Composition fine du lait: Vers une meilleure compréhension de la biologie de la lactation

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Composition fine du lait: Vers une meilleure compréhension de la biologie de la lactation

Christelle Cebo

To cite this version:

Christelle Cebo. Composition fine du lait: Vers une meilleure compréhension de la biologie de la lactation. Journées conjointes INRA-consortium Op+Lait, Nov 2019, Saint-Hyacinthe, Canada. �hal- 02954925�

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Composition fine du lait:

Vers une meilleure compréhension de la biologie de la lactation

Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)

Unité Génétique Animale et Biologie Intégrative (GABI)

INRA Jouy-en-Josas-FRANCE

Christelle CEBO

christelle.cebo@inra.fr Galactinnov

https://www6.jouy.inra.fr/gabi

(3)

Unité GABI: Génétique Animale et Biologie Intégrative Département de Génétique Animale (GA) (+ PHASE)

Rencontre INRA – Op+lait 21-22/11/2019 2

200 chercheurs, enseignants- chercheurs, ingénieurs,

techniciens et étudiants:

• INRA

• AgroParisTech

• ENVA (Ecole Nationale Vétérinaire de Maisons Alfort)

• Organismes techniques ou professionnels

Structure des génomes

animaux

Déterminisme de caractères

complexes

Evaluation et valorisation des ressources

génétiques animales

Dir: Claire Rogel-Gaillard

(4)

Equipe GALAC: Glande Mammaire et Lactation

Dir: Fabienne Le Provost

https://www6.jouy.inra.fr/gabi/les-Recherches/Equipes-de-recherche/GaLac

(5)

Acides

nucléiques Protéines

LAIT

Macro éléments

Vitamines Lipides

Oligo saccharides

Le lait: un aliment complexe

triglycérides acides gras phospholipides

ARNm

microARNs

caséines

protéines mineures

(6)

Acides

LAIT

Le lait: un aliment complexe

ARNm

microARNs

caséines

(7)

Acides

LAIT

Le lait: un aliment complexe

ARNm

microARNs

caséines

(8)

Collaborations GABI/Galactinnov, axe 3: « Un lait et des produits transformés de qualité »

7

• Une méthode de phénotypage fin des protéines laitières développée dans l’unité GABI: principes & applications

• Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait:

principes & applications (Programme BioMarq’lait)

• Lipolyse et qualité du lait : vers une meilleure

compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la dégradation de la matière grasse laitière (Programme

LIPOMEC)

Rencontre INRA – Op+lait 21-22/11/2019

(9)

8

• Une méthode de phénotypage fin des protéines laitières développée dans l’unité GABI: principes & applications

• Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait:

principes & applications (Programme BioMarq’lait)

• Lipolyse et qualité du lait : vers une meilleure

compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la dégradation de la matière grasse laitière (Programme

LIPOMEC)

Collaborations GABI/Galactinnov, axe 3: « Un

lait et des produits transformés de qualité »

(10)

Pas UN lait mais DES laits !

Caséine a s1 Caséine a s2 Caséine b Caséine k

b-lactoglobuline

a-lactalbumine …mais de nombreuses isoformes ! 6 lactoprotéines majeures….

 Variants génétiques

 Variants d’épissage

 Modifications post-traductionnelles (glycosylation-phosphorylation)

 Produits de protéolyse (essentiellement caséines g issues de l’hydrolyse de la caséine b par la

plasmine)

(11)

10

• Séparation: chromatographie liquide (LC) (RP-HPLC Dionex LC System Ultimate 3000)

• Identification +quantification (MS) Spectrométrie de masse: ESI -TOF

Base de données bovine:

(3000 masses)

Dépôt auprès de l’Agence de Protection des Programmes 17 novembre 2011.

(IDDN.FR.001.460019.000.R.C.2011.000.10300)

Mise au point d’une méthode d’identification « en ligne » des lactoprotéines (et de leurs dérivés naturels)

Une base de données

+

in-house

Un équipement performant

Méthode LC-MS: Identification des protéines du lait sur la base de leur

masse moléculaire (confrontation masses observées / masses théoriques)

Miranda, et al, 2019

(12)

11

19004.9230

19084.6623

HPO3 - 0.2270

4.

+MS, 7.2-9.2min, -Peak Bkgrnd, Smoothed (0.20,1,GA), Deconvoluted

0

2000 4000 6000

Intens.

18400 18600 18800 19000 19200 19400 19600 m/z

1

2 3

4 5 6 7 8

9

10

11

12 13

14

15

Pic 4

19951.1416

20609.8391

20900.6524

21849.2303

GalNac-Gal-SA2 + 2.1878

K + 0.1124

K + 2.7745 K + 0.9510

K - 0.1968

K + 3.8629

NeuNac - 0.2821

1. +MS, 3.7-6.9min, -Peak Bkgrnd, Smoothed (0.20,1,GA), Deconvoluted

0 100 200 300 400 500 600 Intens.

20000 20200 20400 20600 20800 21000 21200 21400 21600 21800 m/z

kGlyco : (2)19952.719= k_VarB_1P_1OG (GalNac-Gal-SA2)

(1)20608.699= k_VarB_1P_2OG (GalNac-Gal-SA2 + Gal-Nac-SA) (1)20900.684= k_VarB_1P_2OG (GalNac-Gal-SA2 + Gal-Nac-SA2)

(1)21557.122= k_VarB_1P_3OG (GalNac-Gal-SA2 + Gal-Nac-SA +GalNac-Gal-SA2) (1)21849.04 = k_VarB_1P_3OG (GalNac-Gal-SA2 + Gal-Nac-SA2+GalNac-Gal-SA2)

k: ⁽⁴⁾^19004.923= k_VarB_1P (3)19084.758= k_VarB_2P (5)25147.886= a_S2_VarA _10P (5)25228.066 = a_S2_VarA _11P (6)25307.903 = a_S2_VarA _12P (6)25387.548 = a_S2_VarA _13P (6)25467.380 = a_S2_VarA _14P

a_S1: (9) 23486.5813 = a_S1_VarB(-Q78)_8P (9) 23614.712 = a_S1_VarB_8P (9)23694.692 = a_S1_VarB_9P

b: (11) 23903.2053 = b_varA2_4P (11) 23983.1853 = b_varA2_5P

(7)12176.879 = PP5_complement g2 (pep 1-105_Beta_VarA2-5P) (6) 12442.17 = complément g3 (pep 1-170_Beta_VarA2_5P) (11) 20522.479 = g1 (pep 29-209_Beta_VarA2_1P)

(11)11823.627= g2 (pep 106-209_Beta_VarA2_0P) ( 13) 11558.047 = g3 (pep 108_209_Beta_VarA2_0P) (12) 14186.446 = a-Lac_VarB

(13) 14265.839= a-Lac_VarB _1P : (15)18366.796 = b-Lg_VarA

EIC 600-3000 Da UV 214 nm

Exemple d’application: phénotypage fin de lait individuel

5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Time [min]

104 105 106 107 108 109 1010 1011 Intens.

phenofinlait 2011-BM16_GC4_01_805.d: EIC 600.0000-3000.0000 +, Smoothed (0.00,5,GA) phenofinlait 2011-BM16_GC4_01_805.d: UV Chromatogram, 214 nm

k Glyco

k

a _S2 a _S1

b

aLac b Lg

Identification quasi-exhaustive des protéines majeures du lait

Isoformes naturelles des lactoprotéines

Produits de protéolyse naturelle Pic 1

(13)

12

Pro Phe Pro Gly Pro Ile Asn Ser

Pro Phe Pro Gly Pro Ile

Pro

Asn Ser A2 beta-caséine (vache)

A1 beta-caséine (vache)

His

Différence entre lait « A1 » et lait « A2 »= un seul acide aminé !!!

protéine

« ancestrale »

Caséine « A2 »= variant (dérivé) de la caséine b = 30 % des caséines totales

Lait « A2 »= argument commercial dans certains pays

Exemple d’application: phénotypage fin de lait

individuel: cas du lait A1/A2 (1)

(14)

13

Beta-caséine A1

Beta-caséine A2

EIC 600-3000 Da UV 214 nm

Exemple d’application: phénotypage fin de lait

individuel: cas du lait A1/A2 (2)

(15)

Exemple d’application: phénotypage fin de lait individuel: cas des isoformes de phosphorylation (1)

Rendement fromager

Phosphorylation des caséines

Structure

du caillé

(16)

15

Exemple d’application: phénotypage fin de lait individuel: cas des isoformes de phosphorylation (2)

12P 13P

14P Mélange standard lait

bovin a_S2- cas VarA

 Mise en évidence d’une grande variabilité individuelle dans la proportion relative des isoformes de phosphorylation notamment au niveau la caséine a_S2 bovine (Fang et al., 2016)

(17)

16

Minutes

10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 47.5 50.0

AU

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200 0.225 0.250

AU

0.000 0.025 0.050 0.075 0.100 0.125 0.150 0.175 0.200 0.225 0.250 UV-2

002-BREBIS 5067 J1 S.aureus

UV-2

003-BREBIS 5067 J3 S.aureus

TO T1=24H T1=72H

κ-CN

αs2-CN αs1-CN

α-LA

β-CN

β-LG SA

Mammite=protéolyse rapide des lactoprotéines majeures+

augmentation du pic de sérumalbumine (SA)-Programmes GENOMA

Exemple d’application: phénotypage fin de

lait individuel: cas d’un lait mammiteux

(18)

17

Exemple d’application: suivi de la protéolyse primaire des lactoprotéines au cours de l’affinage de fromages

Para k CMP

a_S1-I,II,III,IV Peptide 1-23 b-I,II,III

Compb-I,II,III g-1,2,3,4,5

PP5 PP8s,f

Construction d’une base de données de masses théoriques des peptides d’affinages issues

des lactoprotéines bovines (Plus de 1000 masses

théoriques)

1BOV-complementG3-varA2 5 BOV_AS2-varA_11P (25228.3279)BOV_AS2-varA-12P (25308.3079) 89 10 BOV_AS1-varB-8P (23614.712) 1314 BOV_BETA-varB-5P (24092.319) 19 BOVIN_BETA-var A1-5P (24023,2097) BOV_BETA-varA2-5P (23983.1853) BOV_gamma3-tous var sauf B,F,G-0P (11558.6117) BOV_BLG-varB (18281.2076) BOV_BLG-varA (18367.2981)

3 4 12

10 15 20 25 30 35 40 Time [min]

0 100 200 300 400 500 Intens.

[mAU]

Pyrhanas-R1A4P1_BA3_01_12770.d: EIC 600.0000-3000.0000 +, Smoothed (0.00,5,GA) Pyrhanas-R1A4P1_BA3_01_12770.d: UV Chromatogram, 214 nm

953.1349 24+ (A, D) 1039.695222+ (A)

1143.574924+ (B)

1270.5401 28+ (C, D)

1429.1840 1633.2270

1905.3316 2+ (D)

2286.0837 14. +MS, Profile, 21.0-22.4min #(1253-1335), 100%=2281, -Peak Bkgrnd, Smoothed (0.10,1,GA)

0 500 1000 1500 2000 Intens.

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 m/z

3808.5713 Mr (D)

11805.1883Mr (F)

14107.8707 Mr (H)

22850.9095Mr (A)

27421.3113 Mr (B)

35546.2585Mr (C) 14. +MS, Profile, 21.0-22.4min, 100%=2281, -Peak Bkgrnd, Smoothed (0.10,1,GA), Deconvoluted

0 2000 4000 6000 Intens.

5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 m/z

Méthode classique:

SDS-PAGE Méthode LC-MS

Miranda,G et al, 2019

(19)

18

• Une méthode de phénotypage fin des protéines laitières développée dans l’unité GABI: principes & applications

• Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait:

principes & applications (Programme BioMarq’lait)

• Lipolyse et qualité du lait : vers une meilleure

compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la dégradation de la matière grasse laitière (Programme

LIPOMEC)

Collaborations GABI/Galactinnov, axe 3: « Un

lait et des produits transformés de qualité »

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Holstein Normande

Principal component analysis

Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait: principes & applications (1)

19

 microARNs= petits ARN non codants (~22 nucléotides)

 Impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes

 4533 microARNs matures recensés chez le bovin, tous tissus confondus et toutes bases confondues (miRBase + RumimiR)

http:/rumimir.sigenae.org/

18,6

23,3

Production laitière (kg/jour)

Normande Holstein p = 0.006

 Développement d’une base de données de microARNs chez les ruminants (Bourdon, C.,et al 2019)

 Le niveau d’expression de certains microARNs dépendent de la race

Le Guillou, et al, 2018

(21)

20

Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait: principes & applications (2)

Programme BioMarq’Lait (Porteur: Marion Boutinaud, INRA):

Effet d’un stress métabolique (restriction alimentaire) sur la production laitière

Source: Freepik

miRNomes, protéomes

Identification de biomarqueurs non invasifs de stress alimentaire dans différents compartiments (lait écrémé, globules gras, vésicules extra-cellulaires)

Burtey, A, et al.

(22)

21

• Une méthode de phénotypage fin des protéines laitières développée dans l’unité GABI: principes & applications

• Les microARN comme biomarqueurs de qualité du lait:

principes & applications (Programme BioMarq’lait)

• Lipolyse et qualité du lait : vers une meilleure

compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant la dégradation de la matière grasse laitière (Programme

LIPOMEC)

Collaborations GABI/Galactinnov, axe 3: « Un

lait et des produits transformés de qualité »

(23)

22

Lipolyse et qualité du lait: le programme ANR LIPOMEC (2020-2022) (1)

Lipolyse = dégradation des lipides des laits

Lipolyse du lait ⇨ acides gras libres dans le lait ⇨ diminue les qualités technologiques et organoleptiques du

produit « LAIT »

(24)

23

Lipolyse et qualité du lait: le programme ANR LIPOMEC (2020-2022) (2)

Coordination: C. Cebo (INRA)

(25)

24

 Métaprogramme INRA LongHealth (2018-2020): Effet à long terme des mammites sur la production laitière bovine (Coordination:

Pierre Germon, INRA)

Collaborations GABI/Galactinnov, axe 2:

« Vers une gestion plus durable de la santé animale et du bien-être des animaux »

 ANR REIDSOCS:Effet du variant R96C SOCS-2 sur la lactation et la sensibilité aux mammites chez les ovins (WP2: Cellular and molecular

mechanisms related to the SOCS-2 variant in a new mouse model) (Coordination: Gilles Foucras (2016-2020)

(Hue-Beauvais,C, et al.) (Charlier,M,

Petridou,B, et al.)

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25

Conclusions

 Nos sujets d’étude: la glande mammaire, le lait, et le continuum mère-petit

 Nos compétences: génétique, génomique fonctionnelle, physiologie, protéomique, immuno-histochimie, biostatistiques

 Principaux axes de collaboration GABI/Galactinnov:

AXE 2: modèles animaux (souris, lapin), mécanismes

moléculaires et cellulaires associés à la physiopathologie de la glande mammaire (mammites)

AXE 3: phénotypage fin des lactoprotéines dans différentes matrices laitières, identificateurs de biomarqueurs de stress de type protéique ou épigénétique (microARNs)

 Nos objectifs de recherche: la qualité du lait, la durabilité de la production laitière, la transmission de marques épigénétiques

(27)

26

« Il n’y a pas d’échecs, il n’y a que des abandons (Albert Einstein)