Contamination primaire des salades par les microorganismes pathogènes : points critiques et leviers
Boudaud N.1, Boutteaux P.2,La Carbona S.1, Pawlak B.3
1 ACTALIA, F- 50000 Saint-Lô
2 SILEBAN, F-50760 Gatteville le Phare
3 Laboratoire Glyco-MEV, EA 4358 – Univ. de Rouen Normandie, F-76821 Mont Saint Aignan Cedex Les auteurs ont contribué à part égale à ce travail.
Avec la collaboration de l’ensemble des participants au projet PATHOGREEN : Yaelle Henaut-Raoult, Laurence Beguec, Marielle Suire, Valérie Patoux (Chambre régionale d’Agriculture de Normandie), Manon Leclerc (ACTALIA), Estelle Sonnet (ACTALIA), Wassila Riah-Anglet et Isabelle Trinsoutrot- Gattin (UniLaSalle) et Mathilde Camiade (Université de Rouen Normandie).
Correspondance : p.boutteaux@sileban.fr
Résumé
Les laitues produites en Normandie sont de bonne qualité sanitaire vis-à-vis de différents pathogènes (bactéries, norovirus ou Cryptosporidium). Ce constat a pu être établi grâce à la mobilisation de différents domaines d’expertise autour du projet Pathogreen. Ce projet a, en effet, réuni agronomes et microbiologistes autour d’une thématique aux enjeux forts pour la production agricole : la qualité sanitaire. Pour arriver à ce constat, les pratiques de production de laitues en Normandie ont été référencées et analysées au regard de différents facteurs de risque (eau, matière organique, facteurs de production, environnement et personnel). Une campagne d’analyses a ensuite été menée sur quatre exploitations, sélectionnées suite à l’analyse de leurs pratiques, et les pathogènes cibles de l’étude ont été recherchés.
Mots-clés : Salade, sécurité sanitaire, bactéries pathogènes, norovirus, Cryptosporidium.
Abstract: Primary contamination of lettuce by pathogenic microorganisms: critical points and levers
Lettuces produced in Normandy show a high level of food safety with regard to various pathogens (bacteria, norovirus and Cryptosporidium). This has been established through the implication of different areas of expertise around the Pathogreen project. Indeed, this project brought together agronomists and microbiologists around a theme with strong challenges for agricultural production i.e. food safety. Thus, lettuce production practices in Normandy were described and analyzed with regard to various risk factors (water, fertilizers, production factors, environment and staff). Sample campaigns were then conducted on four farms selected according to their agricultural practices and the target pathogens of the study were sought.
Keywords: Salad, food safety, pathogenic bacteria, norovirus, Cryptosporidium.
Introduction
Les légumes ne sont pas toujours soumis à un processus permettant d’éliminer des microorganismes potentiellement pathogènes (tel que la cuisson), aussi ils peuvent présenter un risque pour la santé en cas de contamination microbiologique. A ce jour, il est difficile d’estimer avec précision ce risque en
raison du peu de données rapportées dans la littérature. De plus, les légumes étant considérés comme des « aliments sains », ils sont plus difficilement mis en cause dans les toxi-infections alimentaires (individuelles ou collectives). Malgré cela, les informations disponibles indiquent que le danger microbiologique dans les légumes devient une problématique émergente. Deux causes peuvent être relevées : (1) la tendance est au développement d’un type d’agriculture plus respectueux de l’environnement, qui inclut l’utilisation d’amendements organiques pour les sols, augmentant par là même le risque de contamination et (2) la concentration de l’offre, particulièrement dans la grande distribution qui, à son tour, redistribue à un large nombre de magasins. Un épisode de contamination humaine collective liée à la consommation d’un aliment peut ainsi avoir un impact négatif (économique, d’image) considérable à l’intérieur de la filière. La contamination de graines de fenugrec en 2011 par une souche entérohémorragique de Escherichia coli (EHEC) de sérotype 0104:H4 en Europe et notamment en Allemagne (près de 4000 malades et plus de 50 décès) (Yeni et al., 2016 ; Callejón et al., 2015 ; Van Overbeek et al., 2014) ou la contamination de fraises congelées en 2012 par les norovirus en Allemagne (10 950 malades) font partie des épidémies alimentaires les plus médiatiques et parmi les plus importantes de ces dernières années. Elles ont perturbé la distribution pendant plusieurs semaines, d’une large gamme de fruits et légumes en France et en Europe (Made et al., 2013).
Comprendre la complexité de la contamination microbienne et réaliser son importance est le premier pas pour obtenir un produit de grande qualité avec un niveau de risque minimum. Il est possible que les résultats de bonnes pratiques obtenus dans ce projet ne soient pas applicables à tous les légumes, mais ils serviront de base d’ajustement à des mesures préventives spécifiques. Au niveau des technologies actuelles, il n’est pas possible d’éliminer le risque, mais il est important de savoir comment le maitriser, autant que possible. Il est plus économique et plus efficace de prévenir la contamination microbienne des légumes que de faire face au problème sanitaire quand il survient. Un programme réussi de sécurité sanitaire des aliments nécessite un profond engagement de la part de chaque personne sur toute la chaîne, de la production à la consommation.
Dans un contexte d’accroissement de la qualité sanitaire exigée par les secteurs de la distribution et de la restauration, la sécurisation des conduites culturales des salades vis-à-vis des microorganismes pathogènes (certaines bactéries, virus entériques et parasites) doit être garantie pour augmenter la compétitivité et la durabilité de ces pratiques légumières. Dès lors que le risque microbiologique est avéré pour les salades lors de la production primaire, des mesures préventives et des stratégies d’optimisation des pratiques culturales peuvent être mises en place pour maîtriser les risques de contamination potentielle.
Ainsi, le légume choisi comme modèle dans ce projet était la salade de plein champ. Ce produit est consommé généralement cru avec peu ou pas de transformation. Cela en fait un sujet d’étude adapté de par les risques un peu plus accrus de contamination microbiologique. Il s’agissait notamment de développer des connaissances dans le domaine des techniques de production de salades pour répondre à des enjeux de performances (compétitivité et durabilité dans le cadre de la politique nationale de transition agro-écologique) des systèmes de production légumiers et de qualité sanitaire croissante des produits. Ce programme de recherche alliant les compétences des Chambres d’Agriculture de Normandie, du SILEBAN, d’ACTALIA, d’UniLaSalle et du laboratoire Glyco-MEV de l’Université de Rouen Normandie, avait pour vocation à :
Déterminer la prévalence de microorganismes pathogènes (Salmonella, Escherichia coli productrice de shiga-toxines et potentiellement entérohémorragique, norovirus humains, parasite protozoaire Cryptosporidium) et d’un indicateur de la contamination fécale sur les salades (Escherichia coli non pathogène) en fonction de différentes conduites culturales : systèmes de production et de récolte, type d’irrigation en lien avec la vulnérabilité de la ressource en eau, type de fertilisation des sols… ;
Etudier les capacités de transfert de certains de ces microorganismes (en utilisant des modèles représentatifs) du champ à la plante en fonction des pratiques et des conditions culturales ;
Caractériser et hiérarchiser les risques de contamination microbiologique (identification des points critiques) liés aux pratiques maraîchères (qualité sanitaire des eaux d'irrigation ou de ruissellement, apports d'amendements organiques, hygiène du personnel…) ;
Proposer aux utilisateurs finaux un guide technique pour (1) la maîtrise de la sécurité sanitaire des salades et (2) des méthodes d’optimisation des pratiques culturales des salades de haute qualité sanitaire, en incluant les bonnes pratiques agricoles (BPA) et les bonnes pratiques d’hygiène (GBPH).
Les actions menées dans le projet se sont basées principalement sur la production de salades d’été en Normandie (première région de production française de salades d’été). Toutefois, les résultats obtenus sont transférables à l’ensemble des productions de salades. Ces résultats sont valorisables auprès des services techniques de la filière salade et dans les centres de formation.
1. Caractérisation et hiérarchisation des pratiques de production de salades vis-à-vis du risque microbiologique
L’objectif de cette phase du projet a été de mettre en lumière les pratiques les plus vulnérables vis-à-vis du risque sanitaire et les points critiques propres à la production de salades et de référencer quatre sites de production de salades pour la suite des travaux.
1.1 Matériels et méthodes
1.1.1 Elaboration du questionnaire d’enquête et pondération des risques
Pour établir le questionnaire d’enquête, la première étape a consisté à définir tous les éléments d’un itinéraire de production de salades du stade plant au stade récolte et d’identifier, à l’aide des microbiologistes, quelles étapes pouvaient être associées à une probabilité de contamination par les microorganismes pathogènes visés dans l’étude. Pour chaque étape de l’itinéraire de production jugée à risque, une question a été posée aux producteurs afin de connaitre la pratique associée. Nous nous sommes donc appliqués à formuler des questions fermées pour faciliter l’analyse et l’interprétation de l’enquête. Pour chaque question posée, la réponse a été affectée d’une note correspondant à une probabilité de contamination par les microorganismes pathogènes considérée à dire d’experts (échelle de 0 à 3 selon question avec 0 = probabilité la plus faible).
Les questions de l’enquête ont été regroupées par type de facteur de risque (n = 5), défini par les membres du projet : facteurs « eau », « apport de matière organique », « facteurs liés à la production »,
« environnement extérieur à l’exploitation » et « personnel ». Chacun de ces facteurs de risque a ensuite été pondéré en fonction du microorganisme pathogène considéré.
1.1.2 Classement des exploitations enquêtées
L’enquête a été menée sur quatre bassins de production de salades en Normandie : en Seine-Maritime, dans le Calvados, sur le bassin du Mont Saint Michel et dans le nord-est de la Manche (bassin du Val de Saire (VDS)).
Pour chaque exploitation, une note globale pour chacun des cinq types de facteur de risque a été calculée en faisant la somme des notes obtenues pour chaque réponse. Une note globale pour l’exploitation a ensuite été déterminée en affectant les coefficients de pondération définis pour chaque pathogène en fonction des types de facteur de risque. C’est à partir de cette note globale que les exploitations ont pu être classées. Ce classement a permis de sélectionner quatre exploitations avec des profils de risque différents qui ont servi de support pour les travaux menés dans la suite du projet.
1.2 Résultats
1.2.1 Exemple de pondération des réponses à une série de questions de l’enquête
Le Tableau 1, ci-après, rassemble les questions posées autour du facteur de risque « eau » et les différentes réponses possibles pour chacune des questions. Les questions posées étaient les suivantes :
1. Après réception des plants, ces derniers sont-ils arrosés ? Si oui, quelle est la nature de l’eau ? 2. Conduisez-vous vos cultures de salades avec de l’irrigation ? Si oui, quelle est l’origine de
l’eau ?
3. A quelle distance se situe la station d’épuration des eaux usées (STEP) la plus proche de votre exploitation ? Cette station pourrait-elle avoir un impact direct ou indirect sur vos parcelles ? 4. Quelle est l’origine de l’eau que vous utilisez pour réaliser vos traitements ?
5. Les colis de salades récoltées sont-ils arrosés après récolte ? Si oui, quelle est l’origine de l’eau d’arrosage ?
Pour chaque réponse apportée, une note a été donnée : plus la probabilité de contamination par un(des) microorganisme(s) pathogène(s) est élevée et plus la note augmente.
Tableau 1 : Exemple de pondération des réponses pour les questions en lien avec le facteur de risque « eau »
1.2.2 Coefficient de pondération affecté à chacun des microorganismes cibles du projet
Le Tableau 2, ci-après, présente les coefficients affectés à chaque facteur de risque à dire d’experts en fonction du pathogène considéré.
Tableau 2 : Coefficients de pondération affectés aux microorganismes cibles du projet selon le type de facteurs de risque considéré
Bactéries Virus Parasites
Facteurs de risque liés à l’eau 3 3 3
Facteurs de risque liés à l’apport de matière organique 1 0,5 2
Facteurs de risque liés aux facteurs de production 0.5 1 0.5
Facteurs de risque liés à l’environnement extérieur à
l’exploitation 3 0 3
Facteurs de risque liés au personnel 1 2 1
Les principales sources de contamination émanent des facteurs liés à l’eau pour les trois pathogènes de l’étude.
1.2.3 Présentation des quatre exploitations retenues
A partir du classement effectué sur la note de risque globale pour chacune des exploitations enquêtées (au nombre de 45), quatre exploitations ont été retenues pour servir de support pour le prélèvement d’échantillons de salades tout au long d’une saison de production (Tableau 3). Les critères de choix ont été les suivants : une exploitation par bassin de production normand avec un niveau de risque nuancé entre chacune.
Tableau 3 : Présentation des quatre exploitations retenues pour la suite de l’étude
Site A Site B Site C Site D
Typologie de production
Producteur 4ème gamme Laitue pommée et Iceberg de plein champ,
non irrigué Production en planches
Producteur 4ème gamme Laitue pommée de plein champ, irrigué
Production en planches
Producteur 1ère gamme Laitue pommée, batavia, feuille de chêne en plein
champ, irrigué
Producteur 1ère gamme Laitue pommée de plein champ, irrigué Production en planches
Créneau de production
Plantation : S6 à S34- 35 Récolte : S16 à S44
Plantation : S10 à S34 Récolte : S18 à S40
Plantation : S7 à S36 Récolte : S17 à S46
Plantation : S2 à S36 Récolte : S14 à S42 Certification Global Gap, Leaf Global Gap, Leaf, Mc
Donald’s Aucune Aucune
Facteur de risque eau
Pas d’irrigation des plants après réception
Pas d’irrigation en cours de culture STEP(1) à 4 km : a priori
sans impact sur les parcelles Pas d’arrosage superficiel des colis
après récolte
Pas d’irrigation des plants après réception
Eau d’irrigation et de pulvérisation issue des
forages. Pas d’irrigation pendant la
dernière semaine de culture STEP(1) à 4 km : a priori sans impact sur
les parcelles Pas d’arrosage superficiel des colis
après récolte
Pas d’irrigation des plants après réception Eau d’irrigation : eau de
forage stockée en réserve tampon non
couverte Irrigation jusqu’à 8 jours
avant récolte STEP(1) située à 500m du siège d’exploitation : a priori sans impact sur
les parcelles Arrosage superficiel des
colis après récolte à l’eau de ville au champ
Plants rarement arrosés après réception (si tel est le cas, eau du
réseau) Eau d’irrigation issue
d’une réserve (plan d’eau) Eau de pulvérisation
issue du réseau Irrigation jusqu’à récolte
si besoin Pas de STEP(1) pouvant
impacter les parcelles de production Arrosage superficiel des colis après récolte
à l’eau de ville
Facteur de risque : matière organique
Pas d’apport de fumier pour la salade, possible
en n-1 sur maïs Pas d’apport de matière
organique en cours de culture à l’exception de granulés de fientes de
volailles et de porc déshydratées
Pas d’apport de fumier pour la salade, ni les 2 années précédentes
Apport possible de matière organique en cours de culture sous forme de bouchons
mais non systématique
Pas d’apport de matière organique type fumier
Apport d’engrais organique à base de fientes sous forme de
granulés
Apport possible de fumier l’année de la production de salades
Facteur de risque : environnement
Pas d’animaux d’élevage à proximité
des parcelles de production 1 ou 2 parcelles de salades seulement à proximité desquelles peuvent être stockés des effluents d’élevage
Dégâts de gibier constatés (pigeons et
corbeaux en été)
Pas d’animaux d’élevage à proximité
des parcelles de production Pas de zone de stockage d’effluents à
proximité des parcelles de salades
Dégâts de gibier constatés (lapins, lièvres, pigeons et
corbeaux)
Pas d’animaux d’élevage à proximité des parcelles
de production Pas de zone de stockage d’effluents à proximité des parcelles
de salades Dégâts de gibier constatés (lièvres,
pigeons)
Pas d’animaux d’élevage à proximité
des parcelles de production Pas de zone de stockage d’effluents à proximité des parcelles
de salades Dégâts de gibier constatés (lièvres,
lapins, pigeons)
Site A Site B Site C Site D
Facteur de risque : facteurs de production
Utilisation de P17 sur premières plantations.
Le P17 ne ressert que sur salades Récolte dans des caisses plastique, pas de stock de caisses = gestion en flux tendu Caisses posées par
terre Pas de stockage frigo
intermédiaire Transport direct après récolte vers l’usine de
conditionnement
Utilisation de P17 sur premières plantations Récolte dans des caisses plastique, pas de stock de caisses = gestion en flux tendu Tapis de récolte à
partir de 2017 Pas de stockage frigo
intermédiaire Transport direct après récolte vers l’usine de
conditionnement
Utilisation de P17 sur premières plantations.
Le P17 ne ressert que sur salades Récolte dans des caisses plastique Caisses posées par terre
Transport frigorifique intermédiaire à 4°C
Utilisation de P17 sur premières plantations Récolte dans des caisses plastique ou colis bois récupérés.
Stockage des colis sous hangar ou à
l’extérieur Stockage frigo sur 24h
maximum à 8°C Transport sur marchés ou magasins en camion
non réfrigéré (rayons de quelques km)
Facteur de risque : personnel
Plantation semi- mécanisée en laitue
avec porteur Récolte manuelle Nettoyage du couteau par chaque utilisateur 5 réponses données en
lien avec la gestion du personnel(2)
Plantation manuelle ou semi-mécanisée (selon type de salade
et conditions météo) Récolte manuelle Nettoyage du couteau par chaque utilisateur 3 réponses données en lien avec la gestion
du personnel(2)
Plantation semi- mécanisée en laitue
avec porteur Récolte manuelle Pas de consigne donnée
en lien avec l’hygiène
Plantation manuelle avec chariot de
plantation Récolte manuelle Pas de nettoyage des
couteaux 5 réponses données en
lien avec la gestion du personnel(2) Total pour les
5 facteurs de
risque 36 66 77 86
(1) STEP : station d’épuration des eaux usées
(2) Dans l’enquête réalisée auprès des producteurs, une question permettant de recenser des pratiques relatives à l’hygiène sur les exploitations était posée. A cette question, il y avait 6 réponses possibles. La pondération a été faite sur le nombre de réponses cochées.
2. Evaluation de la sécurité sanitaire des salades sur les itinéraires techniques de référence vis-à-vis de différents pathogènes
2.1 Matériels et méthodes 2.1.1 Plan d’échantillonnage
Après avoir sélectionné les quatre exploitations dans lesquelles réaliser les prélèvements de salades pour analyse, un plan d’échantillonnage a été mis au point (Tableau 4). Celui-ci définit la matrice d’étude, ici la laitue pommée, le nombre de campagnes de prélèvement : 2 campagnes par mois de mai à octobre (soit 12 campagnes), le nombre d’échantillons analysés par campagne et par site (n = 5) et enfin la taille de l’échantillon (n = 2 salades/échantillon, soit 10 salades par lot). L’envoi des échantillons des sites de prélèvements vers les sites d’analyses a été planifié afin de pouvoir réaliser les analyses bactéries (Université de Rouen Normandie), norovirus et Cryptosporidium (ACTALIA) sur les mêmes échantillons pour l’ensemble des sites étudiés.
Tableau 4 : Calendrier de prélèvements
2.1.2 Recherche de contaminations par deux bactéries pathogènes et un témoin d’hygiène La qualification sanitaire des lots de salades, composés de cinq échantillons issus des quatre itinéraires, a été réalisée pour chaque campagne de prélèvement par application de deux procédures appelées “plan à deux classes” et “plan à trois classes” :
Le plan à deux classes, réservé aux bactéries pathogènes invasives, exclut toute tolérance de la bactérie recherchée pour une prise d’essai donnée et doit conclure à la présence ou à l’absence de la bactérie dans cette prise d’essai (ici 25 g). Les deux bactéries pathogènes choisies pour l’étude ont été Salmonella et les souches pathogènes de E. coli STEC (Shiga- Toxin producing E. coli). Elles entrent dans les critères microbiologiques définis par les normes européennes en Agro-alimentaire (Règlement (CE) No 2073/2005 de la commission du 15 novembre 2005) et sont fréquemment mises en cause dans les toxi-infections alimentaires liées à la consommation de végétaux frais (Yeni et al., 2016 ; Callejón et al., 2015 ; JO C 163 du 23.5.2017). Ces deux bactéries ont été recherchées selon un plan à deux classes. Après enrichissement de cinq échantillons par itinéraire et par campagne de prélèvement, des méthodes de détection culturale (milieu chromogène Rapid’Salmonella, Bio-Rad) et moléculaire (PCR temps réel, kits iQ Check Salmonella et STEC VirX, Bio-Rad) ont été appliquées.
Le plan à trois classes est réservé aux bactéries non pathogènes (témoins d’hygiène, par exemple) ou pathogènes non invasives. Le résultat est cette fois quantitatif, nécessite la détermination de la densité bactérienne N (UFC/g de produit) pour ensuite la comparer, avec une marge d’incertitude, à un seuil chiffré. E. coli (non pathogène), témoin classique de la contamination fécale et largement utilisée dans les normes sanitaires, a été dénombrée dans chaque échantillon composant les lots, sur du milieu Rapid’Ecoli (Bio-Rad).
La synthèse cadrée des résultats obtenus par ces deux types de procédure permet de qualifier la qualité sanitaire de chaque lot.
2.1.3 Recherche de contaminations par les norovirus humains
Dans le cadre de ce projet, les génomes des norovirus humains (GI et GII) ont été recherchés dans 25 grammes de laitue en utilisant la méthode NF EN ISO 15216-1 (2017). La méthode repose sur l’extraction des virus par élution / concentration suivie d’une extraction et d’une purification du génome des norovirus. Les limites de détection (LDD) et de quantification (LDQ) théoriques sont respectivement de 20 et 100 copies de génome viral pour 25 grammes de salades.
2.1.4 Recherche de contaminations par le parasite Cryptosporidium
Dans un premier temps, un protocole pour extraire les oocystes de C. parvum de la matrice laitue et détecter leurs ADN par qPCR en temps réel a été développé sur la base de travaux effectués dans le cadre de précédents projets (Projets PROTOFOOD (ANR-09-ALIA-009) et PARALENCE (VALORIAL Régions Basse-Normandie et Pays de Loire)). La procédure retenue pour la détection de l’ADN par qPCR présente un rendement moyen de 18 % et a permis d’atteindre une limite de quantification de 100 oocystes / 25g et une limite de détection 95 % (LD95 : quantité minimale détectée avec une probabilité de 95 %) comprise entre 50 et 100 oocystes / 25g.
2.1.5 Caractérisation de l’origine de la pollution fécale dans les salades et l’eau
La flore intestinale des humains et des animaux d’élevage comprend de nombreuses bactéries antibiorésistantes, dont beaucoup d’E. coli. C’est pourquoi une contamination de l’environnement par des rejets fécaux d’origine humaine ou animale (notamment bovine) augmente considérablement la faible population d’E. coli souvent préexistante dans les milieux naturels, et l’enrichit en souches antibiorésistantes. Les souches d’E. coli naturellement circulantes sont sensibles aux antibiotiques, alors qu’une population d’E. coli d’origine humaine (issue d’effluents de STEP ou de fosses septiques par exemple) comprendra une grande majorité de souches multi-résistantes (de 3 à au moins 12 résistances). Une population d’E. coli émise à partir de fèces d’origine bovine et pouvant être véhiculée par des eaux de ruissellement sur pâturages, contiendra également des souches antibiorésistantes, mais présentant un faible nombre de résistances (1 à 3) (Flores Ribeiro el al., 2012 ; Laroche et al., 2010).
Les profils d’antibiorésistance de 200 souches d’E. coli isolées de 23 échantillons de laitue ont été déterminés vis-à-vis de 16 antibiotiques par la méthode de diffusion sur gélose (Bonnet et al., 2013).
L’antibiorésistance de 1283 souches d’E. coli isolées d’un plan d’eau situé sur l’exploitation D a également été déterminée.
2.2 Résultats
2.2.1 Prévalence en bactéries pathogènes dans les salades sur les quatre itinéraires techniques et qualification sanitaire des lots de salades
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 5.
Plan à deux classes
STEC : Absence dans 25 g pour chaque échantillon des 48 lots analysés (240 échantillons au total).
Salmonella : Absence dans 25 g pour chaque échantillon de 47 lots analysés - Présence dans 25 g pour un échantillon appartenant à un lot qui est de ce fait déclaré « non satisfaisant » (Site A, campagne du 12 juin 2017).
Plan à trois classes
Sur 240 échantillons, seuls 28, répartis sur les sites et les campagnes de prélèvement, contenaient une densité détectable de E. coli (i.e. N ≥ 10 UFC/g). Pour 24 d’entre eux, la densité était suffisamment
faible (≤ 102 UFC / g) pour déclarer leur qualité « satisfaisante ». La qualité des quatre échantillons les plus contaminés (N compris entre 102 et 103 UFC/g) reste « acceptable » au regard du seuil microbiologique retenu (m = 102 UFC/g) et de la marge d’incertitude pratiquée dans le plan à 3 classes (acceptable jusqu’à 10m). Il faut souligner que ces quatre échantillons n’appartiennent pas au même lot (site et/ou date de prélèvements différents). Ainsi, une circulation sporadique de E. coli a pu être constatée sur les quatre exploitations choisies pour l’étude, mais cette circulation est faible et n’impacte pas la qualité bactériologique des salades (pour la période de suivi et les critères microbiologiques choisis).
Tableau 1 : Prévalence des bactéries recherchées selon un plan à trois classes (témoin de contamination fécale) ou à deux classes (bactéries pathogènes) sur les quatre sites d’étude
Site Nbr
échantillons
Plan à trois classes Plan à deux classes
Escherichia coli Salmonella STEC
N<10 10<N≤102 P (%) N>102 P (%) Nbr de
positifs P (%) Nbr de
positifs P (%)
A 60 56 4 6,7 0 0 1 1,7 0 0
B 60 55 3 5 2 3,3 0 0 0 0
C 60 49 10 16,7 1 1,7 0 0 0 0
D 60 52 7 11,7 1 1,7 0 0 0 0
Total 240 212 24 10 4 1,7 1 0,4 0 0
N : densité bactérienne (UFC/g) ; P : prévalence (%) ; STEC : Shiga-Toxin producing E. coli Le seuil de détection pour la valeur N est de 10 UFC /g.
Qualification générale des lots (intégration des résultats des plans à deux et trois classes) 47 lots sur 48 sont « satisfaisants » et 1 est « non satisfaisant » (présence de Salmonella dans 25 g pour l’un des 5 échantillons du lot). Il faut remarquer que cet isolat de Salmonella a été détecté alors que E. coli n’était présente qu’à une faible densité dans ce lot, éliminant l’hypothèse d’une contamination fécale importante.
Origine de la pollution fécale sur les salades et l’eau
Au total, 200 souches de E. coli ont pu être isolées dans 23 des 28 échantillons de laitue positifs. Dans deux échantillons (issus des sites C et D), des souches multirésistantes aux antibiotiques ont été détectées, indiquant une probable composante humaine dans l’origine de contamination (profils de résistance aux antibiotiques : AMX-TIC-CTX-CEF et AMX-AMC-TIC-TIM).1
Dans trois échantillons (issus des sites A et B), certaines souches présentent seulement quelques résistances (1 ou 2), laissant supposer une contamination plutôt issue d’animaux d’élevage (bovins ?) (profils de résistance aux antibiotiques : TIC et AMX-TIC).
Dans les 18 autres échantillons (soit dans plus de 78 % des cas), toutes les souches se sont révélées sensibles aux 16 antibiotiques testés. Pour 17 échantillons, la faible densité en E. coli conjuguée à cette absence de résistance suggère fortement que ces souches sont des E. coli naturellement circulantes dans l’environnement et que leur présence n’est pas liée à une contamination fécale particulière. Bien que toutes sensibles, les souches d’E. coli ont une densité plus élevée dans le 18ème échantillon (site C), ce qui ne nous permet pas, dans ce cas, de formuler une hypothèse forte concernant leur origine.
Un apport issu de STEP ou d’une fosse septique (origine humaine) est cependant peu envisageable Certaines souches d'E. coli présentant des résistances aux antibiotiques ont donc été isolées des laitues et certaines de ces souches pourraient provenir d'une contamination fécale humaine.
1 AMX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, TIC : ticarcilline, TIM : ticarcilline + acide clavulanique, CTX : cefotaxime, CEF : cefalotine
Enfin, au cours de la période d’étude, nous avons régulièrement échantillonné un petit plan d’eau utilisé pour arroser les parcelles de l’une des quatre exploitations (site D). Nos résultats montrent que E. coli est présente en continu dans cette mare, et parfois à un niveau non acceptable pour une fonction d’arrosage (102 à 103 UFC / 100 mL - JO C 163 du 23.5.2017). Les populations d’E. coli isolées à chaque prélèvement contiennent systématiquement des souches résistantes et, souvent, multi- résistantes aux antibiotiques. Il semble donc qu’il existe un apport variable, mais permanent, de ces souches d’origine fécale plutôt animale, avec cependant une contribution humaine assez régulière. La production en salades de ce site est cependant de qualité satisfaisante pour la période d’étude, certains des échantillons de salades analysés contenant des E. coli (8 échantillons/60), mais généralement en faible quantité et, pour la quasi-totalité, sensibles aux antibiotiques. Une souche a cependant présenté un profil de multi-résistance (parmi 65 souches d’E. coli isolées à partir des huit échantillons porteurs).
Le plan d’eau peut donc être défini comme un point critique sur cette exploitation, mais nous n’avons pas mis en évidence de lien direct récurrent entre la qualité sanitaire de l’eau qui est non satisfaisante et la qualité sanitaire de la production. Il faut cependant souligner qu’il a été difficile de s’assurer que les échantillons récupérés et analysés ont bien été arrosés par cette eau et en quelle quantité.
2.2.2 Prévalence en virus entériques (norovirus) dans les salades sur les quatre itinéraires techniques
Il est aujourd’hui bien établi que les salades sont vulnérables vis-à-vis du danger viral car elles sont soumises à diverses sources de contamination au cours de leur production : irrigation avec des eaux de mauvaise qualité sanitaire, amendements organiques insuffisamment thermisés, stockage des matières premières dans des contenants contaminés, personnel excrétant des virus (Baert et al., 2008). La prévalence en génomes de norovirus pour les salades est comprise entre 5,0 et 28,2 % (Boudaud et Gantzer, 2015). Au regard des pratiques de production des salades, la contamination est le plus souvent d’origine fécale et à un niveau moindre d’origine manuportée (EFSA, 2014). En effet, les norovirus pathogènes pour l’Homme étant spécifiquement humains, ce sont les eaux usées d’origine urbaine qui constituent la principale source de pollution (Le Guyader et al., 2000). Cette pollution virale peut être massive en période d’épidémies de gastro-entérites aiguës, notamment entre novembre et avril. Il semblerait que certains itinéraires de production et certaines variétés soient plus à risque que d’autres vis à vis du danger viral. D’un point de vue pratique, la maîtrise de la contamination virale reste complexe au niveau de la production primaire.
Sur le plan réglementaire, aucun critère n’est établi à ce jour en France et en Europe concernant la gestion des norovirus dans les aliments. Depuis 2013, des méthodes standardisées concernant la recherche qualitative et quantitative du génome des norovirus (GI et GII) et du virus de l’hépatite A (VHA) dans les aliments à risque (végétaux, coquillages, eau) ont été publiées (NF EN ISO 15216-2, 2019 ; NF EN ISO 15216-1, 2017). Le choix d’une détection du génome viral par RT-qPCR est lié au fait qu’aucune méthode robuste utilisable en routine n’est disponible pour détecter les norovirus infectieux.
Les nouvelles approches de réplication in vitro des norovirus proposées par Ettayebi et al. (2016) ou Van Dycke et al. (2019) sont prometteuses pour étudier les mécanismes de survie, de tropisme cellulaire ou encore de pathogénicité des norovirus dans les années à venir. Cependant, même si ces approches venaient à se démocratiser comme cela a été le cas pour les entérovirus, elles resteront malheureusement inapplicables pour des analyses de routine pour détecter les norovirus infectieux dans les aliments ou l’eau. En plus d’être encore très délicate et limitée à certains laboratoires spécialisés, les deux approches proposées pour détecter les norovirus infectieux sont très peu sensibles. En résumé, il n’est pas possible d’envisager à court ou moyen terme d’utiliser l’approche par culture in vitro pour rechercher les norovirus infectieux dans les aliments à risque. Toutefois, l’utilisation de cette approche sera d’une grande utilité pour valider les outils de gestion les plus appropriés.
Le principal point faible de la norme ISO 15216 concerne l’absence d’information sur le caractère infectieux des norovirus lorsque leur génome est détecté dans les aliments ou l’eau. Ce biais majeur a
pour conséquence d’entrainer le retrait potentiellement injustifié de lots du marché par application du principe de précaution dès lors que du génome de norovirus est détecté dans un échantillon, alors même que le risque sanitaire pour le consommateur n’est pas prouvé.
Dans ce projet, une prévalence de 1,7 % en génome de norovirus a été observée (Tableau 6). Par comparaison aux données de la littérature, les études décrivent une prévalence généralement comprise entre 5,0 et 28 % (Boudaud et Gantzer, 2015). Cette fréquence de contamination peut donc être considérée comme faible. Cette prévalence faible peut être expliquée par la prise d’essai qui incluait 50% de feuilles externes et 50% de feuilles du cœur, ces dernières étant probablement moins exposées à la contamination par les norovirus dont l’origine exclusivement humaine de la pollution peut être soit fécale soit manuportée (Bosch, 2007 ; Kroneman et al., 2008).
Pour trois des quatre échantillons positifs en génome de norovirus GI, E. coli a été détecté dans de faibles proportions dans les mêmes échantillons (≈ 10 à 20 UFC / g de salade). Ce résultat vient renforcer la probabilité d’une pollution fécale d’origine humaine à un moment donné de la production primaire. Il est important de souligner que le génome des norovirus détecté ne permet pas de statuer sur la présence de norovirus infectieux au sens strict du terme. En effet, il est largement admis par la communauté scientifique que le génome viral détecté par RT-qPCR peut être le reflet de la présence de virus infectieux, de virus non infectieux (capsides altérées, non-fonctionnelles) et/ou de génome viral libre. Un résultat positif ne peut donc en aucun cas témoigner de l’intégrité de la capside, ni même de celle du génome, et ne renseigne donc pas sur le caractère infectieux du virus. Il faut aussi souligner que l’absence de génome de norovirus dans les salades ne garantit pas l’absence de risque infectieux.
Il faut aussi souligner que l’absence de détection de génome de norovirus dans les aliments ne garantit pas l’absence de norovirus infectieux. En effet, le risque de faux négatifs lié à la sensibilité de cette méthode ISO a lui aussi été largement démontré. Il est essentiellement dû au faible volume analysé, au rendement d’extraction souvent faible (< 10 %) et à l’inhibition de la RT-qPCR qui contribuent à augmenter la limite de détection (≈ 10 à 100 fois supérieure à la dose infectieuse pour l’Homme).
L’utilisation de cette norme ISO en routine pour la gestion du danger à norovirus dans les aliments prête donc à discussion puisqu’elle ne garantit ni l’absence ni la présence de virus infectieux.
Tableau 6 : Prévalence en génomes de norovirus GI et GII pour les quatre itinéraires étudiés (sites A à D) (LDQ : limite de quantification)
Nombre d’échantillons
Nombre de positifs en génome viral
Prévalence norovirus GI norovirus GII
Site A 60 0/60 0/60 0 %
Site B 60 2/60 (< LDQ) 0/60 3,3 %
Site C 60 1/60 (< LDQ) 0/60 1,7 %
Site D 60 1/60 (< LDQ) 0/60 1,7 %
Total 240 4/240 0/240 1,7 %
Enfin, les génomes des bactériophages ARN F-spécifiques (FRNAPH) ont été recherchés pour ces échantillons positifs en génome de norovirus GI afin de vérifier si la contamination pouvait être associée à une pollution fécale d’origine plutôt humaine (FRNAPH-II-III) ou animale (FRNAPH-I) (Hartard et al., 2015). Aucun d’entre eux n’a été détecté, probablement en raison des faibles niveaux de détection observés pour le génome du norovirus GI (< 100 copies / 25 g) et des analyses faites a posteriori pour la recherche du génome des FRNAPH. Ceci étant, cet indicateur FRNAPH a montré ses potentialités et son intérêt pour estimer de manière indirecte la présence d’un danger à norovirus dans les coquillages bivalves vivants car ces derniers sont directement exposés à la pollution fécale d’origine humaine au niveau des zones de production conchylicoles (Hartard et al., 2018 ; Leduc et al. 2020).
2.2.3 Prévalence en parasites protozoaires dans les salades sur les quatre itinéraires techniques
Sur les 240 échantillons de laitue analysés, seul 1 échantillon s’est avéré positif en ADN de C. parvum (< LD95), soit une prévalence globale très faible de 0,4 %. L’échantillon concerné correspondait à un prélèvement effectué en mai 2017 sur le site D (score risque le plus élevé). Aucun autre pathogène (E.
coli STEC, Salmonella, norovirus), ni E. coli non pathogènes n’ont été détectés dans cet échantillon.
Les oocystes de C. parvum sont capables de survivre jusque 6 mois dans l’eau et les fèces (Robertson et al., 1992) et peuvent persister dans les fumiers et les pâturages après épandage de fumiers contaminés (Smith et al., 2014). La détection de C. parvum dans cet échantillon suggèrerait donc une pollution plutôt ancienne.
Les données disponibles dans la littérature à ce jour sur les salades et jeunes pousses, permettent de définir une prévalence moyenne dans les matières premières de 26,6 % (Min-Max = 0,6-78 %) pour Cryptosporidium. Ainsi, la prévalence de 0,4 % obtenue dans cette étude est très inférieure à la moyenne. Par ailleurs, il faut noter que la méthode utilisée basée sur la détection de l’ADN de Cryptosporidium met en évidence des oocystes infectieux, non infectieux et morts. Ainsi, la positivité de l’échantillon ne traduit pas la présence d’oocystes infectieux. Compte-tenu de la limite de détection de la méthode (entre 50 et 100 oocystes), la possibilité de faux-négatifs doit également être considérée.
Conclusion
Les résultats obtenus grâce à ces deux phases du projet ont permis de mettre en avant la bonne qualité sanitaire des salades produites en Normandie et ce dans des systèmes de production différenciés.
Le très faible niveau de prévalence des microorganismes pathogènes recherchés dans cette étude ainsi que la faible densité en E. coli non pathogène mesurée dans les laitues, ne permettent pas de hiérarchiser les facteurs de risque lors de la production primaire des salades. Seules des hypothèses quant aux sources de contamination potentielles peuvent être formulées en intégrant les données spécifiques de chacun des échantillons concernés sur les quatre sites.
Sur les 48 lots testés (240 échantillons de salades), un seul est « non satisfaisant » à cause de la détection de Salmonella dans un échantillon. Des souches de E. coli ont pu être isolées dans 11,7 % des échantillons de salades (28/240), indépendamment des sites ou des dates de prélèvement.
Certaines de ces souches sont résistantes et parfois même multi-résistantes aux antibiotiques. Sur chacune des exploitations, cette contamination reste néanmoins peu fréquente, sporadique, faible et actuellement sans impact sur la qualité sanitaire des salades si l’on se réfère aux critères microbiologiques appliqués. Cependant, la circulation de souches bactériennes entériques multi- résistantes aux antibiotiques, d’origine humaine (STEP, fosses septiques), existe et reste donc à surveiller. Le suivi microbiologique d’un plan d’eau utilisé pour l’arrosage a montré l’existence d’un point critique à ce niveau, mais l’impact direct sur la production est difficile à estimer précisément étant donné l’incertitude concernant les conditions d’arrosage de chaque plant au sein de chaque parcelle.
Quatre échantillons se sont retrouvés positifs en génome de norovirus humains, et uniquement le génogroupe GI. Cette prévalence peut être considérée comme faible au regard des données bibliographiques, soulignant une bonne qualité sanitaire des salades produites sur ces quatre sites. La présence de norovirus GI, associée à celle d’E. coli dans trois de ces quatre échantillons positifs, suggère une contamination fécale d’origine humaine (eaux usées d’origine urbaine ou fosses septiques). Il est important de souligner que le caractère infectieux des norovirus ne peut être déterminé car seul le génome viral a été recherché en raison de l’absence de méthodes de culture in vitro disponibles en routine. En raison de la faible occurrence virale, il est difficile d’identifier des points critiques spécifiques et donc de les hiérarchiser. Cependant, il est parfaitement bien démontré dans la
littérature que l’eau utilisée pour l’irrigation de ces végétaux constitue la principale source de contamination.
Seul un échantillon s’est avéré positif en oocystes de C. parvum (très faible concentration, unique microorganisme de l’étude détecté) reflétant une bonne qualité sanitaire des salades produites sur les sites de l’étude. Cette détection peut traduire une contamination fécale d’origine humaine (STEP, fosses septiques) ou bovine (épandage de fumiers bovins, présence d’élevages bovins dans l’environnement des parcelles). Dans le contexte de la parcelle concernée par le prélèvement positif, la contamination en oocystes de C. parvum d’origine humaine est peu vraisemblable. L’épandage de fumier bovin avant la plantation constitue une source de contamination potentielle et peut donc représenter un point critique. La faible prévalence ne permet pas de hiérarchiser des points critiques quant au risque de contamination par ce pathogène.
Le projet est allé plus loin en étudiant à la suite de ces travaux, la persistance de certaines bactéries et des virus du projet sur des salades en conditions contrôlées.
Il a été montré que E. coli présente des capacités d’adhésion aux feuilles de laitue et des possibilités de survie variables en fonction des souches bactériennes et de la variété végétale. Certaines des souches sont capables de coloniser efficacement la surface végétale. Les virus peuvent survivre et s’internaliser dans les salades. Ainsi, l’eau reste le vecteur principal de risque de contamination lors d’un cycle de production de salades.
Remerciements
L’ensemble des collaborateurs au projet PATHOGREEN remercie le CASDAR pour le financement des travaux menés.
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