysplasie autosomique ré

cessive avec membres courts et dysmorphie faciale, a tout d’abord conduit, par analyse de liaison sur l’ADN, à locali

ser le gène responsable de la maladie. Une mutation pa

thogénique du gène GPC6 a pu être identifiée dans une seule famille. Par analyse puces à ADN, de microréarran

gements génomiques (trois délétions et une duplication) à l’intérieur du gène GPC6 ont été détectés dans les quatre autres familles. Ces pertes/gains d’ADN ont comme effet une absence totale du glypican 6, une molécule clé dans la transmission de plusieurs signaux cellulaires qui règlent la croissance de l’os. Ce type de réarrangement, trop grand pour être détecté par séquençage et trop petit pour être vu au caryotype, pourrait constituer la pathologie molécu

laire d’autres maladies monogéniques pour lesquelles le gène responsable est à ce jour encore inconnu.¹⁴

Figure 3. Analyses des chromosomes 7 par cytogénétique conventionnelle, puces à ADN et hybridation in situ fluorescente

A. Image des chromosomes 7 sur un caryotype conventionnel, aucune anomalie n’est détectable dans la région d’intérêt (flèche). B. Image d’un profil molé culaire après analyse par puces à ADN : l’ensemble des points rouges représente les sondes avec un gain de copies génomiques en 7q11.23 (flèche), soit la présence d’une région dupliquée. C. Image d’hybridation in situ fluorescente (FISH) au moyen d’une sonde marquée avec un fluorochrome de couleur rouge, s’hybridant dans la région de duplication en 7q11.23. Il est possible d’observer un double signal très proche (flèche) représentant la région cible dupliquée (les signaux verts sont les signaux d’une sonde contrôle).

A. Caryotype conventionnel B. Caryotype moléculaire (puce à ADN) C. FISH

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Dr Alessandra Ferrarini Service de génétique médicale et

Département médico-chirurgical de pédiatrie Drs Sébastien Jacquemont et Danielle Martinet Service de génétique médicale

Dr Maja Beck Popovic

Unité d’hématologie-oncologie pédiatrique Dr Luisa Bonafé

Division de pédiatrie moléculaire CHUV, 1011 Lausanne

Alessandra.Ferrarini@chuv.ch Sébastien.Jacquemont@chuv.ch Maja.Beck-Popovic@chuv.ch Luisa.Bonafé@chuv.ch Adresse pour correspondance : Dr Danielle Martinet Danielle.Martinet@chuv.ch

Adresses

Implications pratiques

L’analyse par puces à ADN est indiquée :

Pour l’exploration des troubles du développement avec caryotype normal permettant ainsi :

– de poser un diagnostic étiologique dans environ 15% des cas

– de définir le risque de récurrence pour la famille et, selon les cas, de mettre en place une analyse pour un diagnostic prénatal

– d’identifier de nouveaux syndromes

Dans le cadre de l’oncologie pédiatrique comme marqueur pronostique pour certaines tumeurs

>

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16 Vermeulen J, De Preter K, Naranjo A, et al. Predic- ting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature : A retrospective SIO- PEN/COG/GPOH study. Lancet Oncology 2009;10:

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* à lire

** à lire absolument

Références internet

• American College of Medical Genetics : www.acmg.net

• DECIPHER : Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources : https://decipher.sanger.ac.uk/application/

• DECIPHER syndrome : https://decipher.sanger.ac.uk/

application/syndrome/

• ECARUCA : European Cytogeneticists Association Re- gister of Unbalanced Chromosome Aberrations : www.

ecaruca.net

Bibliographie

Tumeur : analyse par puces à ADN, une valeur pronostique

Un nouveauné, né à terme, présente une forme sévère de neuroblastome IVS nécessitant une prise en charge in

tensive avec intubation et soutien circulatoire. La biopsie hépatique confirme un bon pronostic avec histologie favo

rable et absence d’amplification de l’oncogène MYCN par FISH. Après une bonne évolution initiale, une progression de la maladie est diagnostiquée par l’apparition de métas

tases ganglionnaires abdominales et thoraciques. La ques

tion d’une anomalie biologique des cellules tumorales, non détectée jusquelà, se pose. L’analyse complémentaire pan

génomique par puces à ADN réalisée sur le tissu tumoral permet d’exclure un sousgroupe défavorable nécessitant une intensification du traitement.^15,16 Sous chimiothérapie simple, l’évolution sera favorable.

conclusion

Le caryotype moléculaire par analyse puces à ADN est en train de révolutionner l’activité médicale du diagnostic par cytogénétique. Bien que cette technologie puisse parfois apporter des données difficiles à interpréter, dans un grand nombre de cas de nouvelles corrélations génotypephéno

type sont définies et de nouveaux syndromes émergent sur la base d’altérations génomiques récurrentes. Cette ré

volution technologique, et celles à venir prochainement, notamment le reséquençage complet du génome, nécessite une nouvelle manière de repenser l’approche diagnostique des maladies génétiques dans un contexte biologique et clinique. Seule la collaboration d’équipes pluridisciplinaires scientifiques et médicales, nationales et internationales, permettra de mieux comprendre ce champ nouveau d’ex

ploration parfois déconcertant mais si exaltant.