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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Cherifi, S. (2014). Contribution à la maîtrise de la septicémie sur cathéter à Staphylococcus epidermidis (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté de Médecine – Médecine, Bruxelles.

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ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

Centre National de Référence Staphylococcus aureus, Département de Microbiologie, Hôpital Erasme, ULB, 808 Route de Lehnik, 1070 Bruxelles, Belgique

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Contribution à la maîtrise de la septicémie sur

cathéter à Staphylococcus epidermidis

Docteur Soraya CHERIFI

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales

Promoteur: Professeur Baudouin BYL

Clinique d’Epidémiologie et d’Hygiène Hospitalière

Hôpital Erasme, Belgique

Co-promoteur: Professeur Marie HALLIN

Centre de Diagnostic Moléculaire, iris-Lab, Bruxelles, Belgique

ULB

UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES

Centre National de Référence Staphylococcus aureus. Département de Microbiologie, Hôpital Erasme, ULB, 808 Route de Lennik, 1070 Bruxelles, Belgique

Contribution à la maîtrise de la septicémie sur

cathéter à Staphylococcus epidermidis

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Médicales Promoteur; Professeur Baudouin BYL

Clinique d’Epidémiologie et d’Hygiène Hospitalière Hôpital Erasme, Belgique

Co-promoteur: Professeur Marie HALLIN

Centre de Diagnostic Moléculaire, iris-Lab, Bruxelles, Belgique

Docteur Soraya CHERIFI

UNIVERSITÉ

ULB

DE BRUXELLES

Contribution à la maîtrise de la septicémie sur cathéter à Staphylococcus epidermidis

Composition du jury de thèse

Président: Pr Jacques DEVIERE - Laboratoire de Gastro-entérologie expérimentale, Faculté de Médecine, ULB

Secrétaire: Pr Olivier VANDENBERG - Laboratoire de Microbiologie, iris-Lab, ULB

Membre facultaire: Pr Stéphane DE WIT - Service des Maladies Infectieuses, CHU St Pierre, ULB

Membre facultaire: Pr Frédérique JACOBS - Clinique des Maladies infectieuses. Hôpital Erasme, ULB

Expert extérieur: Pr Youri GLUPCZYNSKI - Service De Microbiologie, Clinique Universitaire de Mont-Godinne, UCL

Expert extérieur: Pr Annette SCHUERMANS - Département d’Hygiène Hospitalière et d’infection Control, UZ Leuven, KUL

Promoteur: Pr Baudouin BYL - Clinique d’Epidémiologie et d’Hygiène Hospitalière, Hôpital Erasme, ULB

A Emmanuel, mon mari

REMERCIEMENTS

Je voudrais remercier un grand nombre de personnes qui ont contribué à l’aboutissement de cette thèse. Baudouin Byl, par ses conseils judicieux et nos nombreux échanges scientifiques, a été d’une aide précieuse et d’un soutien indéfectible. Marie Hallin, par ses compétences et sa disponibilité, m’a supervisée et guidée dans ce travail. Sylvie Arias, par ses collectes de données et ses statistiques, m’a éclairée et beaucoup apporté.

Je voudrais remercier également les membres de ce jury qui, par leurs remarques lors de l’examen du travail, ont contribué à l’amélioration de ce manuscrit.

Tous mes remerciements pour leur expertise scientifique et leur contribution aux analyses et collectes de données : à toute l’équipe d’Olivier Denis, en particulier à Ariane Deplano et à Claire Nonhoff, du Centre National de Référence Staphylocoques du laboratoire de microbiologie de l’hôpital Erasme; à Georges Mascart et à ses collaborateurs du laboratoire de microbiologie de l’hôpital Brugmann et à Anne Dediste et ses collaborateurs de l’hôpital St Pierre.

Toute ma reconnaissance pour leur collaboration aux équipes d’hygiène hospitalière de l’hôpital Erasme, en particulier à Isabelle Hagon et Huguette Strale, de l’hôpital St Pierre, en particulier à Michèle Gérard et de l’hôpital Brugmann, en particulier à Yves Velghe.

Mais aussi toute ma gratitude : à Carole Nagant pour son expertise et sa disponibilité dans la recherche des biofilms, à Rafik Karmali pour son aide précieuse, à Hélène Nicolis pour ses conseils et notre constante amitié, à Daniel Désir pour son solide soutien et à Michel Fuss pour ses encouragements continus; et bien sûr, je n’oublie pas tous les autres « Brugmaniens » : Maryse, Philippe, Yvette, Nicole et Evelyne.

TABLE DES MATIERES

RESUME... 8

LISTE DES ARTICLES...10

LISTE DES ABREVIATIONS... 11

I- INTRODUCTION...13

1. LA SEPTICEMIE SUR CATHETER... 15

A. Problématique... 15 B. Physiopathologie... 16 C. Diagnostic et définitions... 17 D. Prévention et surveillance...21 E. Traitement... 24 2. STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS...25 A. Taxonomie de S. epidermidis...25 B. Génome de S. epidermidis...26 1. Structure générale...26 i. Plasmides... 26

ii. Eléments transposables...27

2. Déterminants de pathogénicité... 29

i. Biofilm et régulations...29

Définition et historique...29

- Etapes de formation du biofilm... 30

- Systèmes de régulation du biofilm... 35

- Le biofilm chez les autres bactéries... 40

ii. Arginine Catabolic Mobile Elément... 41

iii. Autres facteurs... 42

3. Déterminants de la résistance aux antibiotiques...43

i. Déterminants de la résistance aux B-lactames... 43

C. Habitat naturel, pathologies cliniques associées et épidémiologie

moléculaire... 49

1. Habitat naturel...49

2. Pathologies cliniques associées... 49

3. Epidémiologie moléculaire et techniques de typage...52

D. Prévention et traitement des infections avec biofilm dues à S. epidermidis...54

II- OBJECTIFS...57

ni- MATERIEL ET METHODES... 61

1. METHODOLOGIE DES ETUDES MICROBIOLOGIQUES... 62

A. Sélection des souches...62

B. Caractérisation phénotypique... 62

1. Identification par MALDI-TOF ... 62

2. Antibiogramme...63

C. Caractérisation génotypique... 64

1. Extraction...65

2. Techniques de PCR...65

i. PCR triplex 16S mecA nue... 65

ii. PCR autres gènes de résistances... 65

iii. PCR ACME... 66

/v. PCR ica... 66

D. Typage moléculaire...66

1. Macro restriction génomique par électrophorèse en champ pulsé (PFGE)... 66

2. Séquençage multi-locus (MLST)...66

3. SCCmec...67

E. Etude de la formation du biofilm in vitro par coloration au cristal violet...67

2. SELECTION DES POPULATIONS ET METHODOLOGIE DES ETUDES CLINIQUES... 68

B. Effets d’un programme de prévention sur les septicémies associées aux cathéters

dans cinq unités de soins intensifs...69

3. METHODOLOGIE STATISTIQUE... 70

IV- RESULTATS... 71

1. Comparative epidemiology of Staphylococcus epidermidis isolâtes from patients with catheter-related bacteremia andfrom healthy volunteers...72

2. Genetic characteristics and antimicrobial résistance of Staphylococcus epidermidis isolated from patients with catheter-related bloodstream infections and from colonized healthcare workers in a Belgian hospital... 80

3. Variations in catheter-related bloodstream infections rates based on local practices...89

4. A multicenter quasi-experimental study: impact of a central line infection control program using auditing and performance feedback in fixe Belgian intensive care units...94

V- DISCUSSION... 103

1. ELEMENTS MICROBIOLOGIQUES...105

2. ELEMENTS CLINIQUES ET OPERATIONNELS... III VI- CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES... 117

RESUME

La septicémie associée à un cathéter de voie centrale {central line-associated bloodstream infection, CLABSI) est la cause la plus fréquente d’infection nosocomiale aux soins intensifs et entraine une morbidité significative, un allongement des durées d’hospitalisation et un accroissement des coûts. La maîtrise des CLABSI est une préoccupation permanente dans les institutions hospitalières.

Les staphylocoques à coagulase négative (SCN), et en particulier Staphylococcus epidermidis, colonisants de la peau, sont parmi les agents pathogènes opportunistes les plus fréquemment impliqués dans les infections de matériel étranger comme les cathéters, grâce à leur capacité à produire un biofilm.

Dans un travail préliminaire sur la prise en charge des septicémies sur cathéters à chambres implantables, nous avons observé qu’un tiers des septicémies dues à des SCN se solde par le retrait du cathéter et que la sévérité des présentations cliniques est très variable. Nous avons suspecté que des facteurs liés à S. epidermidis lui même pouvaient jouer un rôle dans la sévérité de la présentation clinique et le succès ou l’échec

thérapeutique. Objectifs :

Ce travail de thèse a pour but d’approfondir les connaissances nécessaires à la maîtrise de la septicémie sur cathéter à S. epidermidis. Il a été développé sur deux axes principaux : (1) une recherche sur les facteurs liés au pathogène, basée sur l’étude phénotypique et génotypique des différences entre les S. epidermidis provenant de trois sous-populations (volontaires sains - personnel soignant - patients avec CLABSI) et sur la compréhension de la source à l’origine de la contamination (peau du patient versus personnel soignant); (2) une approche clinique opérationnelle sur les aspects de prévention et de surveillance des CLABSI.

Méthodes ;

Nos travaux de recherche ont porté sur l’épidémiologie moléculaire des S. epidermidis (pulsotypie, PFGE et multi-locus sequence typing, MLST), sur leur antibio-résistance (phénotypique et génotypique), sur la détermination du type de cassette mec (SCCmec typing), sur l’identification de facteurs de virulence [ACME {arginine catabolic mobile element) et ica {intercellular adhesin)] et sur la recherche de la production de biofilm in vitro dans les sous-populations étudiées.

Nous avons également discuté les limites des définitions des CLABSI dans une étude comparative et avons investigué, dans une étude multicentrique, la prévention des CLABSI par un programme de monitoring externe des processus de soins de cathéters et de feedback régulier au personnel soignant concernant leurs indicateurs de performance. Résultats :

Facteurs liés au pathogène :

d’antibiotiques que celles colonisant les volontaires sains (multisensibles), mais à un moins grand nombre que celles causant des CLABSI (souvent multirésistantes), à l’exception de la résistance à la méticilline.

La production de biofilm est sous la dépendance de l’opéron ica mais l’expression de ces gènes est variable, soumise à une régulation complexe. La majorité des S. epidermidis ayant une production importante de biofilm in vitro sont porteurs de l’opéron ica tandis que la majorité des S. epidermidis n’en produisant pas sont ica négatif. Par contre, nous avons observé que les souches de S. epidermidis formant un biofilm in vitro avec une biomasse importante étaient présentes dans les trois sous-populations étudiées.

Tant les S. epidermidis commensaux que ceux responsables d’infection présentent une grande diversité génétique par PFGE mais ils se révèlent, après analyse MLST, comme appartenant pour la plupart au même complexe clonal (CC).

Nous avons également montré que dans un tiers des cas, les souches de S. epidermidis récoltées sur les mains des soignants dans le même hôpital et au cours de la même période de temps, sont identiques à celles responsables de CLABSI, ce qui soutient l’hypothèse que les soignants peuvent servir de réservoir.

Cependant, les présentations cliniques les plus sévères de CLABSI sont dues à des souches de S. epidermidis appartenant à certains MLST séquences types (STs) particuliers : ST2 et SLV (single locus variant) ST54, toutes ica positives, mecA positives et multi-résistantes. Aucune souche présentant ces MLST types n’a été retrouvée sur les mains des soignants, ni chez les volontaires sains.

Surveillance et prévention :

Nous avons démontré que l’intensité de la documentation microbiologique et l’usage de définitions incluant des critères cliniques font varier les densités d’incidence de CLABSI mesurés et donc limitent l’intérêt des comparaisons inter-hospitalières.

Nous avons également démontré l’efficacité d’un programme original de prévention de type audit externe des compliances aux processus de soins des cathéters associé à un feedback régulier. En effet, nous avons observé une diminution statistiquement significative de l’incidence des CLABSI dans les unités de soins intensifs mais nous avons également identifié les limites de cette approche.

Conclusion ;

LISTE DES ARTICLES (par ordre de publication)

Cette thèse est basée sur les 5 articles ci-dessous.

1. Préliminaire: Outcome of totally implantable venons access device-related bacteraemia without device removal. Cherifi S. Jacobs F, Strale H, Struelens M, Byl B. Clin Microbiol Infect. 2007 Jun; 13(6): 592-8.

2. Variations in catheter-related bloodstream infections rates based on local practices. Cherifi S. Mascart G, Dediste A, Hallin M, Gérard M, Lambert ML, Byl B. Antimicrob Resist Infect Control. 2013 Apr 3; 2(1): 10.

3. Comparative epidemiology of Staphylococcus epidermidis isolâtes from patients with catheter-related bacteremia and ffom healthy volunteers. Cherifi S. Byl B, Deplano A, Nonhoff C, Denis O, Hallin M. J Clin Microbiol. 2013 May; 51(5):

1541-7.

4. A multicenter quasi-experimental study: impact of a central line infection control program using auditing and performance feedback in five Belgian intensive care units. Cherifi S. Gérard M, Arias S, Byl B. Antimicrob Resist Infect Control. 2013 Dec 5; 2(1): 33.

LISTE DES ABREVIATIONS

ACME, Arginine Catabolic Mobile Elément ADN, Acide DésoxyriboNucléique

AMPs, AntiMicrobial Peptides ARN, Acide RiboNucléique CC, Complexe Clonal

CDC, Centers for Disease Control and Prévention

CLABSI, Central Line-Associated Blood Stream Infection (septicémie associée à un eathéter de voie centrale)

CLSI, Clinical Laboratory Standards Institute CMI, Concentration Minimale Inhibitrice

CRBSI, Catheter-Related Blood Stream Infection (septicémie liée à un eathéter de voie centrale)

CV, Cristal Violet

CVC, Cathéter de Voie Centrale DO, Densité Optique

HCW, Healthcare Worker (personnel soignant)

HELICS, Hospital in Europe Linkfor Infection Control through Surveillance HV, Healthy Volunteer (volontaire sain)

IDSA, Infectious Diseases Society of America IS, Insertion Sequence (séquence d’insertion) J, Junkyard

Kb, Kilobase (=1000 paires de bases d’ADN ou d’ARN) KISS, Krakenhaus-Infektions-Surveillance-System

MDR, Multiple-Antibiotic Résistance

MGE, Mobile Genetic Elément (élément génétique mobile) MES, Macrolides, Lincosamides, Streptogramines MLST, Multi Locus Sequence Typing

MRSA, Staphylococcus aureus résistant à la méticilline MRSE, Staphylococcus epidermidis résistant à la méticilline MSSE, Staphylococcus epidermidis sensible à la méticilline NHSN, National Healthcare Safety Network

Pb, Paire de bases

PCR, Polymerase Chain Reaction

PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoresis (électrophorèse en champ pulsé) PIA, Intercellular Polysaccharide Adhesin

SCC, Staphylococcal Cassette Chromosome SCN, Staphylocoque à Coagulase Négative SLV, Single Locus Variant

ST, Sequence Type

Les septicémies associées aux cathéters de voie centrale (CLABSI) sont des infections nosocomiales fréquentes, grevées d’une morbidité significative surtout chez les patients à risque tels que les patients immunodéprimés et/ou poly-cathéterisés, patients fréquentant le plus souvent les unités d’hémato-oncologie et de soins intensifs (Otto, 2009). Elles entraînent un allongement des durées d’hospitalisation et une augmentation de leurs coûts (Tacconelli et al., 2009; Vrijens et al, 2012). Les pathogènes les plus fréquemment retrouvés comme agent causal de ces septicémies sont les staphylocoques à coagulase négative (SCN), en particulier Staphylococcus epidermidis (Ronveaux et al., 1998; Wisplinghoff et al., 2004; Suetens et al., 2007).

En effet, S. epidermidis longtemps perçu comme un inoffensif commensal de la peau peut occasionnellement devenir pathogène et est particulièrement impliqué dans les infections de matériel étranger comme les cathéters, les sondes ou les prothèses. La combinaison de l’abondance de S. epidermidis sur la peau humaine, de sa capacité à former du biofilm (Donlan and Costerton, 2002) et de l’augmentation constante de l’usage de matériel implanté ont fait de S. epidermidis un des agents d’infections nosocomiales de tout premier plan (Raad et al., 1998). De plus, la fréquente multi- résistance de S. epidermidis aux antibiotiques (Stewart and Costerton, 2001) et sa capacité à adhérer sous forme de biofilm lui permettent d’échapper aux antibiotiques et rendent l’éradication de ce microorganisme et la guérison de l’infection plus difficiles (Foster, 2005). En effet, les infections de matériel implanté à S. epidermidis sont compliquées à traiter, imposent souvent le retrait du matériel (Cherifi et al., 2007; Owens and Stoessel, 2008; Rogers et al., 2009; Saleem et al., 2010) et contribuent, par l’utilisation prolongée d’antibiotiques, à l’émergence de souches résistantes.

1. LA SEPTICEMIE SUR CATHETER

A. Problématique

Les soins intensifs, où la proportion de patients cathétérisés est élevée, concentrent un risque important de morbi-mortalité en particulier lié à l’acquisition d’infections (Berenholtz et al, 2002; Vincent et al, 2009). Le développement d’une septicémie sur cathéter veineux central est essentiellement un risque d’origine exogène. C’est pour ce type d’infection évitable que les programmes d’amélioration continue de la qualité des soins ont le plus chance d’être efficaces.

Les Etats-Unis rapportent chaque année 80,000 épisodes de septicémies associées aux cathéters (Mermel, 2000; Chittick and Sherertz, 2010). La surveillance européenne 2004-2005 des septicémies nosocomiales aux soins intensifs rapporte une médiane de densité d’incidence comprise entre 1.0 et 3.1 par 1,000 jours-patients, dont 60% de CLABSI (Suetens et al., 2007). Le rapport annuel 2013 de la surveillance des septicémies à l’hôpital en Belgique décrit que 27% des septicémies acquises à l’hôpital sont associées à un cathéter veineux central (référence web 1). Dans la littérature, chez les patients hospitalisés aux soins intensifs, la septicémie sur cathéter est associée à un risque plus élevé de mortalité (Siempos et al, 2009) et à un allongement de l’hospitalisation de 10 à 20 jours (Blot et al., 2005; Maki et al., 2006). De plus, les coûts hospitaliers attribuables à une CLABSI sont importants, estimés à 12,000 dollars américains par épisode (Laupland et al., 2006; Warren et al., 2006a).

jours-cathéters, en fonction du type de cathéter et est plus élevée pour les cathéters veineux centraux de courte durée que pour les cathéters veineux périphériques ou les cathéters implantés (Maki et al., 2006).

Les risques théoriques d’acquisition d’une CLABSI varient largement en fonction de l’hôte, du pathogène, de l’environnement hospitalier mais aussi en fonction d’autres caractéristiques du cathéter tels que : sa localisation, sa durée d’insertion, le mode d’utilisation de la voie veineuse (ce risque est plus élevé en cas d’administration de nutrition parentérale) ou la composition du matériel. Par exemple, les cathéters en polyuréthane (comme ceux utilisés dans les unités de soins intensifs qui ont participé à nos travaux sur la prévention des CLABSI) ou en polytétrafluoroéthylène (Téflon®) sont associés à moins de complications infectieuses que ceux en polyéthylène ou en polyvinyle chloré (PVC) (O'Grady et al., 2011). Ceci est à mettre en relation avec les caractéristiques physico-chimiques des surfaces (hydrophobicité, charge...) intervenant dans la phase d’adhésion initiale des biofilms des S. epidermidis (Neely and Maley, 2000). Les facteurs liés au patient sont la sévérité de la maladie sous-jacente, son statut immunitaire, la neutropénie et la présence d’une autre infection. La surveillance des CLABSI, en particulier aux soins intensifs se focalise principalement sur les cathéters veineux centraux de courte durée.

B. Physiopathologie

ne respectant pas les règles d’asepsie (Dobbins et al, 2002). Ce mécanisme serait plus fréquent en néonatologie (Garland et al, 2008) et dans le cas de cathéters insérés depuis plus de 14 jours (Mermel, 2011). Il existe enfin d’autres voies plus anecdotiques telles que la voie hématogène secondaire à un foyer infectieux à distance (Anaissie et al, 1995) ou l’infection à partir de la contamination des liquides perfusés (Raad et al, 2001).

Les infections de cathéter à S. epidermidis peuvent donc êtres causées par les souches de S. epidermidis colonisant la peau du patient et/ou par celles issues d’autres réservoirs tels que le personnel soignant, les autres patients hospitalisés ou l’environnement hospitalier. La dissémination de ces S. epidermidis survient lors des manipulations du cathéter ou du pansement via l’utilisation de matériel contaminé ou via les mains colonisées du personnel effectuant les soins (Nouwen et al, 1998). En effet, plusieurs études ont montré qu’au sein d’un hôpital, une même souche de S. epidermidis peut se transmettre de patient à patient, soit directement, soit via l’environnement ou encore via le personnel soignant (Worthington et al., 2000; Cimiotti et al., 2004; Muller- Premru and Cemelc, 2004; Liakopoulos et al., 2008; Muldrew et al., 2008; Li et al., 2009). De plus, la persistance de SCN résistants à la méticilline dans l’environnement hospitalier d’unités de soins intensifs ainsi que leur dissémination via les patients y séjournant ont été démontrées (Widerstrom et al., 2006).

Enfin, la peau n’est pas le seul réservoir de S. epidermidis. En effet, d’autres travaux ont montré que les muqueuses peuvent aussi être à l’origine de septicémies à SCN, en particulier chez les patients cancéreux (Costa et al., 2004; Costa et al., 2006).

C. Diagnostic et définitions

épidémiologiques car elle est notamment indépendante des stratégies diagnostiques utilisées pour la mise en évidence des septicémies sur cathéter. Ces définitions sont celles du CDC/NHSN {Centers for Disease Control and Prevention/National Healthcare Safety Network) et sont détaillées dans les références web 2 et 3.

Une CRBSI est une septicémie primaire avec une preuve microbiologique du lien causal au cathéter: par une culture quantitative (supérieure à 1,000 UFC par ml) (Brun- Buisson et al., 1987) ou par une culture semi-quantitative de cathéter positive (supérieure à 15 UFC) pour le même germe que celui isolé dans l’hémoculture (même espèce, même antibiogramme) (Maki et al., 1977) ou par des hémocultures quantitatives avec un rapport de concentration bactérienne entre la ponction au niveau du cathéter et la ponction périphérique supérieur ou égal à cinq (Mosca et al., 1987; Fan et al., 1989) ou enfin par des hémocultures différentielles positives pour le même germe avec une différence dans le temps de croissance supérieur ou égal à deux heures et ce, en faveur de celle prélevée via le cathéter (Blot et al., 1998; Blot et al., 1999). La technique la plus souvent utilisée, dans nos laboratoires également, est la culture semi-quantitative du cathéter mais elle n’explore que sa partie extra-luminale. En pratique clinique, il est souvent difficile d’attribuer une septicémie au cathéter (sur base d’une culture de celui-ci) car le cathéter n’est pas systématiquement retiré ou mis en culture et toutes les autres techniques diagnostiques ne sont pas toujours disponibles. Inversement, certaines septicémies secondaires proviennent de sources non identifiées, comme une pancréatite ou une mucosité et sont attribuées par défaut aux cathéters (CLABSI) (Sihler et al., 2010). De plus, au moment du retrait, 8 à 40 % de l’ensemble des cathéters sont colonisés par des staphylocoques à coagulase négative (SCN), indépendamment d’un contexte infectieux (Rupp and Archer, 1994).

en charge du patient, une façon indirecte de signifier que l’hémoculture n’a pas été interprétée comme un contaminant mais comme ayant une signification clinique.

Figure 1. Comparaison des définitions de septicémies aux CDC/NHSN et aux EU/HELICS-ECDC

Source: Cari Suetens, (ECDC, European Centre for Disease Contrat & Prévention) et ISP (Institut de

Santé Publique)

Différence between CDC/NHSN and ^

HELICS origin of BSI

wîv*^

CDC-DE (KISS) EUAiEQCS-ECDC ^

catheter- 'associated' BSI (CVC use In «h before infection) BSI of unknown origin Other infection •4— wth secondary BSI J

}

CRT3; case defintion of central line-related BSI front HELICS-ECDC protocol (p 9 http://helics.univ- fyonl.fr/protocoIs/icu_protocol.pdf),

CVC; central vascular cathéter,

Légende fsuiteY DTG; digestive,

OTH; other,

PUL‘ pulmonary,

SST; surffcaï site infectons,

SST : sldn and sofi tissue,

un: urinary tract infection

KTSS: Krakenhaus-Infektions-Surveillance-System

CDC/NHSN; Centers for Disease Control & Prevention/Kational Healthcare Stfety Network

D. Prévention et surveillance

La septicémie sur cathéter est une septicémie qui, si elle n’est pas complètement évitable, montre en tout cas un potentiel de réduction important (Pronovost et al, 2010). Les facteurs modifiables d’acquisition d’une CLABSI à S. epidermidis sont principalement liés à la technique d’insertion et à l’utilisation de ce cathéter.

Dans le cadre de la mise en place d’une politique de prévention des infections de cathéter, la première étape, paradoxalement longtemps méprisée, consiste à limiter les indications de mise en place et de maintien. Lors de la phase d’insertion du cathéter, le bénéfice de l’usage d’une asepsie chirurgicale avec des précautions maximales, incluant l’utilisation de masque-blouse-gants stériles et d’un large champ, a été clairement démontré (Raad et al., 1994). L’antisepsie lors de la pose peut être réalisée par de la povidone iodée alcoolique ou par une solution alcoolique contenant au moins 0.5% de chlorhexidine plutôt qu’avec de la povidone iodée aqueuse ou qu’avec de l’alcool à 70° (Maki et al., 1991; Chaiyakunapruk et al., 2002; Parient! et al., 2004; Mimoz et al., 2007; Small et al., 2008). Il n’y a pas de données à ce jour disponibles permettant de départager la povidone iodée alcoolique de la chlorhexidine alcool 2%, aujourd’hui disponible en Belgique. Le respect de la compliance générale à l’hygiène des mains sur la diminution des CLABSI constitue également une mesure de base dont l’efficacité a été démontrée indépendamment des autres mesures (Zingg et al, 2009).

Le site de pose du cathéter a également son importance. Le cathétérisme fémoral est considéré comme associé à un plus grand risque infectieux et thrombotique que le cathétérisme sous-clavier (Merrer et al., 2001; Ge et al., 2012). Cependant, une méta- analyse récente n’a pas mis en évidence de différence dans les taux de CLABSI entre les trois sites d’insertion (jugulaire, sous-clavier et fémoral) (Marik et al, 2012).

de changer les lignes veineuses (hors nutrition parentérale et produits sanguins) tous les 4 jours (Gillies et al., 2005). Plus récemment l’utilisation d’éponges à la chlorhexidine (Biopatch®) (Timsit et al., 2009) et celle de pansements à la chlorhexidine (Tegaderm® gel) (Timsit et al., 2012b) ont été testées afin de maîtriser la voie extra-luminale en réduisant la contamination au niveau du site de ponction. Ces types de pansements ont démontré leurs efficacités dans la prévention des CLABSI mais ils ne sont recommandés qu’en cas d’échec de mesures générales dans des unités à taux élevés de CLABSI. L’utilisation de cathéters imprégnés d’antiseptiques (chlorhexidine/sulfadiazine argent) ou d’antibiotiques (minocycline/rifampicine) réduit significativement le risque de colonisation des cathéters (Yucel et al., 2004; Brun-Buisson et al., 2004; Leon et al., 2004; Rupp et al., 2005). Par contre, ils ne sont pas non plus conseillés en première intention vu le risque théorique d’émergence de bactéries résistantes mais seulement en cas d’échec de l’implémentation et/ou pour le renforcement des mesures préventives de base recommandées (Cheny-Bukowiec et al., 2011).

La manipulation des cathéters joue un rôle très important dans le risque de colonisation endo-luminale. Les ouvertures de voies doivent êtres limitées, en privilégiant les systèmes clos et il est nécessaire de bien désinfecter en plus des mains, les embouts, les robinets ainsi que les connecteurs de sécurité lors de chaque manipulation.

Différents programmes éducationnels ont montré un bénéfice dans l’application de mesures, individuelles ou groupées, de surveillance, d’hygiène des mains, de protection maximale et de désinfection à l’insertion et puis, plus récemment, de mesures de maintenance des cathéters (Eggimann et al., 2000; Sherertz et al., 2000; Coopersmith et al., 2002; Warren et al., 2003; Rosenthal et al., 2003; Zuschneid et al., 2003; Berenhoitz et al., 2004; Lobo et al., 2005; Warren et al., 2006b). Cependant la plupart de ces études se focalisent davantage sur les indicateurs de résultats, c’est-à-dire le taux de CLABSI, et rapportent peu les indicateurs de processus tels que les taux d’observance aux recommandations de bonne pratique ou la proportion de cathéters centraux placés par voie fémorale (Chittick and Sherertz, 2010).

Plus récemment, des approches de prévention des CLABSI de type care bundle ont été développées. Un care bundle est un bouquet d’interventions (trois à cinq) dont l’intérêt est basé sur des preuves cliniques et dont l’application groupée donne de meilleurs résultats que chaque intervention prise individuellement. Ces interventions sont mesurables et donc auditables. Une étude basée sur la mise en place de cinq mesures dans 108 unités de soins intensifs a montré une diminution à 18 mois des septicémies liées au cathéter de 7.7 (médiane 2.7) à 1.4 par 1,000 journées-cathéters (médiane 0) (Pronovost et al, 2006). Ces cinq mesures comprenaient l’hygiène des mains, la désinfection à la chlorhexidine, l’asepsie chirurgicale lors de l’insertion, la priorité de la voie sous-clavière et le retrait des cathéters non indispensables. Cette approche de type bundle est encouragée dans les recommandations CDC (O'Grady et al., 2011). D’autres programmes de prévention basés sur une combinaison de type bundle et approche éducationnelle ont également démontré une efficacité (Marra et al., 2010; Kim et al., 2011; Furuya et al., 2011). Un feedback régulier aux équipes soignantes de leurs performances avec comparaison aux données locales historiques et/ou aux taux nationaux est également recommandé (Marschall et al., 2008) et a montré son impact sur la diminution des taux de CLABSI (Coopersmith et al., 2002; Rosenthal et al., 2003; Zuschneid et al., 2003).

régulier des processus de soins et un feedback aux équipes soignantes de leurs indicateurs de performance.

E. Traitement

A notre connaissance, il n’existe pas à ce jour d’étude randomisée qui évalue la prise en charge thérapeutique des cathéters de longue durée infectés par SCN. Par contre dans deux études rétrospectives, le maintien du cathéter n’a pas eu d’impact sur la mortalité (Coyle et al, 2004), ni sur la résolution de la septicémie à SCN mais bien sur le risque de rechute (Raad et al, 2009), surtout chez les patients porteurs d’une chambre implantable. Pour les infections non compliquées de cathéter de longue durée ou de chambre implantable à SCN, il est recommandé de maintenir le cathéter et de donner une antibiothérapie systémique de dix à quatorze jours associée à un verrou antibiotique. Par contre en cas d’infection compliquée ou d’infection simple avec persistance d’hémocultures positives ou rechute, il est préconisé le retrait du cathéter avec une antibiothérapie adaptée (Mermel et al, 2009).

Dans ces mêmes recommandations, en cas de septicémie sur cathéter veineux central de courte durée ou sur cathéter artériel à SCN, il est proposé soit de retirer le cathéter et de donner cinq à sept jours d’antibiothérapie soit de maintenir la voie centrale et de combiner une antibiothérapie systémique et un verrou antibiotique pendant dix à quatorze jours. Cette attitude est beaucoup plus prudente que les précédentes recommandations qui considéraient que le retrait suffisait (Mermel et al, 2001). Il est intéressant de noter que le verrou antibiotique, vivement recommandé, n’a été investigué que dans de petites études randomisées ou des études rétrospectives (Carratala, 2002; Del Pozo et al, 2009; Megged et al, 2010). La durée optimale du verrou antibiotique et ses modalités d’administration ne sont pas claires.

2 STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

A. Taxonomie

Les bactéries du genre Staphylococcus appartiennent à la famille des Staphylococcaceae, qui comprend également les genres Jeotgalicoccus, Macrococcus, Nosocomiicoccus et Salinicoccus. Observés pour la première fois par Pasteur en 1879 dans un pus de furoncle, les staphylocoques doivent leur nom au chirurgien Ogston (Ogston, 1881), qui les mis en évidence dans des abcès. Les staphylocoques sont des cocci à Gram positif groupés en amas ayant la forme de grappes de raisin. Ils sont immobiles, non sporulés, catalase positive, oxydase négative et anaérobies facultatifs. Ce sont des germes ubiquistes qui font partie de la flore commensale cutanéo-muqueuse de l’homme et de l’animal.

Les staphylocoques ont une enveloppe cellulaire composée d’une membrane cytoplasmique unique (bicouche lipidique), entourée par une paroi cellulaire relativement épaisse (Navarre and Schneewind, 1999). La paroi est composée du peptidoglycane et d’acides teichoïques. Rosenbach introduit en 1884 la classification en espèces basée sur la pigmentation des colonies : jaune-orange pour Staphylococcus aureus et blanche pour S. albus c’est-à-dire pour tous les staphylocoques à coagulase négative (SCN). En plus de la couleur des colonies, le groupe des SCN auquel S. epidermidis appartient se distingue notamment de S. aureus par l’absence de l’enzyme coagulase. Les SCN sont habituellement classés selon un critère de sensibilité ou de résistance à la novobiocine, S. epidermidis y étant sensible contrairement à S. saprophyticus ou S. xylosus.

B. Génome de S. epidermidis 1. Structure générale

Le génome de S. epidermidis a été séquencé pour la première fois en 2003 (souche ATCC 12228) (Zhang et al, 2003). Il est composé de 2,499,279 paires de bases et de 6 plasmides. La proportion de G+C est de 32.1%. Il contient 2,419 gènes.

Une seconde souche, la RP62a a été ensuite séquencée (Gill et al., 2005). Vandecandelaere et al. ont séquencé très récemment le génome d’une souche de S. epidermidis (ET-024), isolé d’un biofilm de tube endotrachéal (Vandecandelaere et ai, 2014).

Le génome peut être divisé en deux parties distinctes: un génome dit « central » (core genome) représentant 80% de celui-ci et constitué des gènes présents dans la quasi­ totalité des souches de l’espèce et un génome variable, représentant les 20% restants et constitué de différents éléments génétiques mobiles (MGE). Les MGE comprennent les plasmides et les éléments transposables incluant, les séquences d’insertion, les transposons et les cassettes chromosomiques staphylococciques.

i. Les plasmides

ii. Les éléments transposables

Les éléments transposables sont des séquences d’ADN (3-60 kb) capables de changer de localisation dans le génome sans jamais apparaître à l’état libre. Ils ne peuvent se répliquer mais peuvent s’insérer dans d’autres MGE ce qui permet leur transfert.

Les séquences d'insertion (IS) sont les éléments transposables les plus simples et de plus, sont de petite taille (de 750 à 2500 pb). Elles sont constituées à leurs extrémités de courtes séquences (de 10 à 40 pb) répétées inversées et portent également les gènes nécessaires à leurs transcriptions (transposases, éléments régulateurs de la transposition). Elles sont généralement présentes en multicopies dans le chromosome.

Par exemple, de multiples copies d’IS25(5 sont fréquemment retrouvées chez les S. epidermidis invasifs. La présence de ces IS pourraient jouer un rôle, via leurs insertions- excisions alternatives dans l’opéron ica, dans la flexibilité du génome des X epidermidis en leur permettant de réguler la formation du biofilm et donc de s’adapter plus rapidement aux changements de conditions environnementales (Kozitskaya et al, 2004).

Les transposons encodent, en plus des séquences répétées, les déterminants de leur transposition et d’autres fonctions telles que des gènes de résistance aux antibiotiques. Par exemple, le transposon Tn4001 encode la résistance à la gentamicine et a été décrit intégré notamment dans un plasmide de grande taille et dans certaines SCC {Staphylococcal cassette chromosome) mec.

Les cassettes chromosomiques staphylococciques (SCC) sont des éléments génétiques monocopies, insérés dans une région spécifique du génome. Ils transportent des gènes (ccr) codant pour des recombinases. Ces SCC éléments incluent également des gènes de résistance aux antibiotiques comme la cassette SCCfar, qui contient les gènes de résistance à l’acide fiicidique (Holden et al, 2004) ou la cassette SCCmec, qui confère la résistance à la méticilline (Ito et al, 2001).

séquences d’insertion (Ito et al, 1999; Katayama et al, 2000). Ces recombinases assurent les phénomènes d’intégration et d’excision de la cassette.

Il existe différents types de cassettes SCCmec qui varient en taille et en structure. Jusqu’à présent, 11 différents types de cassettes ont été décrits (http://www.sccmec.org). Elles sont classées en fonction des différentes combinaisons entre les 8 allotypes des complexes gènes ccr et les 6 classes de complexes mec jdentiflés. Le ccr est numéroté à partir de l’identification de ses gènes ccr (ccrA et ccrB ou ccrC). Par exemple le type 1 contient les gènes ccrAlBl. Les complexes mec varient en fonction de l’intégration de séquences d’insertion (IS) ou par délétion d’une partie des gènes de régulation. Par exemple, le complexe mec de classe B contient : lS431-mecA-AmecRl-lS1272. Les cassettes diffèrent par leur structure, leur taille et par leur répertoire de résistance aux antibiotiques.

Le site d’intégration de l’élément SCCmec se situe au niveau du gène orJX (open reading frame) dont la séquence est hautement conservée. L’élément SCCmec contient également 3 régions junkyard ou joining-region (J). Ce sont des régions très variables contenant des éléments non essentiels pour la cassette qui permettent de définir des sous- types de SCCmec. Il est la région située à droite de la jonction chromosomique et du complexe ccr, J2 la région située entre mec et ccr et J3 la région située entre o//X et mec (voir figure 2). Il y a clairement des preuves du transfert horizontal des cassettes SCC entre espèces de staphylocoques et il est désormais établi que les SCN, en particulier S. epidermidis, peuvent servir de réservoir de SCCmec pour S. aureus (Hanssen et al., 2004; Hanssen and Sollid, 2007).

Figure 2 Représentation schématique simplifiée de la cassette SCCmec

SCCmec

mec

ccr

2. Déterminants de pathogénicité i. Biofilm et régulations

- Définition et historique

Si le pouvoir pathogène d’une bactérie est sa capacité à provoquer une infection, les facteurs de virulence définissent l’intensité de ce pouvoir pathogène. Pour induire une infection, la bactérie doit être capable de coloniser l’hôte, d’échapper à ses mécanismes de défense et de posséder la capacité mécanique, moléculaire ou chimique de lui nuire. Or, S. epidermidis n’a pas beaucoup de facteurs de virulence et ceux qu’il possède visent surtout à échapper aux défenses de l’hôte et à survivre en milieu hostile. Les facteurs de virulence de S. epidermidis et les gènes les encodant sont détaillés dans un tableau situé dans l’annexe 1. S. epidermidis adhère facilement aux cellules épithéliales humaines et est tolérant à la salinité cutanée de la peau, ces caractéristiques facilitant la colonisation des personnes et sa survie sur la peau. Il a d’ailleurs été suggéré que S. epidermidis pourrait avoir un avantage sélectif grâce à ce manque d’agressivité (Massey et al, 2006). Ces mécanismes d’échappement au système immunitaire de l’hôte lors d’une infection à S. epidermidis sont d’autant plus délétères que le système immunitaire est déficient ou immature. Ce qui explique que chez le nouveau-né, des cas d’infections très sévères à SCN peuvent survenir. Son système immunitaire est encore immature par déficience en facteur du complément C3, en IgG et par diminution de la capacité de phagocytose et de régulation du stress oxydatif

Il présente des caractéristiques physiologiques et une architecture spécifique tridimensionnelle qui limite à la fois la diffusion et la pénétration des agents antimicrobiens mais également celles des immunoglobulines et des cellules immunitaires (Costerton et al, 1999). De plus, les bactéries à l’état sessile, par opposition aux bactéries à l’état planctonique, ont des niveaux métaboliques très bas et un taux de division cellulaire faible. Ainsi le biofilm permet à S. epidermidis d’échapper à l’activité des antibiotiques (Konig et al., 2001; Donlan and Costerton, 2002) et de contrecarrer la réponse immunitaire (Costerton et al, 2003). Compte tenu de l’hétérogénéité structurale et microbiologique au sein du biofilm, l’expression de certains gènes peut être variable en fonction de la localisation de la bactérie dans le biofilm. Cette expression différentielle résulte de nombreux facteurs parmi lesquels la limitation de la diffusion des nutriments et de l’oxygène, les variations de pH et de la concentration en métabolites bactériens (Stoodley et al., 2002; Jefferson, 2004). De plus, le biofilm, du fait de la forte densité microbienne, est propice aux échanges de matériel génétique (Davey and O'toole, 2000; Watnick and Kolter, 2000).

- Etapes de formation du biofilm

Les quatre grandes phases de développement du biofilm sont : l’adhésion réversible, l’adhésion irréversible, la maturation et enfin la dispersion des bactéries à partir du biofilm ce qui leur permet à leur tour d’initier ailleurs un nouveau cycle de formation de biofilm (voir Figure 3).

La formation du biofilm débute par un processus d’adhésion. Cette adhérence initiale est gouvernée par des interactions physico-chimiques de type forces électrostatiques, forces de Van der Waals et interactions hydrophobes entre la surface bactérienne et la surface inerte. Cette adhésion initiale est temporaire et réversible.

d’une matrice produite par l’hôte et composée de protéines plasmatiques tels que le fibrinogène, la fibronectine, et la vitronectine avec lesquelles vont pouvoir interagir les MSCRAMMS (Patti et al., 1994) telles que l’Embp {Extracellular matrix binding protein) impliquée dans l’attachement à la fibronectine (Williams et al., 2002), SdrF qui se lie au collagène ou SdrG (ou Fbe) qui se lie au fibrinogène. D’autres molécules intervenant dans cette phase ont été décrites: les acides teichoiques (Hussain et al., 2001), mais aussi des autolysines Aae (Heilmann et al., 2003) et AtlE, qui se lie à la vitronectine (Heilmann et al., 1997). Des travaux ont montré que l’ADN extracellulaire, issu de la lyse d’une partie des S. epidermidis sous l’action de l’AtlE, favoriserait cette phase d’adhésion (Qin étal, 2007).

La phase, la maturation du biofilm, implique chez S. epidermidis la production de PIA {intercellularpolysaccharide adhesin) (Mack et al, 1996; Ziebuhr et al, 2001), responsable de l’établissement du contact inter-bactérien et de l’accumulation du biofilm. La synthèse de ce polysaccharide dépend de l’expression de l’opéron chromosomique ica (intercellular adhesin) (Gerke et al., 1998; Dobinsky et al., 2003), qui comporte quatre gènes de biosynthèse icoADBC nécessaires pour une expression maximale du PIA et le gène de régulation icaR {intercellular adhesion repressor) (Fey 1999) (voir Figure 4).

La mise en évidence de souches de S. epidermidis qui ne secrétent pas de PIA mais qui sont néanmoins infectantes suggère l’existence d’autres types d’adhésines intercellulaires (Chokr et al., 2006; Kogan et al., 2006; Hennig et al., 2007; Rohde et al., 2007). En effet, l’Aap {Accumulation associatedprotein), par exemple, peut se substituer fonctionnellement au PIA comme adhésine intercellulaire (Rohde et al, 2005). Cette phase d’agrégation va conduire à l’établissement d’un biofilm mature notamment grâce à d’autres composés de surface dont la Bap/Bhp {Biofilm-associatedprotein) (Tormo et al, 2005a).

Figure 3. Les étapes de formation d’un biofïlm chez les staphylocoques Source : (Otto, 2008)

Attachment

Maturation

dissémination

spécifie (protebiJrotein): PIA

MSCRAMMs, other surface pro- (exopolysaccharide)

tôns teicfiolc acids

non-spedfic (to polymer proteins (e.g., Aap)

surfaces):

Figure 4. La synthèse de l’exopolysaccharide PIA par l’opéron ica Source : (Otto, 2012)

Légende :

IcaA, IcaC et IcaD sont 3 protéines membranaires. La protéine IcaA a une activité de giucosaminyl

transférase, facilitée en présence de la protéine icaD qui agirait comme une protéine chaperonne dirigeant

le repliement et l’insertion d’icaA dans la membrane. La protéine IcaC permet de produire de plus longues chaînes de N-acétylglucosamine que celles de 20 résidus préformés par IcaA et IcaD. Une dé-acétylation

partielle des résidus de N-acetylglucosamine est réalisée par l’enzyme IcaB localisée dans la paroi

cellulaire, ce qui contribue à la fois à l’aggrégation bactérienne et à l’évasion immunitaire (Vuong et ai,

2004).

Biofilm formation

Antimicrobial peptide résistance Inhibition of neutrophil

phagocytosis/ killing Hémagglutination

sarA

Insertion/ excision ol IS256

Systèmes de régulation du biofilm

La synthèse du biofilm est un processus variable qui fait intervenir de nombreux facteurs de régulation dont bien sûr le gène icaR, mais aussi des systèmes de régulation comme ceux du quorum-sensing (QS).

L’expression de l’opéron /caADBC dépend des conditions environnementales et est au niveau de la transcription contrôlée par 4 gènes indépendants : les facteurs sigma (o) tels que O® (Kies et al, 2001), rtcaR, le sarA (staphylococcal accessory regulator) etpurR. L’/caR, localisé en amont immédiat de l’opéron /coADBC encode un répresseur transcriptionnel de l’opéron ica mais son activité elle-même ne réprime pas complètement l’expression de l’opéron. La transcription d’7caR est, elle, réprimée par des facteurs environnementaux qui amplifient la formation du biofilm. Ainsi des températures élevées (>45)C), l’éthanol et le chlorure de sodium à forte concentration répriment l’expression d’icaR qui de ce fait n’inhibe plus l’opéron ica (Conlon et al., 2002a; Conlon et al., 2002b).

L’opéron a® est composé de quatre gènes : rjèU, rsbV, rsbW et i/gB. C’est un régulateur de transcription qui joue également un rôle crucial dans l’expression des gènes lors des changements environnementaux en inhibant la transcription d’/caR (Rachid et al, 2000). Le produit du gène rsbW dans sa forme déphosphorylée se lie compétitivement au produit du gène rsbW entrainant la libération de SigB actif et libre. C’est la phosphatase encodée par le gène riôU qui module le statut phosphorylée ou non de rsbV et donc au final l’attachement de rsbW à sigB ou à rsbV (voir Figure 5) (Wise and Price, 1995). a® joue un rôle important dans la stabilité et l’architecture du biofilm (Pintens et al, 2008).

Le gène sarA encode une protéine régulatrice transcriptionnelle positive de l’opéron ica (Tormo et al, 2005b) comme le gènepurR.

molécules « signal » utilisés par les systèmes QS sont de petites molécules appelées Autoinducers (Aïs).

Il existe chez S. epidermidis deux systèmes régulateurs QS: le système agr (accessory gene regulatof) et le système liaS. Le système agr est dit « accessoire » car il n’est pas essentiel à la croissance cellulaire mais est activé à certaines phases de la croissance de celle-ci ou lors de certaines conditions environnementales. Durant la phase initiale de la colonisation où la densité cellulaire est faible, le système agr est quasi inactif (Vuong et al., 2003) mais il va contrôler ensuite la phase de détachement du biofîlm chez S. epidermidis.

Ce système agr est une voie de signalisation à deux composants qui contrôle l’expression de nombreux facteurs de virulence. Il est composé de deux transcrits ARN II agrACDB (contrôlé par P2) et ARN III (contrôlé par P3), de l’AgrB (enzyme avec une fonction de maturation de peptides précurseurs (Aïs) et d’exportation) et d’un système de transduction à double signal AgrAC (Novick and Geisinger, 2008). Le peptide AIP est dérivé d’AgrD. L’AIP interagit avec le récepteur-senseur de la membrane cellulaire AgrC. Le senseur transmet le signal au régulateur de réponse intracellulaire AgrA qui active la transcription des promoteurs P2 et P3. Ce système à deux composants module la production de la molécule ARN III régulatrice. L’ARN III réprime l’expression des protéines de surface, essentiellement des adhésines en activant la production des enzymes de dégradation extracellulaire et stimule la synthèse d’exotoxines (voir Figure 6).

L’autre mécanisme de QS chez S. epidermidis est le système ItaS qui réprime également la formation du biofilm. La synthèse d’AI-2 est encodée par le gène luxS lors de la phase de croissance de S. epidermidis. Il agit sur la production du PIA en régulant l’opéron ica et contrôle également la production des phenol-soluble modulines (PSMs) (Li étal, 2008).

Figure 5. Représentation schématique de la régulation de la formation du biofîlm chez S. epidermidis

Source : (Mack et al, 2007)

rsbVWsiaé I

‘fcaRhJlcaADBC I

Les rectangles représentent les gènes et les ovales représentent les protéines.

Le biofilm chez les autres bactéries

De nombreuses bactéries, importantes sur le plan médical, ont fait l’objet d’études quant à leur capacité à former des biofilms. Nous pouvons citer d’autres bactéries à Gram positif, comme Staphylococcus aureus mais également des bactéries à Gram négatif comme Vibrio cholerae, Escherichia coli ou Pseudomonas aeruginosa. Parmi celles-ci, P. aeruginosa a fait l’objet d’études assez complètes et informatives sur les mécanismes moléculaires qui interviennent lors du développement d’un biofilm. La pathogénie de P. aeruginosa est très différente de celle de S. epidermidis car elle est basée sur des facteurs impliqués dans l’adhérence et la motilité et par la production d’un ensemble de toxines comme l’exotoxine A, de protéases et d’hémolysines qui provoquent des lésions tissulaires. Par contre, d’un point de vue formation du biofilm, les grandes étapes sont similaires ; cependant, quelques différences persistent :

(1) La matrice du biofilm chez P. aeruginosa ne contient pas de PIA mais est composée principalement d’alginate, un polymère d’acide mannuronique et d’acide guluronique (Parsek and Tolker-Nielsen, 2008) mais aussi de deux autres polysaccharides Psi et Pel et d’ADN extracellulaire, générée par la lyse d’une partie de la population bactérienne (Ma et al, 2009).

(2) Pendant la phase de maturation du biofilm sous l’intervention des sytèmes de QS, il y a une grande production d’exoplysaccharides mais aussi répression de l’expression des différents appendices de mobilité du Pseudomonas tels que les pilis de type IV et la flagelle.

(3) Ce sont les gènes algD, algU, rpoS et les gènes contrôlant la synthèse de polyphosphokinases qui induisent la biosynthèse de la capsule d’alginate composant majeur de la matrice du biofilm (Pulcini, 2001).

typhimurium produisent de la cellulose comme composant essentiel de leurs biofïlms (Zogaj et al., 2001).

ii. Arginine Catabolic Mobile Elément (ACMEl

Cet élément génétique mobile, qui a été décrit d’abord dans la souche communautaire résistante à la méticilline de S. aureus USA300, est présent dans la première souche de S. epidermidis, ATC 12228, dont le génome a été entièrement séquencé. Il contient 2 opérons : arc et opp3 (Diep et al, 2006). L’ACME-arc-opéron est composé de 6 gènes qui encodent différentes enzymes intervenant dans la voie catabolique de l’arginine deiminase, qui convertit l’arginine en dioxyde de carbone, carbamoyl omithine, ammonium et adénosine-5’-triphosphate (ATP) (Diep et al., 2006).

Les modes d’action exacts de l’opéron arc ne sont pas complètement compris. Cependant, différents mécanismes ont été suggérés. Premièrement, l’ammonium généré permettrait aux staphylocoques de maintenir le pH sur la peau et les surfaces muqueuses plus acides. Deuxièmement, la production d’ATP dans des conditions anaérobies pourrait jouer un rôle important dans la production d’énergie dans des environnements pauvres en oxygène (Diep et al., 2006). Enfin, l’arginine deiminase, la principale enzyme codée par l’opéron, est un facteur de virulence majeur, comme démontré par son rôle chez Streptococcuspyogenes. Elle aurait un rôle important dans l’inhibition de la prolifération des monocytes et dans la survie intracellulaire en cas d’infection par S. pyogenes (Degnan étal, 1998).

L’ACME est inséré au niveau à'orfX. à la fois chez S. aureus USA300 et dans la souche ATCC 12228 et est accompagné de séquences répétitives spécifiques. Les éléments SCCwec et leurs recombinases (ccrA/ccrB) joueraient un rôle dans le transfert de l’ACME d’une souche à l’autre (Diep et al., 2006; Goering et al., 2007; Diep et al., 2008; Miragaia et al., 2009).

Chez S. aureus, l’ACME a été initialement considéré comme un facteur de virulence important à cause de sa présence dans la souche pathologique de S. aureus USA300 (Pan et al., 2005; Gonzalez et al., 2005; Miller et al., 2005; Tenover et al., 2006) et son lien avec la résistance à la méticilline vu sa co-présence avec SCCmec au même site d’insertion orJX. Des travaux réalisés sur un modèle d’infection de lapin allaient dans le même sens en montrant qu’un mutant isogénique ACME-négatif- présentait une diminution d’aptitude à infecter (Diep and Otto, 2008). Par contre, d’autres travaux utilisant un modèle de rat avec pneumonie nécrosante ont montré que la présence de l’ACME n’était pas associée à une augmentation de la virulence (Montgomery et al., 2009). Le rôle de l’ACME n’est donc pas encore clairement défini tant chez S. aureus que chez S. epidermidis mais il interviendrait plutôt dans l’optimalisation de la colonisation de la peau et des muqueuses (Diep et al., 2008).

iii. Autres facteurs

D’autres facteurs de virulence tels que les acides poly-gamma-glutamiques (PGA) interviennent dans la modulation du système immunitaire de l’hôte et ce dans le but de permettre la survie des S. epidermidis. Les PGA, encodés par les gènes cap, sont des exopolymères qui permettent une résistance à la phagocytose des neutrophiles, qui protègent contres les peptides antimicrobiens (AMPs) et qui augmentent la survie en milieu salé. Il est intéressant de noter que les PGA sont présents chez de nombreux SCN, mais absents chez S. aureus (Rogers et al., 2009).

croissance en mileu huile-eau comme la peau et la structuration du biofilm mature. Ils deviennent facteurs de virulence en cas d’infection, avec des activités de cytolyse des polynucléaires et des érythrocytes, antimicrobienne et pro-inflammatoire (Otto, 2014).

3. Déterminants de la résistance aux antibiotiques

Les SCN forment un groupe hétérogène et les résistances naturelles vis à vis des antibiotiques sont variables selon les espèces. S. epidermidis est naturellement résistant à la polymyxine B, comme S. aureus et contrairement à S. haemolyticus, lui-même résistant à la bacitracine par exemple. Mais la multi-résistance acquise vis-à-vis des antibiotiques est fréquemment rencontrée, chez les staphylocoques, en particulier chez S. epidermidis. Les staphylocoques ont élaboré différents mécanismes de résistance en fonction des antibiotiques utilisés et de leur mode d’action et cette résistance apparait généralement d’abord chez les SCN avant d’apparaitre chez S. aureus. (Lentino et al., 2008). Par exemple, les SCN ont été les premières bactéries identifiées comme ayant acquis une résistance aux glycopeptides (Schwalbe et al, 1987). Cette résistance des staphylocoques est largement documentée depuis l’introduction des antibiotiques (Munch-Petersen and BOUNDY, 1962; Schaberg et al., 1991).

i. Déterminants de la résistance aux B-lactames

La résistance à la méticilline passe par l’acquisition du gène mecA. Les p- lactames ont pour cible des enzymes de la membrane cytoplasmique, les PBP (Protein bindingpemcillin), nécessaires à la formation du peptidoglycane pariétal, auxquelles elles se fixent d’une manière irréversible. Le gène mecA est un fragment d’ADN de 2,1 kb, codant pour la PBP 2a. Les souches résistantes expriment cette transpeptidase modifiée PBP 2a qui a une affinité réduite (ou pas d’affinité) vis-à-vis des B-lactames, ce qui entraine une résistance croisée à toute la famille des B-lactames, notamment à la méticilline, à l’exception des nouvelles céphalosporines (ceftaroline, ceftobiprole).

ii. Déterminants de la résistance aux autres familles d’antibiotiques Les Macrolides-Lincosamides-Streptogramines (MLS)

Il s’agit d’une famille d’antibiotiques composée des macrolides (tel que l’erythromycine), des lincosamides (telle que la clindamycine) et des streptogramines (type-A telle que la dalfopristine et type-B telle que la quinupristine).

Les macrolides sont constitués par un macrocycle porteur d’une fonction lactone sur laquelle vient se fixer 2 ou plusieurs sucres. Ils sont classés en fonction de la taille de leur macrocycle : à 14 atomes (érythromycine, clarithromycine), à 15 atomes (azithromycine) et à 16 atomes (spiramycine).

Les MLS inhibent la synthèse protéique bactérienne en se liant à la sous-unité SOS du ribosome bactérien et bloquent ainsi la réunion des deux sous-unités par inhibition compétitive. Il existe plusieurs types de mécanismes de résistance aux MLS chez les staphylocoques: la modification de cible (par blocage de la fixation ribosomale), le mécanisme d’efflux actif, les mutations de protéines ribosomales (Weisblum, 1995) et l’inactivation enzymatique (rare).

gènes ermK et ermC confèrent une résistance aux macrolides à 14 et à 15 atomes et diminuent également l’activité bactéricide des macrolides à 16 atomes.

Leur expression peut être de deux types :

- un phénotype constitutif: le gène s'exprime de façon permanente, rendant alors la bactérie d'emblée résistante aux MLSb et aux ketolides.

- un phénotype inductible: le gène requiert la présence de l'antibiotique pour s'exprimer. Tous les macrolides, y compris les 16 atomes peuvent être inducteurs. Cette induction peut entraîner l’apparition de mutations dans les gènes et donc l’émergence de résistances, même aux macrolides à 16 atomes et aux lincosamides. Ce phénomène participe au risque d’échec thérapeutique dans la prise en charge des infections à S. epidermidis, en particulier dans les infections ostéo-articulaires.

Le gène msrA (macrolide-streptogramin résistance) code pour un système de pompe à efflux de type ABC qui confère une résistance aux macrolides à 14 et 15 atomes et aux streptogramines type-B (Leclercq, 2002).

Le mécanisme de résistance par inactivation enzymatique, concernant surtout la résistance des Gram-, est plus rare chez les staphylocoques et a été décrit avec différentes enzymes (Lina et al., 1999).

Les aminoglycosides

Ils inhibent la synthèse des protéines en se couplant à la sous-unité ribosomale 30S. Cette fixation induit des erreurs dans le décodage des codons effectués par le ribosome et donc l’accumulation de protéines aberrantes. Le principal mécanisme de résistance est l’inactivation enzymatique des aminosides (Vakulenko and Mobashery, 2003). Les autres mécanismes sont l’altération de la perméabilité et la modification ribosomale (rare).

fonction de la réaction biochimique qu’elles catalysent mais il existe de nombreux types d’enzymes en fonction du site du cycle aminoside où la réaction d’inactivation a lieu et de nombreuses iso enzymes qui pour une même réaction catalysée ont un profil d’inactivation de substrats aminosides différent.

L’aminoside nucléotidyltransférase ANT(4’)-I (porté par le gène ant4’ ou aadC) catalyse l’adénylation; l’aminoside acétyltransférase AAC(6’)-I catalyse l’acétylation des groupements aminés et l’aminoside phosphotransférase APH(3’)-III (porté par le gène aph3’ ou aphA3) permet la phosphorylation d’un groupement hydroxyle (profil de résistance K (amikacine)). L’enzyme portée par le gène aac6’-aph2” est une enzyme bi­ fonctionnelle (avec une activité de phosphorylation et d’acétylation) portée par le transposon Tn4001 et qui confère une résistance croisée de type KTG (Kanamycine, Tobramycine, Gentamicine). Il existe en général plusieurs modifications enzymatiques par souche. Les phénotypes de résistance observés sont soit le phénotype K (résistance à la kamanycine) (APH(3’)-III), soit le phénotype KT (ANT(4’)-I), soit le phénotype KTG (AAC(6’)-I/APH(2”)).

Les tétracyclines

Elles inhibent la synthèse protéique en se couplant à la sous-unité ribosomale 30S. Deux mécanismes de résistances aux tétracyclines ont été rapportés : le mécanisme d’efflux et le mécanisme de protection du ribosome, c’est-à-dire l’inhibition de la fixation des tétracyclines sur le site ribosomal par la synthèse d’une protéine qui se fixe à leur place.

Les gènes /e/K et /e/L encodent des pompes à efflux et sont situés sur de petits plasmides pT181. Le gène /e/M, localisé sur le chromosome, encode une protéine qui se fixe sur le ribosome (protection ribosomale) et bloque l’action de la tétracycline.

L'acide fucidique

souvent au déterminant fiisB, entraînant un défaut de pénétration dans la bactérie (OTSieill et al., 2007).

Les fluoroquinolones

Elles agissent en inhibant spécifiquement la synthèse de l’ADN par le biais d’enzymes de la classe des topo isomérases, l’ADN gyrase et la topo isomérase IV. Chacune de ces enzymes est constituée de 4 sous-unités responsables respectivement, de la liaison de l’ADN (GyrB/ParE) et de l’action catalytique (GyrA/ParC). Le mécanisme de résistance le plus fréquent (par modification de la cible) est la survenue de mutations au niveau du gène parC codant pour la sous-unité ParC de la topo isomérase IV, cible d’action des fluoroquinolones. Ce type de résistance est en général de haut niveau.

Un deuxième mécanisme de résistance décrit chez les staphylocoques consiste en l’expression de pompes à efflux multiple. La surexpression d’un système d’efflux non spécifique, leNorA, induit un plus bas niveau de résistance aux fluoroquinolones.

La rifampicine

Elle agit en se liant spécifiquement à la sous-unité B de l’ARN polymérase-ADN dépendante. La résistance à la rifampicine est la conséquence de mutations sur le gène rpoB (Hellmark et al., 2009).

Les glycopeptides