Étude de la diversité génomique de la levure d’intérêt
fromager, Geotrichum candidum
Mémoire
Vincent Perkins
Maîtrise en sciences des aliments - avec mémoire
Maître ès sciences (M. Sc.)
Étude de la diversité génomique de la levure
d’intérêt fromager, Geotrichum candidum.
Mémoire
Vincent Perkins
Sous la direction de :
Steve Labrie, directeur de recherche
Michel Frenette, codirecteur de recherche
Résumé
Geotrichum candidum est une levure dimorphique utilisée en fromagerie pour l’affinage des fromages de spécialité. Elle s’implante à la surface des fromages et utilise les constituants de la matrice fromagère (protéines, lipides, acides organiques, etc.), ce qui confère aux fromages leurs propriétés sensorielles typiques. Ces capacités technologiques dépendent toutefois de la souche. Les études récentes basées sur l’analyse phylogénétique et transcriptomique de souches de G. candidum ont révélé une diversité génétique importante au sein de cette espèce, ce qui pourrait expliquer la variabilité des capacités technologiques. Cependant, peu d’informations sont disponibles quant aux caractéristiques génétiques des souches responsables de leurs propriétés aromatisantes et fonctionnelles lors de l’affinage des fromages. La compréhension fine des activités de G. candidum est prioritaire tant pour les artisans-fromagers que pour les grandes fromageries industrielles afin de sélectionner les souches les plus performantes pour leur produit.
L’objectif principal de cette étude était de déterminer la diversité génétique entre les souches de la levure Geotrichum candidum par utilisation de la génomique comparative et de proposer une méthode moléculaire pour l’identification et la caractérisation rapide des souches. Les génomes de huit souches de G. candidum d’origine laitière ont été séquencés. Les génomes obtenus avaient une taille moyenne de 24,5 Mb et 5 230 gènes prédits. L’homologie des séquences de chaque souche a permis de les regrouper en trois groupes phylogénétiques distincts pour lesquels des gènes uniques ont pu être identifiés. Sur la base de l’analyse des séquences génomique, une méthode optimisée de génotypage par MLST a été développée et validée sur 41 souches de G. candidum. Cette méthode a permis de reproduire les résultats obtenus avec l’analyse génomique et permet une identification rapide des souches et de leurs groupements phylogénétiques. Les résultats générés dans ce projet permettront de développer des outils pour la sélection optimale des ferments d’affinages basés sur leurs capacités technologiques spécifiques. Ils serviront également à améliorer notre compréhension de la physiologie de cette levure et de décrire et optimiser l’utilisation des souches de G. candidum lors de l’affinage afin d’ultimement contrôler davantage la qualité des fromages.
Abstract
The yeast Geotrichum candidum is used in several specialty cheeses varieties, such as mold- and smear-ripened cheeses, and plays several roles during cheese ripening. Its ability to metabolize proteins, lipids and organic acids enables its growth on the cheese surface and participate to the development of organoleptic properties. By alkalinizing the surface during its growth, it also establishes suitable conditions for the growth of other ripening microorganisms. Yet, several technological abilities of G. candidum are strains dependent. However, little information is available related to the genetic characteristics that define the flavoring and functional properties of this yeast during the ripening of cheeses. A detailed understanding of G. candidum metabolic activities is a priority for both artisanal cheese makers and large industrial cheese factories in order to detect the most efficient strains for their product.
The main objective of this study was to determine the genetic diversity within the G. candidum species by comparative genomic and to propose a rapid molecular method for the identification and characterization of the strains. Eight strains of G. candidum of dairy origin was sequenced. The genomes obtained had an average of 24.5 Mb and 5,230 putative genes. The sequence homologies show that the strains divide into three distinct groups for which each contains unique genes. On the basis of the genomic sequences, a MLST method was optimized and validated for 41 G. candidum strains. This method reproduces the results obtained for the genomic analysis and allows a rapid identification of the strains and their grouping.
The results generated in this project will improve our understanding of the physiology and the utility of the G. candidum strains during the ripening of cheese to ultimately be able to better control it.
Table des matières
Résumé ... ii
Abstract ... iii
Table des matières ... iv
Liste des tableaux ... vii
Liste des figures ... viii
Liste des abréviations, sigles, acronymes ... xi
Remerciements ... xv
Avant-propos ... xvi
Introduction ... 1
Chapitre 1 – Revue de littérature ... 4
1.1 La fabrication des fromages affinés en surface ... 4
1.1.1 L’écosystème microbien des fromages affinés en surface ... 5
1.1.2 Le contrôle de l’affinage ... 7
1.2 La levure Geotrichum candidum ... 8
1.2.1 La phylogénie et la taxinomie de G. candidum ... 8
1.2.2 Les caractéristiques morphologiques de G. candidum ... 9
1.3 Les capacités technologiques de Geotrichum candidum en industrie fromagère11 1.3.1 Utilisation du lactose et du lactate ... 12
1.3.2 Utilisation des protéines et des acides aminés ... 15
1.3.3 Utilisation des lipides et des acides gras ... 18
1.4 La génétique de la levure Geotrichum candidum ... 20
1.4.1 PFGE ... 20
1.4.2 RAM-PCR ... 20
1.4.3 RAPD-PCR ... 21
1.4.4 Séquençage des ADN ribosomaux ... 23
1.4.5 MLST ... 24
1.4.6 La bio-informatique appliquée à la caractérisation des souches ... 26
1.5 Le séquençage, l’assemblage et l’analyse de génomes de levures... 29
1.5.2 L’assemblage de génomes ... 30
1.6 L’utilité de la génomique dans compréhension du rôle des levures dans l’affinage des fromages ... 32
Chapitre 2 – Problématique, hypothèse de recherche et objectifs ... 33
2.1 Problématique ... 33
2.2 Hypothèse de recherche ... 34
2.3 Objectifs ... 34
Chapitre 3 – Caractérisation génétique et phénotypique de la levure d’affinage des fromages, Geotrichum candidum. ... 35
3.1 Résumé ... 35
3.2 Abstract ... 37
3.3 Introduction ... 38
3.4 Materials and methods ... 39
3.4.1 Biological Material, Culture Conditions and Genomic DNA extraction ... 39
3.4.2 Isolation of Arthrospores, Phenotype assessment, Growth at 35°C and Assimilation of Carbon Compounds ... 41
3.4.3 Library Preparation, DNA Sequencing and Genome Assembly ... 42
3.4.4 Genomic Content Comparison ... 43
3.4.5 MLST Loci Selection ... 43
3.4.6 MLST Data Treatment and Bioinformatics Analysis ... 45
3.4.7 Phylogenetic analysis ... 46
3.4.8 Data Availability ... 46
3.5 Results ... 47
3.5.1 Colony Morphology... 47
3.5.2 Carbon Assimilation Profile ... 48
3.5.3 Sequencing, Genome Assembly and Genomic Content Comparison ... 51
3.5.4 Multilocus Sequence Typing Schemes for G. candidum ... 52
3.5.5 Evaluation of the population structure of G. candidum ... 56
3.6 Discussion ... 60
3.6.1 Phenotypic Identification and Characterization ... 60
3.6.2 Genome Comparisons and MLST Analysis ... 61
Chapitre 4 – Discussion générale ... 64
Conclusion ... 66 Annexe A Matériels supplémentaires article 1 ... 68 Bibliographie ... 74
Liste des tableaux
Tableau 1. Caractéristiques clés différenciant les espèces de Geotrichum / Galactomyces.
... 11
Tableau 2. Caractéristiques de croissance typiques de l’espèce Geotrichum candidum. .... 14
Tableau 3. Listes des composés aromatiques produits par la protéolyse des caséines par G. candidum. ... 17
Tableau 4. Composés aromatiques résultant du métabolisme des acides gras par G. candidum ... 19
Table 5. Origins and allelic profiles of the 41 G. candidum strains analysed ... 40
Table 6. Identification and origins of the Galactomyces spp. strains ... 40
Table 7. Primer sequences of 11 MLST target loci ... 45
Table 8. Carbon assimilation profile for the G. candidum/Galactomyces spp. strains ... 50
Table 9. Assembly statistics for the genome of Geotrichum candidum and Galactomyces spp. strains. ... 51
Table 10. Loci characteristics targeted in the consensus MLST scheme used to genotype 41 isolates of G. candidum. ... 56
Liste des figures
Figure 1. Schématisation des activités biochimiques survenant lors de l’affinage d’un
fromage de type Camembert suite à la croissance de P. camemberti. Figure intégralement tirée de McSweeney et al. [26]. ... 6
Figure 2. Schématisation des activités biochimiques survenant lors de l’affinage d’un
fromage à croûte lavée (Tilsit). Figure tirée intégralement de Bockelmann et al. [30]. ... 7
Figure 3. Geotrichum candidum LMA-664 observé en microscopie optique avec un
grossissement de 200x. (Morphologie coloniale intermédiaire). ... 10
Figure 4. Morphologie de souches de Geotrichum candidum et Galactomyces spp. sur milieu
de culture Yeast Glucose Agar (YEG). (À gauche) Observation macroscopique des colonies. (À droite) Observation microscopique des ascospores. (A) Filamenteuse (exemple : LMA-1028). (B) Intermédiaire (exemple : LMA-244). (C) Levuriforme (exemple : LMA-1146). ... 11
Figure 5. Catabolisme de la L-méthionine chez G. candidum. KMBA :
2-oxo-4-méthylthiobutanoate. Figure inspirée de Pracharova et al. (2018) [16]. ... 18
Figure 6. Dendrogramme obtenu avec la méthode UPGMA des profils combinés générés
avec les amorces (GATA)4 du RAM-PCR, DB18, OPA19 et OPT15 du RAPD-PCR. Figure intégralement tirée de Gente et al. (2002) [17]. ... 22
Figure 7. Comparaison de l’ADNr 18S par Neighbor-joining tree de 18 séquences complètes
de G. candidum et 36 séquences presque complètes de souches disponibles sur GenBank. Les souches du groupe 2 ont été utilisées comme groupe externe. Figure intégralement tirée d’Alper et al. (2011) [18]. ... 24
Figure 8. Arbres phylogénétiques générés par Neighbor-joining générés à partir des STs
identifiés par MLST pour des souches de G. candidum. Figure intégralement tirée (A) d’Alper et al. (2013) et de (B) Jacques et al. (2017) [20, 21]. ... 28
Figure 9. Analyse composite des 36 isolats présents dans des STs non uniques. À gauche, le
MLST 2017 généré par Neighbor-joining superposé au profil inter-LTR. Figure intégralement tirée de Jacques et al. (2017) [21]. ... 29
Figure 10. Morphology of Geotrichum candidum and Galactomyces spp. strains on YEG
culture media. (Left) Macroscopic observation of colonies. (Right) Microscopic observation of arthrospores. (A) Mold-like (example: 1028). (B) Intermediate (example: LMA-244). (C) Yeast-like (example: LMA-1146). ... 48
Figure 11. Genomic similarity of three Galactomyces spp. and eight G. candidum strains
represented by a heatmap obtained from the Euclidean distance between the normalized set of k-mers (31 bp fragments) shared between the partial genomes of Galactomyces spp. and G. candidum strains. Phenetic tree analyses were conducted in MEGA6. (Right panel) Ability of G. candidum/Galactomyces spp. strains to grow on carbon compounds. (+ for positive assimilation, - for negative assimilation and W for weak assimilation) ... 52
Figure 12. Phylogram of the MLST2019 scheme (ALA1, CDC19, SAPT4, GLN4, PGI1,
PGM2) constructed with the PhyML Maximum Likelihood method with 1000 bootstraps (bootstrap values are shown next to the main nodes) on 41 isolates of Geotrichum candidum. Phylogenetic analyses were performed with Unipro UGENE v1.31.1. ... 55
Figure 13. Estimation of the population structure of 41 G. candidum strains based on their
sequence type profile. For each of the strains, on the abscissa, the estimated contribution, on the ordinate, to its genotype from each of five hypothetical ancestral genotypes is represented by bar plot of different colors. The source of isolation of each strain is shown above the histogram: cheese strain (C), environmental strain (E), industrial strain (I), milk (M). Each color represents a lineage in the G. candidum population. Lineage 1 (60% red and 40% yellow), lineage 2 (green), lineage 3 (blue), lineage 4 (close to 60% yellow and 40% red) and lineage 5 (purple). ... 58
Figure 14. NeighborNet analysis of the combined six loci (ALA1, CDC19, SAPT4, GLN4,
PGI1, PGM2) obtained from 41 G. candidum isolates. Numbering in the figure corresponds to sequence type. Parallelogram formation indicate recombination events. NeighborNet analysis was performed with SplitsTree version 4. ... 59
Liste des abréviations, sigles, acronymes
ADN : Acide désoxyribonucléiqueADNr : ADN ribosomique
ATCC : American Type Culture Collection bp : base pairs (paires de bases)
CBS : Centraalbureau voor Schimmelcultures
CLIB : Collection de Levures d'Intérêt Biotechnologique CVS : Composés Volatils Soufrés
DMS : dimethylsulfide (Sulfure de diméthyle) DMDS : dimethyldisulfide (Disulfure de diméthyle) DMTS : dimethyltrisulfide (Trisulfure de diméthyle) KMBA : acide 4-méthylthio-2-oxobutyrique
LMA : Laboratoire de Mycologie Alimentaire Mb : Méga bases
MLST: Multilocus sequence typing (Typage par séquençage de locus multiples) MPA : Acide mycophénolique (mycophenolic acid)
MTA : S-méthyl-thioacétate MTB : S-méthyl-thiobutyrate MTIB : S-méthyl-thioisobutanoate MTIV : S-méthyl-thioisovalerate MTH : S-méthyl-thiohexanoate MTP : S-méthyl-thiopropionate MTL : méthanethiol
PCR : Polymerase Chain Reaction (Réaction en chaîne de la polymérase) PFGE : Pulsed Field Gel Electrophoresis (Électrophorèse en champs pulsés)
RAM-PCR : Random Amplified Microsatellite by PCR (Amplification aléatoire de microsatellites par PCR)
RAPD-PCR : Random Amplified Polymorphism DNA by PCR (Amplification aléatoire de polymorphismes par PCR)
SRAG : Specifically Retained Ancestral Genes (Gènes ancestraux spécifiquement retenus) ST : Séquence Type
YEG : Yeast Extract and Glucose (extrait de levure et glucose)
Je dédie cet événement marquant de ma vie à ma mère et à la mémoire de mon père qui est parti beaucoup trop tôt. À mes chers parents, qui m’ont toujours supporté, malgré les difficultés rencontrées en chemin.
Look up at the stars and not down at your feet. Try to make sense of what you see and wonder about what makes the universe exist.
Be curious.
Remerciements
Je tiens à remercier premièrement l’ensemble du laboratoire de mycologie alimentaire et plus particulièrement mon directeur de maîtrise, Steve Labrie, qui a cru en mon potentiel et m’a donné la chance de débuter un doctorat. Merci, Steve, pour ta grande humanité, ton écoute, ton soutien, tes conseils et tes encouragements tout au long de mon projet. Je souhaite également remercier notre maman du labo, Marie-Hélène Lessard, pour sa disponibilité, ses conseils, sa bonne humeur contagieuse et ses encouragements tout au long de mon parcours. Je voudrais remercier particulièrement les membres du LMA, Annick, Gabrielle, Stéphanie, Shérazade, Antony, Thomas, William, Karl, Serena, Typhaine, Julien et mes trois stagiaires, Fanny, Charlotte et Carolina. Je remercie aussi tous les étudiants en Sciences des aliments qui ont croisé ma route et qui ont contribué à ma croissance personnelle et ma culture scientifique.
Un grand merci à mes codirecteurs Éric Dugat-Bony et Michel Frenette pour leurs conseils, leurs encouragements et leurs connaissances complémentaires qui ont permis de pousser le projet encore plus loin.
Merci aux organismes subventionnaires (CRSNG et FRQNT) qui ont permis la réalisation de ces travaux. Merci à la fondation INITIA, le STELA et à l’INAF pour leur soutien financier.
Pour conclure, je souhaiterais remercier grandement maman et ma famille sans qui rien de cela n’aurait été possible. Enfin, merci à papa qui n’aura malheureusement pas eu la chance de me voir faire ma planification doctorale et graduer de ma maîtrise. Ton souvenir et ton sourire restent gravés dans ma mémoire à jamais. Merci pour tout ce que tu as pu me transmettre pendant 27 ans.
Avant-propos
Ce mémoire est divisé en cinq sections. La première section est l’introduction qui met en contexte la problématique de ce projet de maîtrise. La deuxième section consiste en une revue de littérature résumant les connaissances actuelles sur le microbiote des fromages affinés en surface et plus particulièrement sur la contribution de la levure Geotrichum candidum. Les caractéristiques physiologiques, morphologiques et génétiques de cette levure sont présentées en portant une attention particulière à son rôle dans l’affinage des fromages dont ses capacités sont souches dépendantes. La grande diversité génétique entre les souches est présentée en résumant les différentes études de biologie moléculaire qui ont permis de mettre en évidence cette observation. La nécessité d’explorer plus en profondeur la diversité génomique des souches de G. candidum est ainsi mise en évidence par l’utilisation des outils de biologie moléculaire et par les outils de génomique comparative. La troisième section présente la problématique de recherche, l’hypothèse et les objectifs de ce projet de maîtrise. Le chapitre 3 est écrit sous forme d’article scientifique en anglais et présente les résultats obtenus lors de ce projet de maîtrise. L’article a été publié dans la revue Frontiers in Microbiology (mai 2020). L’auteur de ce mémoire a réalisé la majorité du travail expérimental concernant la génétique, a effectué la majorité des analyses et la rédaction de l’article scientifique. Dans le cadre de cet article, les résultats du projet de maîtrise de Stéphanie Vignola (M. Sc.) ont été complémentés par des analyses génétiques. La Dre Marie-Hélène Lessard a cosupervisé le travail et participé activement à la correction du mémoire et des articles. Les Drs Michel Frenette et Éric Dugat-Bony ont cosupervisé le travail, participé activement à la correction du mémoire et des articles. Le Dr Steve Labrie a obtenu les fonds de recherche, a supervisé le travail et a participé activement à la révision du mémoire et de l’article.
Le chapitre 4 présente une discussion générale mettant en lumière les principales réalisations de ce projet de maîtrise et leur contribution à la compréhension de la diversité entre les souches de G. candidum. Finalement, la dernière section présente les conclusions du projet ainsi que les perspectives d’avenir pour l’étude de la levure G. candidum.
Les résultats de l’article ont été présentés sous forme d’affiche scientifique intitulée « Development of an optimal genotyping MLST scheme for the characterization of the cheese ripening yeast Geotrichum candidum » lors du colloque STELA (Québec, Canada) et du congrès annuel de l’American Society for Microbiology (San Francisco, États-Unis) en 2019. Également, ce projet de maîtrise a été présenté lors d’une conférence au colloque STELA en 2019 (Québec, Canada).
Introduction
Depuis quelques années, les fromages de spécialité canadiens gagnent en popularité auprès des consommateurs. Entre 2009 et 2017, la production canadienne de fromages de spécialité a augmenté d’environ 76 % [1]. Les fromages de spécialité ou affinés (classe de fromages qui exclut le Cheddar, le Cottage, le fromage fondu, le Mozzarella et le fromage à pizza) se définissent comme étant des fromages acquérant des caractéristiques organoleptiques suite à l’action d’enzymes provenant de l’écosystème microbien qui les composent [1]. Par exemple, l’affinage des fromages à pâte molle affinés en surface (Brie, Camembert) dépend de la synergie entre Penicillium camemberti et Geotrichum candidum [2, 3]. Selon le Répertoire des fromages canadiens, plus de 1 050 variétés de fromages de spécialité sont produites au pays [1].
La production des fromages de spécialité découle d’une succession des microorganismes présents dans le microbiote du produit. Des bactéries lactiques (BL) sont ajoutées au lait en combinaison avec une enzyme (la présure) ce qui mène à la coagulation des caséines du lait [2]. Ces BL consomment le lactose et produisent de l’acide lactique, ce qui abaisse le pH, tandis que la présure coupe spécifiquement le lien peptidique en position 105-106 de la caséine κ [2]. La combinaison du métabolisme des BL et de la présure facilite la précipitation des caséines et forme le caillé [4, 5]. Une fois le caillé formé, celui-ci est égoutté et démoulé, puis le microbiote indigène du lait, les ferments d’affinage et le microbiote secondaire se développent à la surface et dans la masse du fromage [2, 6]. Les ferments d’affinage sont ajoutés au lait avant la formation du caillé ou pendant le procédé d’affinage, alors que le microbiote secondaire provient du lait ou de l’environnement fromager et n’est pas ajouté de façon volontaire au fromage affiné [2]. La combinaison des microorganismes présents est responsable de la production des caractéristiques organoleptiques spécifiques au fromage (goût, texture, saveur) de par leur catabolisme des constituants du fromage [7]. Sur les fromages affinés en surface, les levures et les moisissures, notamment G. candidum, D. hansenii, K. lactis, P. camemberti, sont responsables, entre autres, de l’augmentation du pH par la consommation du lactate et la production d’ammoniaque par désamination des acides aminés [3, 7-11]. Cette alcalinisation de la surface du fromage permet ensuite la croissance de bactéries
acido-sensible (par exemple Brevibacterium spp. et Glutamicibacter spp.), ce qui crée un écosystème dynamique, en constante évolution [3].
G. candidum est une levure dimorphique ubiquitaire dans l’environnement dont certaines souches présentent des caractéristiques intéressantes en biotechnologie alimentaire, notamment comme ferment d’affinage en fromagerie [3]. Utilisée depuis environ une cinquantaine d’années, puisque considérée comme étant nuisible auparavant [12], G. candidum est maintenant reconnue pour sa capacité à compétitionner contre les contaminants (Mucor spp.) [3], à inhiber la croissance de certains pathogènes (Listeria monocytogenes) [13] et à alcaliniser et produire des composés précurseurs de flaveurs par ses activités cataboliques (protéolyse, lipolyse, glycolyse) [3, 10, 14, 15]. Cette levure s’établit rapidement à la surface des fromages en plus d’alcaliniser la surface de celui-ci par la consommation du lactate et la production d’ammoniaque suite à la désamination d’acides aminés. Également, cette activité protéolytique permet de réduire l’amertume des fromages (ex. Camembert), par le catabolisme de peptides amers et de produire des composés précurseurs de flaveur par son habileté à cataboliser les acides aminés contenant du soufre comme la méthionine et la cystéine en composés volatils soufrés (CVS) qui vont conférer des goûts caractéristiques aux fromages affinés [3, 16]. Cependant, les capacités biotechnologiques (protéolyse, lipolyse) de G. candidum sont dépendantes de la souche et son contrôle comme ferment d’affinage par les fromagers est encore aujourd’hui difficile. Les souches sont généralement sélectionnées de façon empirique en fonction de leurs phénotypes et de la variété de fromage à produire [3]. Bien que G. candidum soit utilisée de façon volontaire comme ferment d’affinage depuis quelques décennies et que certaines activités biochimiques soient bien démontrées (protéolyse, lipolyse), peu d’informations sont disponibles quant à l’impact des caractéristiques génétiques des souches sur leurs propriétés aromatisantes et fonctionnelles lors de l’affinage des fromages. De plus, cette levure étant retrouvée dans des habitats divers, des variations intraspécifiques sont observables au niveau des caractères morphologiques et génétiques, rendant ainsi difficile sa classification phylogénique par la microbiologie classique [17, 18]. Ainsi, la compréhension fine des activités de G. candidum est prioritaire tant pour les artisans-fromagers que pour les grandes
fromageries industrielles afin de sélectionner les souches les plus adaptées pour leur produit.
À ce jour, une seule ébauche de génome est disponible et annotée pour cette espèce, soit la souche CLIB 918 (ATCC 204307) [19]. Malgré le peu de génomes disponible, des outils génétiques (schémas MLST) ont été développés afin de regrouper les souches similaires ensemble à l’aide du séquençage de certains gènes essentiels qui sont conservés chez toutes les souches [20, 21]. Également, quelques études de métatranscriptomique portant sur l’écosystème d’affinage de différents fromages, où G. candidum était une composante majeure, ont été réalisées et ont permis de modéliser les voies métaboliques et d’identifier certains gènes exprimés au cours de l’affinage [22-25]. Une étude ciblée de transcriptomique a également été réalisée afin d’identifier les gènes participant à la première étape du catabolisme de la méthionine, activité métabolique d’intérêt majeur chez G. candidum en fromagerie [16].
Ce projet de maîtrise s’intéresse au développement d’un outil (Multilocus Sequence Typing, MLST) pour la classification et la sélection optimale des ferments d’affinages. De plus, l’étude des génomes de plusieurs souches distinctes est présentée dans l’objectif d’améliorer notre compréhension de la physiologie et de l’utilité des souches de G. candidum lors de l’affinage. Ce projet s’inscrit dans une vision globale visant à produire des fromages de spécialité rencontrant les plus hauts standards de qualité, et ce de façon constante.
Chapitre 1 – Revue de littérature
1.1 La fabrication des fromages affinés en surface
Le fromage est un aliment à base de lait retrouvé partout à travers le monde et qui peut être fabriqué à partir du lait de plusieurs mammifères, dont les vaches, les brebis, les chèvres et les bufflonnes. Le lait est composé majoritairement d’eau, de protéines, de lipides, de lactose et de plus d’une centaine de composantes en plus faible concentration dont le phosphate de calcium qui est très important en fromagerie [2]. Selon le fromage à produire, le lait peut être utilisé sans traitement thermique (cru), à la suite d’un traitement de thermisation ou encore après une pasteurisation. Le traitement thermique modifiera la composition microbiologique du lait de départ, cependant, quelle que soit la variété de fromage fabriquée, certaines étapes de base sont communes à l’ensemble des fromages. Selon l’animal d’où provient le lait, le microbiote indigène sera différent et les traitements thermiques visent à réduire le risque pathogène [2, 6].
Après la sélection du traitement thermique, dans la majorité des cas, le lait est standardisé en protéines et en matières grasses. Dans plusieurs technologies fromagères, la coagulation du lait est réalisée par l’addition de bactéries lactiques, par l’ajout de la présure ou, le plus souvent, par le mélange des deux par une coagulation mixte. Ainsi, des souches de bactéries lactiques (Lactococcus spp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus spp.) sont ensemencées seules ou en mélange dans le but d’acidifier le lait à la suite de la fermentation du lactose en acide lactique, ce qui mène à la coagulation des caséines lorsque le pH atteint 4,6 [2, 26]. Pour aider à la coagulation des caséines, la présure (chymosine) peut être ajoutée [2]. La présure coupe spécifiquement le lien peptidique en position 105-106 de la caséine κ ce qui déstabilise la micelle de caséine et permet la coagulation [2]. Suivant la coagulation des caséines, le gel est coupé et chauffé afin d’expulser le lactosérum et raffermir la matrice fromagère. Puis, le caillé est salé selon un procédé qui variera en fonction de la variété de fromage, soit par saumurage ou par salage à sec. Finalement, l’étape de l’affinage ou de maturation du fromage est la phase où les propriétés organoleptiques du fromage se développent par les activités métaboliques des microorganismes d’affinage [2, 6]. Lors de la période d’affinage, qui peut durer de quelques semaines à plusieurs années, les microorganismes indigènes du lait ayant survécu
au traitement thermique ou provenant de l’environnement fromager peuvent se développer et contribuer aux développements des flaveurs. Ces microorganismes sont principalement des microorganismes mésophiles tels que les Lactobacillus thermophiles., Pediococcus spp. et les Micrococcus spp. Par contre, des microorganismes spécifiques peuvent également être ajoutés volontairement au fromage à titre de ferments d’affinage, comme la moisissure Penicillium camemberti pour la fabrication de fromage à croûte fleurie et Geotrichum candidum pour les fromages à croûte lavée [2].
Pour le Camembert commercial, les spores de P. camemberti sont ajoutées au lait en même temps que les ferments lactiques puis une fois le coagulum égoutté, le fromage en devenir est salé par trempage dans une saumure. Ensuite, le fromage est placé dans une chambre d’affinage ventilé et à 12 °C pour 10-12 jours ce qui permet la croissance du mycélium qui constituera la croûte. Les fromages sont ensuite emballés et une étape finale d’affinage est ensuite effectuée pour à 4 °C et ce jusqu’à leur fin de vie [2]. La Figure 1 présente schématiquement les réactions biochimiques qui surviennent lors de l’affinage d’un fromage à croûte fleurie [26].
1.1.1 L’écosystème microbien des fromages affinés en surface
Les fromages affinés en surface se divisent en deux grandes classes : les fromages à croûtes fleuries et les fromages à croûtes lavées. Ils sont souvent fabriqués à partir de lait de vache acidifié à l’aide de bactéries lactiques qui fermentent le lactose en lactate. La formation de la croûte de ces fromages résulte en partie des changements physico-chimiques à la surface de produit, mais également à la suite des interactions au sein du microbiote de surface [12, 27]. Les premiers microorganismes à coloniser la surface de ces fromages sont les levures Debaryomyces spp., Kluyveromyves spp. et G. candidum tandis que la moisissure P. camemberti sera observée après 6-7 jours d’affinage, dans le cas des croûtes fleuries [2]. Sur les fromages à croûte lavée, l’activité métabolique des levures permet de neutraliser le pH en surface du fromage et favorise ensuite la croissance de bactéries aérophiles telles que les microcoques (Micrococcus spp., Staphylococcus equorum, etc.) et les corynéformes (Brevibacterium aurantiacum, Arthrobacter nicotianae, etc.) [2, 28-30].
Plus spécifiquement, les fromages à croûtes fleuries sont généralement de type pâte molle avec une croûte blanche produite par les mycètes se développant à leurs surfaces et formant un mycélium blanc principalement engendré par le champignon P. camemberti (Fig. 1) [26]. De par leurs activités métaboliques respectives (glycolyse, protéolyse, lipolyse), les levures et moisissures se développant à la surface des fromages contribuent à l’assouplissement de la texture et au développement des arômes spécifiques aux fromages à croûte fleurie [11].
Figure 1. Schématisation des activités biochimiques survenant lors de l’affinage d’un
fromage de type Camembert suite à la croissance de P. camemberti. Figure intégralement tirée de McSweeney et al. [26].
Quant à eux, les fromages à croûtes lavées, comme le Livarot ou le St-Paulin, sont des fromages à pâte molle, semi-ferme ou ferme qui ont un microbiote plus hétérogène que celui des fromages à croûtes fleuries. Cette hétérogénéité confère des flaveurs particulières dues à la croissance d’un microbiote secondaire qui est constitué des microorganismes ajoutés volontairement ou qui proviennent de l’environnement d’affinage [2, 30-32]. La formation de la croûte de ces fromages débute aussi par l’implantation de mycètes (G. candidum, D. hansenii, K. lactis, etc.) qui catabolisent le lactate produit par les BL ce qui résulte en une alcalinisation en surface du caillé. La neutralisation du pH en surface du fromage permet ensuite la croissance de microorganismes acido-sensibles dont des Leuconostoc spp. dans le cas des fromages néerlandais, des Propionibacterium dans les fromages suisses ou Brevibacterium aurantiacum et Glutamicibacter arilaitensis qui
participent à la coloration orangée de la croûte de certains fromages [2, 12, 33-35]. Ces fromages sont dits à « croûtes lavées », car tout au long de l’affinage, ils sont frottés avec une solution saline (additionnée ou non de ferments d’affinage) permettant d’uniformiser la croissance des microorganismes à la surface et en créant des conditions propices à leur développement [2, 36, 37]. Également, il est à noter que la période d’affinage est beaucoup plus longue pour les fromages à croûte lavée que les fromages à croûte fleurie. Par exemple, pour le Limburger, un fromage belge, la période d’affinage est de 5-11 semaines [2]. La Figure 2 présente les réactions biochimiques survenant lors de l’affinage d’un fromage à croûte lavée de type Tilsit [30].
Figure 2. Schématisation des activités biochimiques survenant lors de l’affinage d’un fromage à croûte lavée (Tilsit). Figure tirée intégralement de Bockelmann et al. [30].
1.1.2 Le contrôle de l’affinage
Puisque la production et l’affinage d’un fromage découlent des interactions au sein d’un écosystème microbien, des variations de la qualité entre les lots peuvent être observées à la suite du développement inégal de cet écosystème d’un lot de fromage à l’autre [2]. Ces
défauts peuvent se présenter sous différentes formes, incluant un problème de pigmentation de la croûte [2, 38], la présence d’amertume ou de flaveurs indésirables [39], la croissance de microorganismes pathogènes ou d’altérations [2, 40] ou encore, la présence de toxines et d’amines biogènes [3, 41].
Afin de contrôler l’écosystème microbien responsable de l’affinage des fromages, il est possible de modifier les paramètres abiotiques tels que la température, la salinité du caillé, l’activité de l’eau (Aw) pour favoriser la croissance des microorganismes désirés et inhiber la croissance des microorganismes non désirés [2].
1.2 La levure Geotrichum candidum
G. candidum (téléomorphe Galactomyces candidus) est une levure dimorphique ubiquitaire. Elle a été isolée à la surface de fruits (ex. tomates) [42, 43], dans des ensilages et dans les environnements laitiers (le lait, la crème et le fromage) [14, 44, 45]. Elle peut également être retrouvée dans le microbiote pulmonaire et intestinal humain et certaines sources mentionnent qu’elle pourrait être un pathogène opportuniste chez les personnes immunodéprimées ou ayant des conditions de santé graves [46-48]. Du fait de leurs capacités à métaboliser une vaste gamme de composés (protéines, lipides, acides organiques, etc.), certaines souches démontrent des propriétés d’intérêt en biotechnologie, dont en fromagerie où elles sont employées comme ferment d’affinage [3, 49, 50]. Cette levure étant retrouvée dans des habitats divers, des variations des caractères morphologiques et génétiques sont observées au sein de l’espèce (entre les souches) et sont le reflet de leur adaptation [17, 51, 52].
1.2.1 La phylogénie et la taxinomie de G. candidum
Au niveau taxinomique, G. candidum se situe à la frontière entre les moisissures et les levures. Initialement considérée comme une moisissure, G. candidum est classée comme une levure depuis plus d’une trentaine d’années [53]. G. candidum (téléomorphe :
Galactomyces candidus) appartient au phylum des Ascomycota, à la classe des Saccharomycetes et à l’ordre des Saccharomycetales [3, 54]. L’utilisation des outils de biologie moléculaire comme le séquençage des génomes complets et des analyses phylogénétiques de gènes conservées ont permis de montrer que Geotrichum candidum est phylogénétiquement proche des levures Yarrowia lipolytica, Candida albicans, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis, C. glabrata et S. cerevisiae [55]. Le genre Geotrichum est composé de 22 espèces, dont 10 nouvelles espèces (sp. nov.) [56]. Malgré la diversité phylogénétique élevée entre les différentes espèces de Geotrichum, leurs lieux d’isolement restent similaires [57].
1.2.2 Les caractéristiques morphologiques de G. candidum
G. candidum est une levure qui présente une structure d’hyphes formés par des ascospores rectangulaires (Fig. 3). Les hyphes formés dans les colonies de G. candidum sont dichotomiquement ramifiés et les ascospores sont formées par la rupture d’hyphes matures et non par bourgeonnement tel qu’observé pour d’autres levures [57]. Ses ascospores sont pourvues d’une membrane interne échinée et d’une paroi cellulaire composée d’un exosporium irrégulier [46]. Celles-ci peuvent être de forme cylindrique, ellipsoïde ou en forme de tonneau avec une taille variant de 2-6 x 3-25 µm [57].
Le dimorphisme de G. candidum s’observe en trois phénotypes lorsque la levure est cultivée sur milieu gélosé. Les phénotypes levuriforme et filamenteux présentent respectivement des colonies d’allure de levure (crémeuses et lisses) et de moisissure (duveteuses et filamenteuses) (Fig. 4). Le troisième phénotype est un continuum entre les deux autres phénotypes [3]. G. candidum n’est pas la seule levure à posséder des caractères dimorphiques. Plusieurs levures, dont Candida albicans et Yarrowia lipolytica peuvent se retrouver à l’état filamenteux ou levuriforme selon les conditions environnementales [58, 59]. En industrie fromagère, les souches de morphologie levuriforme et filamenteuse sont généralement utilisées pour l’affinage de fromages à croûte lavée et à croûte fleurie, respectivement [3].
Figure 3. Geotrichum candidum LMA-664 observé en microscopie optique avec un
grossissement de 200x. (Morphologie coloniale intermédiaire).
L’espèce Geotrichum candidum (téléomorphe Galactomyces candidus) se distingue des autres Galactomyces par un ensemble de capacités métaboliques tel que l’assimilation du ribitol, du D-mannitol, du D-glucono-1,5-lactone, par sa capacité à croître à 35 °C et à produire ses propres vitamines (Tableau 1) [54]. Les souches de G. candidum sont capables de croître sur une large gamme de température et de pH allant de 5 à 35 °C avec un optimum à 25 °C et de pH 2,5 à 8,1 avec un optimum entre les pH 5,0 et 5,5 [56, 57]. Contrairement à d’autres levures laitières, G. candidum a une faible résistance au sel où seulement 1 % de NaCl mène à une légère diminution de sa croissance tandis qu’à 5-6 % de NaCl sa croissance est inhibée [57]. Finalement, la majorité des souches de G. candidum isolées d’environnement fromager sont capables d’assimiler le glucose, le galactose, le sorbose, le xylose, le glycérol, le succinate et le lactate. D’autre part, l’utilisation du citrate est dépendante de la souche et le lactose n’est pas métabolisé par cette espèce [57]. Le Tableau 2 présente les caractéristiques de croissance décrivant spécifiquement l’espèce G. candidum [54].
Figure 4. Morphologie de souches de Geotrichum candidum et Galactomyces spp. sur
milieu de culture Yeast Glucose Agar (YEG). (À gauche) Observation macroscopique des colonies. (À droite) Observation microscopique des ascospores. (A) Filamenteuse (exemple : LMA-1028). (B) Intermédiaire (exemple : LMA-244). (C) Levuriforme (exemple : LMA-1146).
Tableau 1. Caractéristiques clés différenciant les espèces de Geotrichum / Galactomyces.
Tableau traduit de l’anglais et tiré de de Hoog et al. (1977) [54].
1.3 Les capacités technologiques de Geotrichum candidum en industrie fromagère
La capacité des souches de G. candidum à métaboliser les protéines, les lipides, les acides organiques et autres composés de la matrice fromagère leur permet de croître rapidement
Espèce Ribitol D-Mannitol D-Glucono-1,5-lactone 35 ℃ Sans vitamine
G. candidus v + + + + G. citri-aurantii + + v - -G. geotrichum - + + - + G. pseudocandidus - - - v + G. reessii - - - v -Croissance
à la surface des fromages et de contribuer au développement des propriétés organoleptiques de ceux-ci. Cependant, les capacités technologiques de cette levure d’affinage sont dépendantes de la souche selon leur lieu d’isolement [3, 14]. Les souches de G. candidum utilisées en fromagerie sont généralement sélectionnées de façon empirique en fonction de leurs phénotypes et selon la variété de fromage à produire [3, 60]. Les prochaines sections détaillent les caractéristiques métaboliques de G. candidum.
1.3.1 Utilisation du lactose et du lactate
Le lactose, sucre principal retrouvé dans le fromage, est métabolisé par les ferments en début d’affinage. Il a été observé que le ferment lactique Lactococcus lactis métabolise le lactose en lactate dès la première journée d’affinage par la voie du tagatose [24]. Dans cette voie, le lactose est internalisé par une protéine de transport transmembranaire spécifique au lactose, mais dépendante du phosphoénolpyruvate. Lors de l’internalisation, le lactose est phosphorylé (lactose-6-P) puis catabolisé en glucose et en galactose-6-P. Le glucose entre directement dans les voies de la glycolyse et du pentose phosphate tandis que le galactose-6-P entre dans la voie du tagatose qui le catabolisera jusqu’en glycéraldéhyde-3-P qui entrera dans les voies de la glycolyse et du pentose phosphate [24]. Le lactose peut également être métabolisé par la levure Kluyveromyces lactis qui utilise d’autres voies métaboliques pour sa dégradation. Dans cette levure, le lactose est premièrement internalisé par une perméase du lactose. Ensuite, le lactose est catabolisé en glucose et en galactose par une β-galactosidase. Le glucose est directement utilisable dans les voies de la glycolyse et du pentose phosphate tandis que le galactose passe par le sentier de Leloir afin d’être catabolisé en glucose-6-P qui entre dans les voies de la glycolyse et du pentose phosphate ensuite [24].
G. candidum est capable de croître sur le fromage et dans le lait, mais elle est incapable de cataboliser le lactose [3]. Cependant, cette levure peut utiliser le galactose, l’un des deux sucres constituant le lactose après son hydrolyse par un autre microorganisme de l’écosystème. G. candidum peut également métaboliser le lactate produit par les ferments lactiques et l’utiliser comme source de carbone et d’énergie à l’aide d’une protéine membranaire, transporteur de lactate, et de L et D-lactate déhydrogénase [3, 14, 24]. Le lactate est un acide organique ne pouvant être directement fermenté. Ainsi, les lactates
déhydrogénases le métabolisent en pyruvate qui peut être catabolisé en acétyl-CoA pour entrer dans le cycle de Krebs ou métabolisé par la voie de la gluconéogenèse en sucre fermentescible, grâce aux enzymes phosphoénolpyruvate kinase et fructose-1,6-bisphophatase, pouvant être utilisées dans le métabolisme central [25]. Ces deux enzymes sont essentielles pour le métabolisme du lactate par les levures et moisissures et il a été observé qu’elles sont le plus exprimées au cours des deux premières semaines de l’affinage [24, 25]. En fromagerie, le métabolisme du lactate par G. candidum aide à alcaliniser la pâte du fromage. Cette augmentation du pH de la pâte permet ensuite la croissance de microorganismes acido-sensibles [2, 3].
Tableau 2. Caractéristiques de croissance typiques de l’espèce Geotrichum candidum. Fermentation Glucose v Lactose - Galactose v Raffinose - Sucrose - Trehalose - Maltose -
Croissance en milieu liquide
Glucose + D-Ribose - Inuline - Méthanol - Sucrose - Éthanol + Raffinose - Glycérol + Mélibiose - Érythritol - Galactose + Ribitol v Lactose - Galactitol - Tréhalose - D-Mannitol + Maltose - D-Glucitol + Mélézitose - myo-Inositol - Méthyl-α-D-glucoside - DL-Lactate +
Amidon soluble - Succinate +
Cellobiose - Citrate v Salicine - D-Gluconate - L-Sorbose + D-Glucosamine - L-Rhamnose - N-Acétyl-D-Glucosamine nd D-Xylose + Hexadécane nd L-Arabinose - Nitrate -
D-Arabinose - Sans vitamine +
Tests de croissance additionnels
Arbutine - 35 °C +
Xylitol - 37 °C v
D-Glucono-1,5-lactone + 40 °C -
Positif (+) ; Variable (v) ; Négatif (-), Non disponible (nd). Tableau intégralement tiré de de Hoog et al. (2011) [54].
1.3.2 Utilisation des protéines et des acides aminés
L’une des caractéristiques intéressantes de G. candidum en fromagerie est la forte activité protéolytique exprimée par certaines souches qui est directement liée à la croissance du mycète [3, 61]. Il a été démontré que G. candidum, bien que moins protéolytique que Penicillium camemberti, participe à la protéolyse primaire et secondaire des fromages de spécialité, notamment par l’hydrolyse des caséines β et αS1 et par la dégradation de peptides amers [10, 57, 62-64]. La protéolyse primaire se définit comme étant l’hydrolyse des caséines en peptides, tandis que la protéolyse secondaire est l’hydrolyse des peptides en acides aminés libres [65]. Elle s’effectue à l’aide de différentes enzymes, incluant des aminopeptidases et des carboxypeptidases. L’expression et l’activité de ces enzymes chez G. candidum ont été mises en évidence à la fois par des études biochimiques et par une approche métatranscriptomique dans des environnements où la levure était dominante [10, 22, 24, 25, 57]. De plus, ces études ont permis de démontrer que les activités protéolytiques surviennent au cours des 21 premiers jours de l’affinage [3, 24, 25]. Des activités protéolytiques extra- et intracellulaires ont été observées chez G. candidum pour 30 souches provenant de fromages différents [66]. Dans cette étude, il a été possible de classer les souches en fonction de leurs activités protéolytiques où la majorité d’entre elles présentaient une activité protéolytique extracellulaire faible tandis qu’une minorité de souches présentaient une activité protéolytique extracellulaire forte. Également, il a été observé que les souches isolées de fromages à pâte molle avaient un taux de croissance et une activité protéolytique plus élevés que leurs contreparties isolées de fromages à pâte ferme.
Le mécanisme de protéolyse primaire des caséines par G. candidum est actuellement inconnu. Cependant, une étude par Dugat-Bony et al. (2015) utilisant l’approche métatranscriptomique dans un fromage a permis de suggérer trois voies cataboliques non exclusives pouvant être mises en oeuvre par cette levure [24]. Premièrement, des séquences correspondant à deux gènes (OPT2 et GAP1) codant pour des perméases reconnues comme participant à l’import de peptides et de protéines dans les levures ont été identifiés, ce qui suggère que G. candidum pourrait importer directement les peptides dérivés de la protéolyse effectuée par les BL et par l’action de la présure [67-70]. Deuxièmement, les
caséines pourraient être importées dans les cellules de G. candidum par endocytose et ensuite être dégradées à l’aide de protéases et de peptidases actives dans les vacuoles, hypothèse supportée par l’identification de transcrits codant pour des protéines jouant un rôle dans l’endocytose [71-75]. Le troisième mécanisme suggéré n’a pas pu être confirmé avec les données de l’étude, mais a déjà été suggéré auparavant pour une souche fromagère de la levure Debaryomyces hansenii où des protéases intracellulaires, notamment celle codée par le gène PRD1, se retrouvent dans l’environnement extracellulaire suivant la lyse des cellules [24, 76].
L’activité protéolytique de G. candidum n’est pas seulement responsable de l’alcalinisation de la pâte, mais permet également la production de plusieurs précurseurs d’arômes [9]. Les acides aminés libres produits par la protéolyse secondaire peuvent être transformés par transamination, déshydrogénation, décarboxylation et par réduction en alcools, aldéhydes, acides carboxyliques et en CVS qui confèrent des arômes particuliers au fromage, par exemple des saveurs de fruits, de fleurs et d’alcool [9, 11, 77].
L’activité protéolytique d’intérêt majeur chez G. candidum est sa capacité à convertir les acides aminés contenant du soufre, dont la méthionine, en divers composés soufrés qui contribuent à la flaveur typique des fromages[78]. G. candidum catabolise la méthionine par la voie de dégradation en deux étapes [8, 78, 79]. Premièrement, une aminotransférase non spécifique, BAT2 et/ou ARO8 tel que suggéré par Pracharova et al. (2018), transforme la méthionine en 2-oxo-4-methylthiobutanoate (KMBA) puis le KMBA est transformé en méthanethiol ou en méthional qui sont subséquemment transformés en d’autres composés, dont des CVS dans le cas du méthanethiol (Fig. 5) [16, 78]. Du fait de leur faible seuil de détection et leur forte réactivité, les CVS contribuent fortement à l’unicité et au goût caractéristique des fromages affinés en surface [8, 79]. Ces composés soufrés sont associés à des saveurs d’ail (méthanethiol, diméthyl disulfide, diméthyl trisulfide et S-methyl thioacétate), de pomme de terre bouillie (méthional), de chou cuit (méthanethiol) et de vieux fromages (diméthyl disulfide) [11, 77, 78, 80].
Tableau 3. Listes des composés aromatiques produits par la protéolyse des caséines par
G. candidum.
a : Certains composés peuvent provenir également de l’activité lipolytique de G. candidum. Tableau tiré intégralement de Vignola (2018) [52].
Composés Arômes associés [11, 81, 82] Références
S-méthyl-thioesters
S-méthyl-thioacétate (MTA) Chou-fleur cuit, alliacé
[79, 80, 83-86] S-méthyl-thiobutyrate (MTB) Non précisé [79, 85] S-méthyl-thiopropionate (MTP) Fromager, alliacé [79, 85] S-méthyl-thioisobutanoate
(MTIB) Animal, sulfureux [85]
S-méthyl-thioisovalérate
(MTIV) Non précisé [85]
S-méthyl-thiohexanoate
(MTH) Non précisé [85]
Sulfures
Sulfure de diméthyle (DMS) Chou, chou bouilli, sulfureux
[79, 80, 83-85, 87] Disulfure de diméthyle
(DMDS) Chou-fleur, ail, fromage très affiné
[9, 79, 80, 83-85, 87] Trisulfure de diméthyle
(DMTS) Alliacé, viande, fromage très affiné
[79, 80, 83-87]
Alcoolsa
Propanol Alcool, sucré [9]
2-Méthylpropan-1-ol Alcool [9, 87, 88]
3-Méthylbutan-1-ol Alcool, fruité [9, 89]
Phényléthanol Rose, floral [9]
Phénol Floral, médical [9]
Acidesa
Acide 2-méthylpropanoïque Sucré, pomme, rance, beurre [9]
Acide butanoïque Fromager, putride, rance, sueur [9, 88]
Acide 3-Methylbutanoïque Fruité, sûr, sueur [9]
Acide 2-Methylbutanoïque Fruit pourri, sueur, léger [9]
Acide pentanoïque [9]
Acide hexanoïque Âcre, sûr, fromage bleu [9]
Acine octanoïque
Cire, savon, chèvre, moisi, rance,
Figure 5. Catabolisme de la L-méthionine chez G. candidum. KMBA :
2-oxo-4-méthylthiobutanoate. Figure inspirée de Pracharova et al. (2018) [16].
1.3.3 Utilisation des lipides et des acides gras
La lipolyse se définit comme étant l’hydrolyse des lipides en acides gras libres et en glycérol [90]. G. candidum dispose de plusieurs lipases, dont deux enzymes qui ont été largement étudiées (nommées Lipase I et II ou encore Lipase A et B, selon l’étude) [3, 56, 81, 91]. Ces deux lipases sont des homologues qui diffèrent légèrement par leur séquence en acides aminés et par leur spécificité de substrats [3, 57, 92, 93]. La lipase extracellulaire (Lipase I) est la plus étudiée, car elle est capable d’hydrolyser les lipides des produits laitiers et présente une spécificité pour les acides gras insaturés[3]. Cette lipase a une affinité plus élevée pour l’acide oléique qui est l’un des acides gras présents dans le lait de vache [94, 95]. Ainsi, G. candidum contribue au changement du profil des acides gras dans les fromages, ce qui a été démontré dans le fromage Armada, où elle fait partie de la microflore dominante [3]. L-Méthionine BAT2 ARO8 KMBA Méthanethiol Méthional Méthionol Acétate de 3-(méthylthio)propyl MTA 2,4-dithiapentane DMTS DMDS DMS Décarboxylase Alcool déhydrogénase Alcool acétyltransférase
L’activité lipolytique de G. candidum contribue au développement de trois caractéristiques organoleptiques des fromages qui sont la texture, la solubilité de certains composés aromatiques et la production de précurseurs de flaveurs [91]. Suite à l’hydrolyse des lipides en acides gras libres et en glycérol, les mycètes utilisent la voie de la β-oxydation afin de réduire la toxicité des acides gras libres envers eux [29, 96]. Lors de la croissance des mycètes sur un fromage, les acides gras libres présents en fortes concentrations subissent une β-oxydation partielle qui mène à la production de composés aromatiques [29, 77, 81]. Ces composés aromatiques sont des méthyles-cétones, des esters, des alcools et d’autres composés qui confèrent des goûts herbacés, fruités et de champignons aux fromages (Tableau 4) [11, 57, 81].
Tableau 4. Composés aromatiques résultant du métabolisme des acides gras par
G. candidum
Composés Arômes associés [11, 81] Références
Méthylcétones
Butan-2-one Acétone, éther [87]
Pentan-2-one Fruité, acétone, sucré, éther [9, 87] Heptan-2-one
Fromage bleu, épicé, moisi,
Roquefort [9, 87]
Nonan-2-one Fruité, moisi, floral [9]
Undécan-2-one Floral, rose, iris, herbacé [9] Pentan-3-one Champignon, fruité, épicé [9]
Esters
Éthyl acétate
Solvant, ananas, fruité,
pomme [9, 87, 88]
Phényléthanol
acétate Floral, rose [9]
Isobutyl acétate Ananas (Butyl acétate) [9]
Alcools
Oct-1-en-3-ol Champignon [89, 97]
Butanol Sucré, fruité [87]
Heptan-2-ol Terreux, huileux, doux [9]
Nonan-2-ol Gras, melon, vert, doux [9]
Tableau intégralement tiré de Vignola et al.(2017) [52].
En conclusion, les activités biochimiques (protéolyse et lipolyse) de G. candidum étant dépendantes de la souche et la sélection des souches étant effectuée principalement selon le phénotype, il est nécessaire d’identifier les facteurs génétiques contribuant à la diversité
des souches et de développer des outils moléculaires permettant une sélection plus rapide et efficace des ferments pour une utilisation optimale de ceux-ci.
1.4 La génétique de la levure Geotrichum candidum
En complément de la caractérisation phénotypique, la classification génotypique cherche à comparer la similarité entre les organismes en se basant sur la séquence nucléotidique de leurs génomes. Ce type de classification permet entre autres d’identifier un microorganisme inconnu ou d’établir une phylogénie au sein d’un groupe de microorganismes [65]. Chez G. candidum, plusieurs méthodes moléculaires ont été utilisées pour étudier les différences génétiques entre les souches dont le Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), le Random Amplified Micro-satellite-PCR (RAM-PCR), le Random Amplified Polymorphism DNA-PCR (RAPD-PCR), le séquençage de l’ADN ribosomal, le typage par Multilocus Sequence Typing (MLST) et le typage par empreinte inter-LTR [17, 20, 21, 51, 98].
1.4.1 PFGE
Le Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) a été utilisé afin d’analyser le caryotype de 13 souches de G. candidum provenant d’environnements différents et avec des morphotypes différents [98]. Le caryotype, réfère à la taille et au nombre de chromosomes d’un génome [99, 100]. Le polymorphisme du phénotype des souches de G. candidum se reflète également au niveau du caryotype. Il a été observé que selon le phénotype, les souches avaient entre cinq et huit chromosomes. De plus, la taille totale du génome de G. candidum a été estimée – à l’aide du PFGE – entre 11 et 19 Mb dépendamment du morphotype. En revanche, le séquençage complet du génome d’une souche de G. candidum (CLIB 918) a révélé une taille de génome d’environ 24,8 Mb [19].
1.4.2 RAM-PCR
Le Random Amplified Micro-satellite-PCR (RAM-PCR) et le Random Amplified Polymorphism DNA-PCR (RAPD-PCR) sont des techniques de génotypage qui ont aussi été utilisées pour typer les souches de G. candidum. Ces deux techniques se basent sur l’amplification aléatoire par PCR de l’ADN génomique [14, 17, 45, 101]. Le RAPD-PCR
utilise des amorces aléatoires de 10 nucléotides avec une température d’hybridation très permissive de 34 °C ce qui augmente le nombre d’hybridations dans le génome complet, mais réduit la spécificité et la reproductibilité de la technique [17]. Le RAM-PCR quant à lui utilise des amorces de 20 nucléotides ciblant les séquences nucléotidiques des microsatellites qui sont des séquences en tandem d’un à quatre nucléotides présentes en grande quantité dans les génomes eucaryotes et répartis de façon homogène dans le génome. Les microsatellites présentent également un polymorphisme élevé entre les souches [102-104]. Les variations dans l’emplacement et le polymorphisme des séquences complémentaires à l’amorce utilisée pour le RAPD-PCR ou le RAM-PCR entraînent une variation dans le nombre et la longueur des fragments d'ADN amplifiés. Par électrophorèse, il est alors possible de comparer les profils de migration obtenus qui sont uniques en fonction des souches [102, 103].
1.4.3 RAPD-PCR
La diversité génomique des souches de G. candidum a été mise en évidence pour la première fois par la méthode du RAPD-PCR en parallèle avec des tests d’assimilation de source de carbone et de résistance au sel [14]. Soixante-quatre isolats de laits, de caillés et de fromages provenant de sept régions productrices de fromages en France ont été caractérisés. Il a été observé qu’au sein des souches provenant d’une même région, une diversité élevée était observée et que les souches ne se regroupaient pas en fonction de la région [14]. Une étude comparant le pouvoir discriminant de la méthode du RAPD-PCR à celle du RAM-PCR chez G. candidum en génotypant 57 souches de différents morphotypes provenant de substrats et de régions géographiques différentes a également permis de démontrer la grande diversité génétique au sein de l’espèce G. candidum [17]. La figure 6 présente la diversité génomique de G. candidum telle qu’observée en combinant le RAPD-PCR et le RAM-RAPD-PCR (Fig. 6) [17].
L’analyse des résultats des techniques de RAPD-PCR et RAM-PCR peut être ambiguë puisque ce type d’analyse nécessite la standardisation des équipements, des réactifs utilisés et de l’archivage des souches ce qui peut être très difficile entre différents laboratoires [104]. Ainsi, une méthode de génotypage des souches de G. candidum qui s’affranchit de
plusieurs de ces désavantages a été développée, soit le Multilocus Sequence Typing (MLST) [20, 21].
Figure 6. Dendrogramme obtenu avec la méthode UPGMA des profils combinés générés
avec les amorces (GATA)4 du RAM-PCR, DB18, OPA19 et OPT15 du RAPD-PCR. Figure intégralement tirée de Gente et al. (2002) [17].
1.4.4 Séquençage des ADN ribosomaux
La diversité génomique des souches de G. candidum a également été observée par le séquençage des gènes codants pour les ARN ribosomaux 18S, 5.8 S, 26S ainsi que leurs espaceurs internes respectifs l’ITS1 et l’ITS2 (Internal Transcribed spacer (ITS)) (Fig. 7) [51]. Dix-huit souches de G. candidum provenant d’environnements multiples ont été analysées de cette façon et il a été démontré qu’un fort taux de polymorphisme était observé pour ces gènes, ce qui est considéré comme inhabituel. En effet, des mécanismes naturels existent afin de maintenir l’homogénéité de ces gènes au sein d’une même espèce et d’empêcher la dérive génétique de l’espèce [105-107]. De plus, lors de l’analyse des séquences, plusieurs doubles pics d’amplification ont été observés, suggérant la présence de plusieurs copies de ces gènes dans une même cellule [51].
Figure 7. Comparaison de l’ADNr 18S par Neighbor-joining tree de 18 séquences
complètes de G. candidum et 36 séquences presque complètes de souches disponibles sur GenBank. Les souches du groupe 2 ont été utilisées comme groupe externe. Figure intégralement tirée d’Alper et al. (2011) [18].
1.4.5 MLST
Le MLST est une technique de génotypage développée initialement pour l’étude épidémiologique de microorganismes pathogènes, dont Neisseria meningitidis [108]. Cette méthode est maintenant appliquée à la classification de plusieurs levures dans le domaine médical dont Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei et Candida tropicalis [109-114], mais est également de plus en plus utilisée dans l’industrie agroalimentaire
notamment pour le génotypage des bactéries lactiques, mais également des levures alimentaires [115-123]. La technique du MLST consiste à comparer la séquence d’ADN de différents gènes, entre six et huit, distribués dans l’ensemble du génome microbien [108, 124]. Cette technique vise le séquençage de fragments de gènes du métabolisme central [108, 125, 126]. Ces gènes évoluent très lentement, car une mutation affectant la fonctionnalité de la protéine encodée pourrait entraîner la mort de la cellule [125, 126]. Ainsi, le MLST permet la détection de la variabilité des allèles des gènes directement au niveau de leurs séquences et permet également d’étudier les relations génétiques entre les souches [108, 125].
Dans les dernières années, deux schémas MLST de G. candidum ont été proposés par deux équipes indépendantes (Fig. 8) [20, 21]. Le premier schéma (Alper et al. (2013) cible six gènes du métabolisme central de G. candidum (Tableau 7). Cette étude a permis de séparer 40 souches différentes de G. candidum en 17 séquences types réparties en deux grands groupes [20]. Cette étude a permis d’observer qu’une sous-espèce pourrait être présente au sein de l’espèce G. candidum par la grande distance phylogénétique entre les deux groupes. De plus, ce schéma MLST a démontré que les souches industrielles avaient tendance à se regrouper entre elles tandis que les souches provenant de l’environnement avaient tendance à se disperser. Cette observation laisse suggérer que la diversité génétique entre les souches est encore plus élevée que ce qui a pu être observé et que les souches industrielles proviennent d’un ancêtre commun suivant la domestication d’une ou quelques souches par les fromagers au cours du temps [20]. Le deuxième schéma MLST (Jacques et al. (2017) vise cinq gènes différents du métabolisme central de G. candidum (Tableau 7) [21]. Ce second schéma MLST a permis d’identifier 40 ST issus de 67 souches de G. candidum isolées de sources environnementales et d’environnements laitiers, dont des fromages. Ce schéma a permis d’investiguer plus en profondeur la structure génétique des souches de G. candidum et a pu démontrer que les souches se regroupent en cinq clades. L’un de ces clades était composé uniquement de souches environnementales, trois autres incluaient des souches environnementales et laitières et un dernier clade qui regroupait des souches provenant uniquement d’environnements laitiers (lait, fromage, environnement laitier). Également, deux groupes de souches ont été observés pour les souches provenant d’environnements laitiers où l’un d’eux était formé de souches génétiquement homogènes
