Annales d e Toxicologie Analytique, vol. XIV, n° 1, 2 0 0 2
Dépistage urinaire : les limites de Timmunoanalyse Urine screening, limitations of immunoanalysis
Bernard CAPOLAGHI*
L a b o r a t o i r e d e Biochimie-Toxicologie, Hôpital Bel-Air, C H R M e t z - T h i o n v i l l e - 5 7 1 0 0 T H I O N V I L L E
* A u t e u r à q u i adresser la c o r r e s p o n d a n c e : Bernard C A P O L A G H I , L a b o r a t o i r e d e B i o c h i m i e - T o x i c o l o g i e , H ô p i t a l Bel-Air, C H R Metz-Thionville - B P 6 0 3 2 7 - 5 7 1 2 6 T H I O N V I L L E C e d e x Tel : 0 3 8 2 5 5 81 9 9 - F a x : 0 3 8 2 5 5 8 2 0 1 - e-mail : b c a p o @ w a n a d o o . f r
RÉSUMÉ
Le dépistage de substances psychoactives est généralement synonyme de méthodes immunologiques et de prélèvement urinaire. Il s'agit d'une part de privilégier un prélèvement biologique non traumatisant et ne nécessitant pas de compé- tences professionnelles au niveau du recueil et d'autre part de disposer d'une technique facile à utiliser transposable aisément et automatisable.
Cette adéquation théorique se heurte cependant à de nom- breuses contraintes analytiques qui limitent le champ d'ap- plication du dépistage urinaire.
Les méthodes immunologiques utilisent toute la reconnais- sance épitopique spécifique de la molécule à doser ou du chef defile de la famille à rechercher. Par contre, la méthodologie utilisée peut être très différente tant pour la nature des anti- corps utilisés que pour le choix du mode de séparation et de révélation du complexe Ag-Ac et du type de signal généré.
Cette hétérogénéité des techniques explique les similitudes et les différences observées dans le dosage ou le dépistage de substances psychoactives au sein d'une matrice biologique comme le milieu urinaire. Cette matrice non protéique peut- être considérée comme un milieu biologique de choix ; cependant, la complexité physiologique dont elle est issue induit de nombreux problèmes liés le plus souvent soit à une dilution trop importante, soit à une concentration exagérée de composés endogènes ou exogènes pouvant interférer sur les réactions immunologiques. Ces différents aspects nécessitent d'identifier clairement les incidences du choix d'une tech- nique d'immunoanalyse en milieu urinaire sur le résultat.
MOTS-CLÉS
Dépistage urinaire, Immunoanalyse, Toxicomanie.
(Reçu le 10 février 2002 ; accepté le 20 février 2002)
SUMMARY
Psychoactive drugs ' screening usually means immunological methods and urine analysis. The goal is first to propose the use of a non-invasive sample, easy to obtain even for non- professional people, and also to perform the analysis with an
automated convenient method. In fact, analytical problems limit the validity of urinary screening.
Immunological methods are based on the reaction between a specific epitope and a dedicated antibody. Of course, antibo- dies can vary in different methods (monoclonal antibodies, polyclonal antibodies,...), as can also be different the ways of detection and the separation principles. This heterogenei- ty can explain that there are similar or divergent results bet- ween all the available methods. If urine can be considered as a first choice biological matrix, it has to be noticed that this fluid can be too concentrated, too diluted, and can also accu-
mulate exogenous or endogenous compounds, able to inter- fere with the immunological reaction. The consequences are
that a perfect knowledge of the analytical performances of the immunological method used is necessary to correctly interpretate the results of a urinary analysis.
KEY-WORDS
Urinary screening, immunoassay, addiction.
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Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata/2002034
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Introduction
L a m i s e en é v i d e n c e d ' u n e c o n d u i t e addictive en milieu professionnel n é c e s s i t e u n e contribution b i o l o g i q u e p o u r la r e c h e r c h e et l'identification des substances psy- choactives i m p l i q u é e s . L a p r e u v e d e la réalité d e c o n s o m m a t i o n r e p o s e sur des techniques de confirma- t i o n a p r è s p o s i t i v i t à d e s m é t h o d e s d e d é p i s t a g e . L ' a p p r o c h e d e p r e m i è r e intention nécessite d ' u n e part d e privilégier u n p r é l è v e m e n t b i o l o g i q u e n o n traumati- sant, si p o s s i b l e n e nécessitant pas d e c o m p é t e n c e s p r o - fessionnelles au niveau du recueil, et d ' a u t r e part d e disposer d ' u n e t e c h n i q u e analytique facile à utiliser. L a r é p o n s e à cette p r o b l é m a t i q u e s'est tout naturellement orientée vers u n p r é l è v e m e n t urinaire associé à u n e m é t h o d e i m m u n o l o g i q u e .
L'urine est en effet considérée c o m m e le milieu biolo- gique d e choix, tant par sa facilité d e recueil que par ses caractéristiques physiologiques. Il s'agit en effet d ' u n e h u m e u r biologique contenant sous formes libres et conjuguées les molécules psychoactives et leurs metabo- lites pendant u n e durée généralement assez longue, liée à la métabolisation du produit (tableau I) à u n e concen- tration d é p e n d a n t e des fonctions rénales et hépatiques du sujet ainsi q u e d e sa corpulence et de son état d'hydrata- tion. L e recueil sera effectué dans u n flacon à u s a g e unique sans antiseptique, ni conservateur et conservé à 4° C. Il convient d'assurer ce recueil dans des conditions strictes d'identification et d'authenticité physiologique afin de respecter l ' a p p r o c h e qualité d e la phase pré-ana- lytique et d e n e pas induire un biais dans le résultat.
D ' a u t r e part, il est i m p o r t a n t d e se p r é m u n i r contre u n e dilution ou u n e adultération d e l ' u r i n e p a r le patient (1) en appliquant d e s règles strictes au m o m e n t du recueil et en vérifiant, Te cas échéant, l'intégrité du prélève- m e n t par la m e s u r e de la créatininurie, du p H et d e la t e m p é r a t u r e . D e la qualité du p r é l è v e m e n t d é p e n d en effet le résultat.
L'immunoanaly se
L'évolution d e l ' i m m u n o a n a l y se a p e r m i s d e disposer d e techniques i m m u n o l o g i q u e s faciles à utiliser, trans- posables et automatisables, c o m p a t i b l e s avec u n e utili- sation en routine dans le c a d r e du d é p i s t a g e urinaire.
C e s m é t h o d e s a p p a r e m m e n t simples sont en fait très c o m p l e x e s . Elles associent plusieurs étapes p o u r per- mettre l'identification du produit (2). Ainsi, après u n e reconnaissance épitopique spécifique d e la m o l é c u l e ou du chef de file d e la famille à rechercher, la m é t h o d e utilisée peut être très différente tant p o u r la nature d e s anticorps utilisés q u e p o u r le choix du m o d e d e sépara- tion et de révélation du c o m p l e x e A g - A c et du t y p e d e signal généré.
P a r a l l è l e m e n t a u x m é t h o d e s d ' i m m u n o a n a l y s e en milieu liquide p a r c o m p é t i t i o n réalisées en p h a s e h o m o g è n e ou h é t é r o g è n e ( E M I T , F P I A , C E D I A , K I M S , RIA..), d e n o u v e a u x tests i m m u n o l o g i q u e s u n i - taires sur support solide ( i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i e ) sont apparus sur le m a r c h é et c o m p l è t e n t l'offre d é d i é e au dépistage urinaire. A u niveau e u r o p é e n , le projet
«Rosita» s'est fixé c o m m e objectif l'inventaire et l ' é v a - luation de ces tests de dépistage (3).
L'hétérogénéité des techniques existantes sur le m a r c h é explique les similitudes et les différences o b s e r v é e s dans le d o s a g e ou le dépistage de substances p s y c h o a c - tives au sein d ' u n e matrice b i o l o g i q u e c o m m e le milieu urinaire. Cette matrice n o n p r o t é i q u e p e u t être c o n s i d é - rée c o m m e u n milieu b i o l o g i q u e de c h o i x ; c e p e n d a n t , la c o m p l e x i t é p h y s i o l o g i q u e dont elle est issue induit d e n o m b r e u x p r o b l è m e s liés le plus souvent soit à u n e dilution trop importante, soit à u n e concentration exa- gérée de c o m p o s é s e n d o g è n e s ou e x o g è n e s p o u v a n t interférer sur les réactions i m m u n o l o g i q u e s .
Tableau I : Elimination urinaire des stupéfiants.
Seuil de positività Temps d'élimination
(Estimation moyenne)
Cocaïne 300 ug/1
Benzoyl Ecgonine
2 jours
Opiacés 300 ug/1
Morphine
2 jours
Amphétamines 1 000 ug/1
d-Amphétamine
3 jours
Cannabis 50 ug/1
THC - COOH
2-4 jours (fumeur non régulier) Plusieurs semaines (fumeur régulier)
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Limites de l'immunoanalyse
L e s partenaires d e la réaction i m m u n o l o g i q u e , l ' a n t i g è - n e traceur et l ' a n t i c o r p s j o u e n t un rôle essentiel q u ' i l faut bien c o n n a î t r e p o u r interpréter correctement le résultat d ' u n e i m m u n o a n a l y s e . L a nature d e l ' a n t i g è n e ainsi q u e la c o n c e n t r a t i o n retenue p o u r établir u n seuil d e positivité ont u n rôle clé p u i s q u e c h a q u e résultat sera interprété en c o m p a r a n t la r é p o n s e de cette m o l é - cule à ce seuil. L a diversité d e s r é p o n s e s des différentes m o l é c u l e s d ' u n e m ê m e classe vis-à-vis d ' u n anticorps doit inciter à la p r u d e n c e d a n s l'interprétation d ' u n test i m m u n o l o g i q u e .
L a c o n n a i s s a n c e des limites du dépistage urinaire par i m m u n o a n a l y s e est d o n c indispensable à son utilisation optimale. L e s p e r f o r m a n c e s du test utilisé en termes d e sensibilité, spécificité et réactions croisées doivent être parfaitement maîtrisées en v u e d ' u n e interprétation correcte du résultat. C e s indications sont d o n n é e s par le fournisseur et doivent être c o n n u e s par le prescripteur, en particulier la nature d e s principales substances inter- férentes. L a r e c h e r c h e urinaire des opiacés et des a m p h é t a m i n e s est sur ce point très significative des erreurs d'interprétation q u ' i l faut a b s o l u m e n t éviter.
L e m é t a b o l i s m e d e s opiacés conduit à l'élimination urinaire d e la m o r p h i n e libre ou conjuguée. L'anticorps g é n é r a l e m e n t utilisé reconnaît le n o y a u m o r p h i n a n e . L e s urines c o n t e n a n t d e s m o l é c u l e s à u s a g e thérapeu- tique : c o d é i n e , c o d é t h y l i n e , p h o l c o d i n e ou des m o l é - cules d ' u s a g e illicite, 6 - m o n o a c e t y l - m o r p h i n e (meta- bolite de l ' h é r o ï n e ) seront indifféremment r e c o n n u e s d è s q u e leur concentration sera supérieure au seuil d e positivité d u test.
A l'inverse, a u c u n des m o r p h i n o m i m é t i q u e s (buprénor- p h i n e , m e t h a d o n e , d e x t r o p r o p o x y p h è n e , t r a m a d o l ) dont la structure c h i m i q u e c o r r e s p o n d à u n noyau m o r - p h i n a n e modifié n ' e n t r a î n e r a de positivité. Il y a d o n c lieu d ' i n t r o d u i r e la notion d e p r é s o m p t i o n et n o n d e certitude d e positivité. L a r e c h e r c h e d ' u n e meilleure spécificité, c ' e s t - à - d i r e u n e d i m i n u t i o n du n o m b r e de faux positifs, p e u t parfois être o b t e n u e au détriment de la sensibilité en a u g m e n t a n t la valeur du seuil de posi- tivité («cutoff»). C e fut le cas r é c e m m e n t aux Etats- unis où la S u b s t a n c e A b u s e and M e n t a l Health Services A d m i n i s t r a t i o n a relevé d e 3 0 0 à 2 0 0 0 Lig/1 le seuil d e positivité des opiacés en milieu professionnel p o u r réduire les faux positifs liés à la c o n s o m m a t i o n alimen- taire des graines d e pavot (4).
L'utilisation des trousses « a m p h é t a m i n e s » (anticorps m o n o ou p o l y c l o n a u x ) d e m a n d e la m ê m e p r u d e n c e d'interprétation (5) car les a m i n e s s y m p a t h o m i m é - tiques, les a n a l o g u e s structuraux à u s a g e thérapeutique courant c o m m e les d é c o n g e s t i o n a n t s d e voies nasales
(éphédrine, p s e u d o - é p h é d r i n e , p h e n y l p r o p a n o l a m i n e ) ou c o m m e les anorexigènes (clobenzorex, fenfluramine p e u v e n t interférer d e façon variable. P a r ailleurs, l ' é m e r g e n c e d ' a n a l o g u e s c h i m i q u e s d e l ' a m p h é t a m i n e et d e la m é t h a m p h é t a m i n e (designer's d r u g s ) c o m - plique é g a l e m e n t le p r o b l è m e et nécessite lors du dépistage l ' e m p l o i d e tests plus spécifiques (6).
Conclusion
L'utilisation d e l ' i m m u n o a n a l y s e en d é p i s t a g e urinaire est a m p l e m e n t justifiée dans la m i s e en é v i d e n c e d e conduites addictives en milieu professionnel.
C e p e n d a n t , elle nécessite u n e parfaite c o n n a i s s a n c e d e ces limites p o u r u n e utilisation o p t i m a l e . L ' i m p o r t a n c e d e s r é a c t i o n s c r o i s é e s i l l u s t r e la n é c e s s i t é d ' u n e d é m a r c h e de confirmation d ' u n résultat positif obtenu p a r u n e t e c h n i q u e i m m u n o l o g i q u e . Il convient d ' o p t e r p o u r u n e t e c h n i q u e b a s é e sur u n principe différent d e la r e c o n n a i s s a n c e épitopique et présentant u n e m e i l l e u r e spécificité p o u r u n e sensibilité au m o i n s équivalente.
L e s m é t h o d e s c h r o m a t o g r a p h i q u e s sont d o n c toutes indiquées et r e c o m m a n d é e s p o u r cette a p p r o c h e analy- tique c o m p l é m e n t a i r e .
Références
1. Dumestre-Toulet V , Verstraete A. Les adultérants des tests urinaires. Toxicorama. 1999 ; 3 : 155-66.
2. Masseyeff R. F. Principles of Immunoassays : Classification of methods. In : Methods of Immunological Analysis. VCH, Weinheim : 1993 ; 115- 33.
3. Samyn N., Areschka V , Verstraete A. Evaluation de tests de dépistage des drogues sur le terrain. Ann. Toxicol.
Anal., 2000 ; 2 : 105-15.
4. Lee RR, Shahala D.E. Changes to the cutoff levels for opiates for Federal Workplace Drug Testing Programs.
Substance Abuse and Mental Health Services Administration. Fed Register. 1995 ; 60 : 575-85.
5. Vertraete A., Van Haute I. Spécificité des immunoessais pour la détection des amphétamines. Toxicorama. 1997 ; 2 : 65-71.
6. Lekskulchai V., Mokkhavesa X. Evaluation of Roche Abusreen Online Amphetamine Immunoassay for Screening of New Amphetamine Analogues. J. Anal.
Toxicol. 2001 ; 25 : 471-5.
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