Exocytose

PHYSIQUE CELLULAIRE

FUSION MEMBRANAIRE (4) EXOCYTOSE

Jean-Pierre HENRY

2 Décembre 2008

La voie de sécrétion

• Le transfert entre compartiments intra-cellulaires se fait par des vésicules

• Bourgeonnement du

compartiment donneur, transport, puis fusion avec le compartiment accepteur

• Centrifuge: voie de sécrétion, terminée par la fusion avec la membrane plasmique:

exocytose

• Centripète: voie d’endocytose

Exocytose régulée/constitutive

• Exocytose constitutive:

– Non régulée par Ca²⁺

– Renouvellement de la membrane cellulaire

• Exocytose régulée (schéma)

– Déclenchée par une

montée de Ca²⁺ cellulaire – Libération de médiateur

pour la communication cellulaire

L’exocytose régulée est impliquée dans le fonctionnement

de la synapse et dans la libération des hormones hydrosolubles

L’exocytose régulée est complexe

L’exocytose (sécrétion) comporte des étapes multiples précédant la fusion membranaire, qui rendent l’analyse biochimique (moléculaire) difficile

bourgeonnement remplissage

migration

arrimage maturation exocytoseexocytose endocytose

migration fusion

Ca²⁺

Ca²⁺

Ca²⁺

membrane

extérieur de la cellule

vésicule

catécholamine (adrénaline) endosome

?

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bourgeonnement remplissage

migration

arrimage maturation exocytoseexocytose endocytose

migration fusion

Ca²⁺

Ca²⁺

Ca²⁺

membrane

extérieur de la cellule

vésicule

catécholamine (adrénaline) endosome

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Mais, l’étude est facilitée car la fusion est détectable depuis l’extérieur de la cellule (pore de fusion, libération de matériel)

Systèmes d’étude: le neurone

• Reconstruction par électron tomographie d’une terminaison d’hippocampe de rat (barre 200 nm)

• On distingue les vésicules synaptiques reliées entre elles par des filaments et reliées à la zone active

Anatomie d’une vésicule synaptique

• Densité: 1,10

• Diamètre externe: 41,6 nm

• Nombre de molécules de

neurotransmetteur: 20 x 10^-21

• Masse: 17,8 Mda

• Protéines/Phospholipides (w/w): 1,94

• Phospholipides/Cholestérol (mol:mol): 1:0,8

• Domaines transmembranaires:

600 (20% de la surface)

• Protéine majoritaire: VAMP, 60 copies

• Pompe à Protons: 1,4 copies

(Takamori et al, 2006, Cell, 127, 831)

Systèmes d’étude: la cellule chromaffine bovine

• Les cellules chromaffines bovines peuvent être

cultivées

• La sécrétion est induite par l’Ach ou les ions K⁺

• Les vésicules (granules

chromaffines) sont gros (200 à 300 nm)

• Les produits de sécrétion sont l’adrénaline et la

noradrénaline, l’ATP et des peptides/protéines

La cellule chromaffine est le prototype de la sécrétion neuroendocrine

Description phénoménologique de l’exocytose

-1-

Ce que les méthodes électriques ont amené

Patch-clamp de mastocytes de souris «beige»

• Mastocytes: cellules circulantes sécrétant de l’histamine

• Souris beige: mutant avec

vésicules de sécrétion géantes

• Patch-clamp whole-cell: mesure de la conductancede la

membrane cellulaire à V cst

• Si V varie sinusoïdalement, mesure de la capacité

membranaire , mesure de la surface cellulaire

• Exocytose d’une vésicule détectable (en d)

(Zimmerberg et al (1987) PNAS 84, 1585

Patch-clamp de mastocytes de souris «beige» (2)

• Le saut capacitance est dû à l’exocytose car il est

proportionnel à la surface de la vésicule sécrétée

• Dans ce cas, ∆F est d’une fraction de pF (Vésicules géantes)

Patch-clamp: circuit équivalent

• En patch-clamp, whole-cell, le scellement entre la pipette et la membrane cellulaire est fort (résistance > 1 Gohm)

• La membrane à l’extrémité de la pipette est enlevée: on voit les propriétés de l’ensemble de la membrane plasmique

• On impose un potentiel sinusoïdal (800Hz)

• On mesure l’admittance du circuit équivalent

Circuit équivalent (2)

• Dans la cellule au repos, le circuit équivalent comporte une capacité unique, celle de la membrane plasmique

Circuit équivalent (3)

• Au moment de la fusion, on a l’ouverture du pore de fusion

• Le circuit équivalent comporte une seconde branche avec en série:

– La capacité de la membrane vésiculaire

– La conductance du pore de fusion

Circuit équivalent (4)

• Au stade suivant (fusion complète), le pore de fusion disparaît

• Le circuit comporte les capacités membranaire et vésiculaire en

parallèle

Circuit équivalent (5)

• L’équation de l’admittance se décompose en une partie

réelle et une partie imaginaire

• Il est possible d’avoir accès à ces 2 parties (ampli lock-in)

• Aux temps brefs, la chute de potentiel est surtout ohmique

• Aux temps longs, g est infini

(Breckenbridge and Almers (1987), Nature 328, 814

Caractérisation du pore de fusion (1)

• (Haut) Evolution de la partie imaginaire I_m et de la partie réelle R_e de l’admittance

• (Bas) conductance du pore de fusion en nS (à gauche) et en nm (à droite)

• Le pore apparaît

brutalement avec une

conductance initiale de 230 pS

• Avec des hypothèses

raisonnables, le pore aurait un diamètre de ~ 1 nm

I_m

Re

Caractéristiques du pore

• La taille du pore est

indépendante de la taille de la vésicule (mesures faites avec adaptation à la cellule chromaffine)

• Le pore peut être stable pendant une seconde (ou plus)

• Le pore peut se refermer (à droite); il peut aussi fluctuer

Le pore de fusion est-il protéique?

Une expérience de fusion faite avec une bicouche et des

liposomes, analysée par la même technique, montre un pore de même dimension et avec des fluctuations semblables

(Chanturiya et al (1997) PNAS,94,14423)

Résultats obtenus par patch-clamp

• L’événement de fusion unique est visible (dans certaines conditions): augmentation de capacité (vésicules de 200 nm ~ qqes fF)

• Le pore de fusion est visible: de 100 à 1000 pS (qqes nm) ; il s’ouvre très rapidement; il peut être stable

pendant une fraction de s; il peut fluctuer (fermeture/ouverture)

• Un pore purement lipidique a des caractéristiques semblables (mais, il y l’hypothèse d’un pore

protéique est aussi défendue )

Principe de l’ampérométrie

• Certaines cellules

neuroendocrines sécrètent des molécules oxydables: cellules chromaffines et adrénaline

• On utilise une microélectrode de carbone à un potentiel

oxydant (800 mV), placée près de la cellule

• La libération de l’adrénaline donne un pic de courant

• Pas de filtrage diffusionnel : le pic donne la cinétique de

sécrétion

Réalisation d’une expérience d’ampérométrie

• Une cellule chromaffine (diamètre 20 µm) est stimulée parune micropipette (à gauche) libérant du KCl (55mM)

• La microélectrode (fibre de carbone, à droite) est à 800 mV

• Sur l’enregistrement du courant, un pic correspond à la libération d’une vésicule

Interprétation du pic ampérométrique

• (I) Vésicule non stimulée

• (II) La diffusion commence à travers le pore: «pied» du pic

• (III) Le pH de la matrice

vésiculaire monte de 5 à 7; le complexe matriciel (0,5 M Adr, 0,25 M ATP,..) se dissocie; la pression osmotique monte; la tension de surface σ monte

(Amatore et al (2000) Biochimie,82, 481)

IV.

Interprétation du pic ampérométrique (2)

• (III) L’énergie du pore est la somme de:

 l’énergie de ligne

2πρ^porer (qui tend à fermer)

 la tension superficielle πσ^porer² (qui tend à ouvrir), qui devient dominante, sortie rapide

• (IV) Diffusion, sans effet membranaire

IV.

Mesures simultanées en patch-clamp et ampérométrie

• Mesure sur mastocytes de souris beige

• La capacitance et I_m montrent une ouverture du pore avant le pic

• Le pied n’est pas très visible en ampérométrie

• Avec une amplification, on voit que le courant ampérométrique du pic (amp) suit la conductance G_p, déduite de R_e

(Alvarez de Toledo (1993) Nature,363,554)

Mesures simultanées sur cellules chromaffines

• Les granules étant plus petits, la mesure de patch doit être plus sensible

• Configuration «cell-attached»

permettant de sonder la

membrane à l’intérieur de la pipette

• L’électrode de carbone est dans la pipette

• I_A, courant ampéro, C,

capacitance, G, conductance

(Albillos et al, Nature (1997) 389, 509)

Mesures simultanées sur cellules chromaffines (2)

• Courbes repésentant le courant ampérométrique (a), l’admittance réelle et imaginaire (b) et la

conductance du pore (c)

• Le courant ampérométrique est proportionnel à la conductance €

Apports des méthodes électriques

• Mise en évidence du pore de fusion – Ouverture très rapide

– Taille généralement inférieure au nS (gros canal) – Susceptible de fermeture et de fluctuations

• L’expansion du pore serait gouvernée par le gonflement de la matrice

• Les vésicules synaptiques (diamètre 40 nm) ne semblent pas gonfler, mais la diffusion à travers le pore les vide en quelques ms

• Pas d’indication sur l’hémifusion

Description phénoménologique de l’exocytose

-2-

Ce que les méthodes optiques ont amené

Les techniques développées récemment

• Microscopie électronique:

– Méthodes sans coloration – Méthodes de tomographie

• Méthodes optiques in vivo

– Interference reflection microscopy – Microscopie biphotonique

– Microscopie de fluorescence à excitation évanescente (TIRFM) – Microscopie STED (stimulated emission depletion)

Electron tomographie conique:

Hémifusion des vésicules synaptiques

« dockées »

• Une coupe de cortex frontal a été fixée et

examinée en tomographie, avec reconstitution d’image

• Les images du centre et à droite suggèrent une

hémifusion

• En projection sur un plan, cette résolution disparaît

(Zampighi et al (2006) Biophys J, 91, 2910))

STED

Résolution du mouvement des vésicules synaptique

• Neurones en culture, avec un marquage par

fluorescence

• Même champ observé en confocal et STED

• Cette méthode de champ large permet des séquences rapides (30 Hz) et elle est utilisable pour le suivi des vésicules synaptiques à la synapse.

(Westphal et al (2008) Science,320, 246)

Exocytose vue par Interference Reflection microscopy (IRM)

• Cellules chromaffines observées in vivo

• En A, empreinte de la cellule au repos, B, stimulation par dépolarisation, C, exocytose, D, récupération

(Llobet et al(2003) Neuron,40, 1075)

Sécrétion d’une cellule chromaffine

• Empreinte de la face basale; calibration 5µ

• Les cellules sont stimulées par dépolarisation

électrique (point blanc)

Suivi des cellules BON par microscopie TIRF

i

z

I cellule

faisceau laser vésicules

onde

évanescente

i > i_critique (i_critique˜ 64°) vésicules

marquées

verre eau

i

z

I cellule

faisceau laser vésicules

onde

évanescente

i > i_critique (i_critique˜ 64°) vésicules

marquées

verre eau

épifluorescence

épifluorescence

évanescence

Les cellules sont marquées par transfection par une construction NPY-GFP. NPY est un peptide exprimé dans les vésicules

Montage réalisé au laboratoire

Description du montage utilisé au laboratoire

prisme (verre) objectif

faisceau laser (Argon à 488 nm)

cellule sur la lamelle de verre

Système de lentilles déplacement du miroir

déplacement du miroir

boite de culture eau

Ce montage permet l'observation successive d'une même cellule à différentes épaisseurs d'évanescence (comprises entre 80 et 300 nm)

Cellules BON stimulées

• Lignée cellulaire dérivée d’une tumeur carcinoïde humaine

• Cellules de type entérochromaffines

(intestin) sécrétant de la sérotonine

• Stimulation par les ions Ba²⁺

• Profondeur d’évanescence:

150nm

• Cadence 25 Hz, accéléré 3 fois

Cellules BON stimulées par le Ca cagé

• Un composé photosensible complexant Ca²⁺ incorporé dans la cellule

• Un flash UV est utilisé pour libérer très rapidement le Ca²⁺

Observation d’un événement unique:

Le « flash »

700 900 1100 1300 1500 1700 1900

2,5 3,5 4,5

Time (s)

Integrated Intensity

τ

~ 100 ms

Cellule BON transfectée NPY-GFP, stimulation digitonine/Ca²⁺

33Hz, Ralenti 3x

Intensité intégrée

Temps (sec)

Origine du flash

• Le produit de sécrétion est le NPY-GFP

• La fluorescence de la GFP dépend du pH:

I_F(pH5)<I_F(pH7)

• la sécrétion change l’environnement de la GFP, de pH5 intravésiculaire à pH7, produisant une

augmentation de la fluorescence (x3)

• La sécrétion est faite dans un champ évanescent excitateur exponentiel, augmentation de la

fluorescence (x3)

• Ces deux facteurs rendent compte du pic (x9)

• La décroissance est due à la diffusion entre le verre et la membrane basale

Observation après marquage de la membrane vésiculaire

• Cellules PC-12 (tumeur de la médullo-surrénale de rat)

• Marquage par NPY-GFP (protéine soluble, verte)

• Marquage par un colorant de type styrène FM-64, rouge et soluble dans les membranes

• Le colorant se dilue dans la membrane cellulaire pendant la sécrétion

(Traska et al (2004) PNAS, 101, 8780) Vidéo

Des protéines de la membrane vésiculaire diffusent dans la membrane plasmique, …

• Cellules chromaffines bovines transfectées par VAMP- GFP

• La VAMP est une protéine abondante de la membrane des granules chromaffines (M~30 kDa)

• Après la fusion, elle diffuse dans la membrane plasmique

(Allersma et al (2004)MolBiolCel, 15, 4658) Vidéo

… mais d’autres ne diffusent pas!

• Cellules PC-12

transfectées par NPY- GFP (soluble, vert) et Phogrine-dsRED

(membranaire, 60kDa, rouge)

• Après exocytose, la Phogrine diffuse très peu

(Traska et al

(2003)PNAS,100, 2070)

Conclusions

Au moment de l’exocytose, il y a:

• Fusion des bicouches: diffusion d’un colorant et de la VAMP

• La membrane vésiculaire garde une certaine identité dans la membrane cellulaire

En fait, la membrane vésiculaire peut, dans certains cas, conserver sa courbure

La concavité, vue par IRM, survit après la sécrétion, vue par TIRFM de FM4-64

• La face basale d’une cellule chromaffine est observée par IRM

(interference reflection microscopy)

• La sécrétion est suivie par TIRFM (marquage membranaire)

• La concavité persiste après l’exocytose

(Llobet et al (2003) Neuron, 40, 1075)

La concavité, vue par IRM, survit après la sécrétion, vue par TIRFM de FM4-64 (1)

• Les « concavités » sont dans le canal vert

• Le FM4-64 est vu dans le canal rouge

Conservation de la concavité (2):

expérience TIRFM

• Cellule chromaffine marquée sur la membrane vésiculaire par VAM-GFP

• Dans 10% des cas, la fluorescence apparaît comme un anneau

• Cette figure est interprétée comme la projection d’une concavité

(Allersma et al (2004) MolBiolCell,15, 4658)

Conservation de la concavité (3): observation en 2 photons d’un marqueur extracellulaire

• On utilise des « agrégats » de cellules chromaffines

• Un marqueur fluorescent imperméant marque l’espace intercellulaire (sulforhodamine)

• Une exocytose apparaît comme une croissance de l’espace externe

• En C, exocytose avec fusion totale; en E, persistance de la concavité

(Kishimoto et al (2006) EMBO J, 25, 673)

Implications mécanistiques

• La conservation de la cavité est inattendue: après les travaux

ampérométriques, on attendait une fusion totale

• Il faut que la forme soit maintenue de l’intérieur (protéines non sécrétées de la matrice) ou de l’extérieur (rôle de l’actine, voir schéma)

• La conservation n’est pas toujours observée

(Sukac and Bement (2006) MolBiolCell, 17, 1495)

Il n’y a pas de cavité persistante dans les neurones

• Observation d’une

terminaison nerveuse géante par IRM

• Pas de cavités visibles

• Augmentation de la surface de l’empreinte

• Les systèmes sont différents (taille,

matrice, cytosquelette)

(Lobet et al (2003) Neuron,40, 1075)

Exocytose séquentielle: une vésicule peut fusionner sur une concavité

I0 I₁

!t

!z

• La fluorescence disparaît en deux temps

• La deuxième vésicule étant plus loin, elle a une intensité plus faible

Expérience sur cellule BON, en TIRFM

(Tran et al (2007) Eur Biophys J, 37, 55)

Exocytose séquentielle (2): imagerie en 2 photons de l’espace extracellulaire

• L’espace extracellulaire est marqué par la sulfoRhodamine B

• Après stimulation, la fluorescence ne diminue pas, mais augmente par exocytose de nouvelles vésicules

(Kishimoto et al (2006) EMBO J, 25, 673)

Utilisation de l’imagerie par 2 photons avec un marqueur polaire extracellulaire

• Agrégats de cellules chromaffines, marqueur sulfoRhodamine

• Stimulation par KCl, images à 0,5 Hz

Si la concavité est conservée, la vésicule peut-elle se refermer?

• Pour certains, l’exocytose pourrait être modulable:

libération partielle du contenu et fusion membranaire incomplète

• C’est l’hypothèse du « kiss-and-run », très développée pour les vésicules synaptiques

• Cette hypothèse a aussi été proposée pour les gros granules des cellules neuroendocrines

• Toutefois, comment peut on arrêter le gonflement de la matrice?

• La « cavicapture »: les vésicules de sécrétion

peuvent se refermer après libération de leur contenu

Argument en faveur de la « cavicapture »

• Cellules PC-12: marquage de la phogrine (protéine transmembranaire)

• A gauche, marquage de l’extrémité N-terminale (cytosol)

• A droite, marquage du C-terminal par l’GFP (sensible au pH)

(Taraska et al (2003) PNAS, 100, 2070)

Argument en faveur de la « cavicapture » (2)

• L’EGFP est un indicateur de pH:

– L’augmentation de I_F correspond à l’ouverture de la vésicule (pH7)

– La décroissance à l’acidification après refermeture

• Si on alcalinise par un pulse de NH⁴⁺ (F) pendant la descente, la fluorescence remonte (F,G)

• Si on alcalinise une vésicule au repos, même variation de I_F

• Il y a exocytose, puis

refermeture(cavicapture) et acidification

(Taraska et al (2003) PNAS, 100, 2070)

Mécanisme hypothétique de la cavicapture

• L’exocytose (2) permet la libération du contenu

• On peut alors avoir

persistance de forme (3)

• Puis, un mécanisme de type endocytose (4,5) referme la vésicule

• La pression de gonflement a été évacuée en cours

d’exocytose

(Tsuboi et al (2004) J Biol Chem,279, 47115)

Conclusions sur les méthodes optiques

• Les méthodes optiques permettent l’observation in vivo de l’événement unique

• Elles ont permis d’observer le phénomène de persistance de forme, encore incompris

• L’exocytose séquentielle (différente de l’exocytose composée) a été mise en évidence

• La « cavicapture » est une réalité, le « kiss-and- run », permettant de contrôler l’exocytose est douteux dans les vesicules neuroendocrines

• Comme toujours en biologie, il y a des variations au moins quantitatives entre les différents systèmes