C.1. Etude de la structure et des modifications post- traductionnelles de la protéine Erm

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Résultats

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Résultats Expression, Purification et Structure de Erm

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C.1. Etude de la structure et des modifications post- traductionnelles de la protéine Erm

C.1.1. Expression, purification et prédictions structurelles C.1.1. du facteur de transcription Erm

C.1.1.1 Contexte

Antérieurement à ce travail, les seules données structurelles disponibles concernant les membres du groupe PEA3 étaient celles concernant le domaine ETS et le domaine transactivateur amino-terminal caractéristique de ce groupe. En effet, si la structure du domaine ETS des protéines de ce groupe n’a pas été directement caractérisée, celle d’autres membres de la famille parmi lesquels Ets-1, Pu.1, Elk-1 ou Fli-1 l’a été par résonance magnétique nucléaire ou cristallographie en présence ou non de la séquence consensus de liaison à l’ADN (Donaldson et al., 1994 ; Donaldson et al., 1996 ; Kodandapani et al., 1996 ; Liang et al., 1994 ; Mo et al., 2000). Par analogie avec ces structures, la structure du domaine ETS des protéines Erm, Er81 et Pea3 est caractérisée par un motif hélice-tour-hélice de type

« ailé » agencé de la manière suivante : α₁−β₁−β₂−α₂−α₃−β₃−β₄ (pour revue, Graves and Petersen, 1998). Outre le domaine ETS, la structure secondaire du domaine transactivateur amino-terminal caractéristique des membres du groupe PEA3 a été proposée pour la protéine Er81 par dichroïsme circulaire. Ce domaine, riche en résidus de type acide, est structuré en une hélice α, qui est en partie responsable du potentiel transactivateur des facteurs de transcription de ce groupe (Defossez et al., 1997; Laget et al., 1996 ).

C.1.1.2. Stratégie

Aucune donnée présentée précédemment ne concernait la structure d’un facteur Ets de pleine longueur. Aussi, nous avons initié l’étude structurelle des membres du groupe PEA3 dans leur entièreté. Pour ce faire, nous avons choisi le système d’expression eucaryote baculovirus/cellules d’insectes. Ce système présente l’avantage d’assurer la plupart des modifications post-traductionnelles rencontrées chez les eucaryotes parmi lesquelles la phosphorylation, l’acétylation, l’acylation ou les glycosylations simples (Luckow, 1988)}. Ce qui suggère que la structure des protéines recombinantes ainsi produites soit la plus proche possible de celle des protéines natives.

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Nous avons donc généré des baculovirus recombinants codant pour chacune des protéines du groupe PEA3. Dans leur partie amino-terminale, nous avons attaché une étiquette qui comprend six histidines afin de permettre leur purification sur résine de nickel mais aussi un épitope reconnu par un anticorps monoclonal et un site de digestion par l’entérokinase permettant de séparer la protéine de son étiquette. Après avoir procédé à l’isolement et à l’amplification de chaque clone viral, nous avons déterminé les conditions optimales de production de protéines telles que la cinétique et la multiplicité d’infection. Plusieurs essais de purification des protéines en conditions natives (purification des noyaux, chromatographie d’affinité sur résines échangeuses d’ions, héparine sépharose ou résine de nickel) ont été nécessaires pour déterminer un schéma de purification optimal comprenant quatre étapes :

- lyse des cellules par sonication, - ultracentrifugation des lysats,

- première étape de purification sur une colonne d’héparine sépharose, - seconde étape de purification sur résine de nickel.

Après avoir obtenu plusieurs milligrammes de la protéine Erm recombinante, nous avons vérifié sa fonctionnalité par la technique de retard sur gel et procédé aux analyses structurelles par dichroïsme circulaire (en absence et présence de trifluoro-éthanol - en abbrégé TFE) et par spectrométrie infrarouge. Les résultats obtenus pour ces deux analyses ont ensuite été comparés aux prédictions faites in silico et sont présentés dans l’article « Expression, Purification and Structural Prediction of the Ets Transcription Factor ERM » publié dans la revue Biochimica and Biophysica Acta - General Subjects en 2006.

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- 52 - C.1.1.4. Résultats complémentaires

Comme mentionné dans l’introduction de ce chapitre, nous avons initié la production et la purification des trois membres du groupe PEA3. Les méthodologies concernant les étapes de production, de purification et de concentration utilisées pour les protéines Pea3 et Er81 étant identiques à celles décrites concernant Erm (reproduite dans l’article qui précède), nous les décrirons succinctement. La purification de Pea3 et de Er81 a été réalisée selon les mêmes conditions que Erm, à savoir en faisant suivre au passage sur une résine héparine sépharose (qui permet notamment la rétention des protéines capables de lier l’ADN) celui sur résine Ni- NTA sépharose puisque toutes les protéines d’intérêt possèdent une étiquette contenant six histidines. Nous présenterons ici le détail de ces différentes étapes pour le facteur de transcription Er81.

Au terme de la première étape de purification sur héparine sépharose, nous avons pu récupérer un volume de 100mL d’éluat dans lequel on retrouve le facteur de transcription Er81 recombinant (Figure R 1.1, panel A, ligne D et E) dont les protéines cellulaires contaminantes ont été éliminées. Toutefois, nous avons constaté que, contrairement à la protéine Erm, une proportion significative de la protéine Er81 ne se lie pas à cette résine dans les conditions utilisées (Figure R 1.1, panel A, ligne B et C). Malgré la perte importante de protéines lors de cette première étape, nous avons engagé les éluats récupérés dans la purification sur Ni-NTA sépharose. Alors qu’on ne retrouve pratiquement pas de protéine Er81 ni dans les fractions correspondantes aux protéines qui ne se lient pas à la Ni-NTA sépharose ni dans le premier lavage à 20nM d’imidazole (Figure R 1.1, panels B et C, lignes B, C et D), la protéine est éluée dès le second lavage par 40nM d’imidazole (Figure R 1.1, panel B et C, ligne E). La protéine Er81 est éluée par 100nM (fractions 1 à 7) et 500nM (fractions 8 et 11) d’imidazole. Au terme de cette purification, nous avons récupéré une protéine relativement pure. Toutefois quelques bandes de poids moléculaire inférieur subsistent et correspondent en grande partie à des formes dégradées de la protéine Er81 puisqu’elles sont visualisées par immunodétection avec l’anticorps anti-Xpress dirigé contre l’étiquette amino-terminale de la protéine.

Pour chaque membre du groupe PEA3 que nous avons purifié, nous avons réuni les différentes fractions contenant la protéine à l’issue de la purification sur Ni-NTA sépahrose.

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Nous avons ensuite, par des étapes de filtration par centrifugation et dilution dans un tampon de salinité décroissante, procédé à la concentration et la dialyse de chacune des protéines. Ci- dessous sont présentés les résultats obtenus pour les trois membres du groupe PEA3. En ce qui concerne la protéine Erm, nous avons dans un premier temps concentré la protéine puis avons effectué une dialyse par dilutions successives suivie d’une concentration par centrifugation. Comme montré dans la Figure R 1.2 panel A, la protéine est aisément concentrée. Toutefois, malgré un cut-off de 30 kDa lors de la filtration, sont toujours présentes quelques bandes correspondant à des formes dégradées de la protéine. Les mêmes résultats sont obtenus avec les protéines Er81 et Pea3. Néanmoins, lors de la dialyse par dilutions successives dans un tampon de salinité moindre, chacune de ces protéines a tendance à s’agréger. Cette observation a déjà été faite avec la protéine Erm recombinante purifiée mais dans de moindres proportions. De plus, dans le cas de Er81, après coloration au bleu de Coomassie de nombreuses bandes apparaissent suite à la concentration et ce même à un poids moléculaire inférieur au cut-off de la filtration de 30 kDa, ce qui laisse suggérer que cette protéine est, à l’instar de Erm, relativement instable. A titre de comparaison, nous avons déposé sur gel, 2,5 µL de la protéine Erm purifiée et concentrée et 10 µL des protéines Pea3 et Er81 purifiées et concentrées (Figure R 1.2, panel B). Après concentration, les quantités des protéines purifiées Er81 et Pea3 sont très significativement moindres que celles obtenues pour la protéine Erm purifiée. Il semble que ceci soit dû, entre autres, à l’agrégation protéique rencontrée lors de l’étape de concentration/dialyse.

Dès lors, pour les trois facteurs de transcription du groupe PEA3, nous avons procédé à une prédiction de la structure secondaire in silico en utilisant divers programmes de prédiction mentionnés dans l’article qui précède. Nous présentons ici les résultats alignés des prédictions de structure secondaire pour les facteurs de transcription Pea3 et Er81 (Figure R 1.3). Nous n’observons pas, en prédiction in silico, de différences significatives entre les trois membres du groupe PEA3. En effet, si les prédictions bioinformatiques indiquent 13,5% d’hélices α et 5,3% de feuillets β pour la protéine Erm, ces prédictions rapportent un pourcentage d’hélices α de 12,4% pour Pea3 et 14,9% pour Er81 et de 4,8% et 5,4% pour la proportion de feuillets β. Au niveau structurel, l’hélice α du domaine transactivateur et le domaine ETS sont prédits de manière identique pour les trois membres du groupe. A coté de ces deux domaines quelques structures supplémentaires sont prédites, comme par exemple dans le domaine central de la protéine Erm deux hélices α entourant un feuillet β à la suite de celle du domaine

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acide transactivateur. Aucune de ces deux hélices α prédites n’est retrouvée dans les prédictions in silico pour Pea3. Toutefois la seconde hélice est présente dans les prédictions concernant Er81. En amino-terminal du domaine acide Nt, on retrouve chez les trois membres du groupe PEA3 les mêmes structures prédites: en l’occurrence une hélice α et un feuillet β.

De même, en carboxy-terminal du domaine ETS est prédite une hélice α présentes chez les trois membres du groupe PEA3. Néanmoins, en dehors des structures déjà identifiées, il apparaît que ces trois protéines sont prédites pour être très peu structurées.

Suite aux résultats de purification, nous n’avons uniquement étudié la structure de la protéine Erm, cette dernière étant la seule des trois obtenue à un taux de pureté supérieur à 90% et en quantité suffisante pour les études de structure secondaire par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge ainsi que pour des tests de cristallisation dans le but d’en faire la diffractométrie. L’étude de la structure tertiaire a été effectuée en collaboration avec le laboratoire du Dr Villeret de l’Institut de Biologie de Lille. Différentes trousses de criblages de conditions de cristallogenèse ont été testées à 4°C et 20°C parmi lesquelles les trousses JBscreen 1 à 10 de la firme Jenabioscience et la trousse Cryo ainsi que son extension de la firme Sigma-Aldrich pour un criblage sur un total de plus de 300 conditions différentes de cristallogenèse. Au terme de ces analyses, aucune condition de formation de cristal n’a pu être déterminée pour la protéine Erm recombinante purifiée.

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Résultats Influence de l’ubiquitinylation sur Erm

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C.1.2. L’ubiquitinylation de Erm induit sa dégradation et régule positivement son pouvoir transactivateur

C.1.2.1. Contexte

A l’instar des autres membres de la famille Ets, les facteurs de transcription du groupe PEA3 font l’objet de différentes modifications post-traductionnelles. Parmi les modifications décrites, en ce qui concerne les facteurs Erm et Pea3, on retrouve notamment la sumoylation.

Cette modification est remarquable puisqu’à la différence d’autres modifications post- traductionnelles, elle consiste en l’ajout par liaison covalente d’un polypeptide SUMO de 97 résidus sur les résidus lysines d’un consensus séquentiel bien défini de la protéine ciblée. Tant Erm que Pea3 interagissent avec la ligase spécifique de la sumoylation, Ubc9 (Degerny et al., 2005; Gocke et al., 2005 ). Dans le cas de Erm, la modification par le polypeptide SUMO a lieu sur quatre résidus lysines distincts, tous situés au sein du CIDD. Ceci régule négativement son potentiel transactivateur (Degerny et al., 2005). Une modification post- traductionnelle dont le mécanisme est très similaire est aussi impliquée dans la régulation de facteurs de transcription. Il s’agit de l’ubiquitinylation qui consiste également en l’ajout par liaison covalente d’un ou de plusieurs polypeptides de 76 résidus polypeptide, l’ubiquitine, sur certains résidus lysines de la protéine ciblée. Dernièrement, il a été montré que Pea3 est ubiquitinylé et que cette modification conduit à sa dégradation via la voie du protéasome (Takahashi et al., 2005). Ainsi, l’ubiquitinylation de Pea3 permet la régulation de la quantité de ce facteur de transcription au sein de la cellule et ainsi la régulation de son action transactivatrice au niveau des gènes ciblés par ce dernier. Dans ces conditions que le Dr J-L.

Baert à l’Institut de Biologie de Lille a, en collaboration avec notre laboratoire, initié l’étude de l’ubiquitinylation du facteur de transcription Erm. En effet, plusieurs études avaient préalablement montré que, malgré la présence d’un taux élevé d’ARN messager de ce facteur, la détection de la protéine s’avère très difficile, ce qui pourrait notamment s’expliquer par une faible quantité protéique ou un rapide turnover de cette dernière suite à son ubiquitinylation et son adressage vers le protéasome.

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- 56 - C.1.2.2. Stratégie

Notre participation à cette étude se résumant à l’apport de l’anticorps anti-Erm obtenu suite à l’immunisation de souris avec la protéine purifiée en baculovirus ainsi que des mises au point de détection de la protéine avec cet anticorps, nous ne citerons que succinctement la stratégie employée par le Dr Baert qui est l’investigateur principal de cette étude. La première étape fut donc la mise en évidence de l’ubiquitinylation de Erm in cellulo par expression ectopique de ce facteur de transcription et du peptide d’ubiquitine étiqueté par six histidines. Ensuite, une approche similaire par surexpression de formes délétantes de la protéine Erm a permis l’identification de la région Ct de la protéine comme la région principalement responsable de la dégradation rapide de la protéine sans toutefois impliquer la voie de l’ubiquitinylation.

Enfin, par une approche pharmacologique avec l’utilisation d’inhibiteurs du protéasome, tels que le MG132 et l’ALLN, nous avons pu démontrer l’influence directe de l’ubiquitinylation de Erm, et plus particulièrement sa monoubiquitinylation, sur le potentiel transactivateur de ce facteur de transcription, et ce, indépendamment de son effet sur sa stabilité. Ces données suggèrent donc un double niveau de régulation de la protéine par cette modification post- traductionnelle : d’abord au niveau de son activité transactivatrice par monoubiquitinylation et ensuite au niveau de sa stabilité par polyubiquitinylation. Les résultats de ce travail sont présentés dans l’article « The 26S proteasome system degrades the ERM transcription factor and regulates its transcription-enhancing activity » actuellement sous presse dans la revue Oncogene.

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Résultats Structure et ubiquitinylation de Erm

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C.1.3. Conclusion, discussion et perspectives

Lors du premier projet présenté dans ce chapitre, nous avons produit et purifié les trois membres du groupe PEA3, Erm, Er81 et Pea3. Après avoir vérifié que la protéine purifiée est capable de lier in vitro les EBS du promoteur de la stromélysine par la technique de retard sur gel, nous avons analysé la structure secondaire de Erm par des études de dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge. Les résultats ainsi obtenus ont été mis en parallèle avec ceux des prédictions de structure faites in silico.

Il ressort de ces analyses que les prédictions de structuration en hélices α faites in silico sont en accord avec les expériences de dichroïsme circulaire et de spectrométrie infrarouge.

En effet, les prédictions proposent une proportion d’hélices α d’environ 13%, alors que les deux analyses structurelles précitées indiquent respectivement 11 et 16%. Dans les prédictions in silico, ces hélices α sont situées dans des domaines déjà connus, tels que le domaine ETS étudié par RMN et cristallographie (Liang et al., 1994 ; Werner et al., 1995; Donaldson et al., 1996; Batchelor et al., 1998) ou le domaine Nt analysé par dichroïsme circulaire (Defossez et al., 1997). Par ailleurs, ces analyses in silico font état de quatre autres hélices α dont deux situées de part et d’autre de l’hélice du domaine transactivateur Nt, la troisième se trouvant au sein de la région centrale inhibitrice de la liaison à l’ADN (CIDD) et la quatrième se situant dans la partie proximale de la région Ct de la protéine juste à coté du domaine ETS.

Les résultats relatifs aux feuillets β sont en revanche moins concordants. En effet, les prédictions in silico proposent 5% de feuillets β, alors que les analyses par spectrométrie infrarouge et dichroïsme circulaire indiquent respectivement 19 et 33%. Il semble que la spectrométrie infrarouge soit plus affine quant à la détermination de la structure en feuillet β, notamment suite à une plus grande absorptivité que présente une structure lors de cette analyse par rapport au dichroïsme circulaire (de Jongh et al., 1996). De plus, le pic majeur de contribution en feuillet β lors de l’analyse par spectrométrie infrarouge est généralement bien distinct des pics représentant les autres structures. Ce phénomène peut aussi s’expliquer par le fait qu’une partie des structures en feuillet β mesurées peuvent être la résultante de l’agrégation de la protéine. En effet, nous avons observé qu’à de fortes concentrations, la protéine Erm, et dans une moindre mesure les protéines Er81 et Pea3, ont tendance à s’agréger L’agrégation protéique s’accompagne habituellement de la formation de feuillets β

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(Prusiner, 1998; Ding et al., 2005). La diminution de la proportion de feuillets β lors de l’ajout de trifluoroéthanol (TFE) dans les analyses de dichroïsme circulaire peut s’expliquer par le fait que ce composé peut faciliter et stabiliser la structuration d’hélices α potentielles.

De plus, il agit aussi sur la réduction de l’agrégation protéique (Buck, 1998; Slupsky et al., 1995 ). Or, lors de l’ajout de TFE dans les analyses par dichroïsme circulaire, nous avons pu observer un accroissement de la structuration en hélices α au détriment des feuillets β, ces derniers passant de 33 à 11%. Il est donc probable qu’une partie de la proportion de feuillets β déterminée expérimentalement soit surestimée suite au phénomène d’agrégation protéique.

Outre le domaine ETS et les domaines transactivateurs Nt et Ct, une quatrième région de la protéine Erm joue un rôle fonctionnel important. Il s’agit du domaine CIDD compris entre les résidus 203 et 290, soit entre le domaine transactivateur Nt et le domaine ETS. Cette région est capable, en coopération avec le domaine Ct, d’inhiber la liaison à l’ADN (Laget et al., 1996; Kurpios et al., 2003). Les analyses bioinformatiques ne permettent pas d’identifier une structure, si ce n’est une courte hélice α au sein de cette région. Selon ces mêmes analyses, le domaine Ct ne contiendrait qu’une seule courte hélice, juste en aval du domaine ETS. Il apparaît donc que les domaines Ct et CIDD responsables de l’inhibition de la liaison à l’ADN sont très peu structurés. Pea3 possède lui aussi deux domaines inhibiteurs de liaison à l’ADN de part et d’autre du domaine ETS : le domaine Ct et un domaine correspondant aux résidus 280 à 360 de Erm. Cette dernière région est riche en résidus proline connus pour leur capacité à empêcher la formation de structures secondaires telles que les hélices α (Brown et al., 1998; Bojovic and Hassell, 2001). Ainsi, les prédictions bioinformatiques faites sur Pea3 suggèrent que ces deux régions inhibitrices de la liaison à l’ADN sont tout aussi peu structurées que pour Erm. Les membres du groupe PEA3 ne sont pas les seuls facteurs de transcription de la famille Ets dont la liaison à l’ADN est influencée par de telles régions.

Ainsi, Ets-1 possède aussi de part et d’autre du domaine ETS un domaine « autoinhibiteur » de la liaison à l’ADN (Dittmer, 2003). Ce domaine autoinhibiteur modulaire est composé de trois hélices (deux en amino-terminal et une en carboxy-terminal du domaine ETS) qui interagissent avec la première hélice α du domaine ETS pour bloquer ce domaine dans une conformation « fermée » empêchant de facto sa liaison à l’ADN. Cette répression de la liaison à l’ADN peut être potentialisée par l’action d’une kinase dépendante du Ca²⁺, et est levée suite à la déstructuration de la première hélice du domaine autoinhibiteur de la liaison à

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l’ADN ou à l’interaction entre ce domaine de Ets-1 et la protéine AML1 (Kim et al., 1999 ; Cowley and Graves, 2000 ; Garvie et al., 2002 ; Wang et al., 2002 ; Pufall et al., 2005).

Même s’il semble que la régulation de l’inhibition de la liaison à l’ADN de Erm soit différente de celle qui a pu être observée pour Ets-1, il existe au sein du CIDD plusieurs sites potentiels de modifications post-traductionnelles. Ainsi la phosphorylation de Er81 sur deux résidus, conservés pour la protéine Erm aux positions 223 et 248, entraîne une augmentation de son pouvoir transactivateur (Janknecht, 2001 ; Wu and Janknecht, 2002). De plus, des sites de sumoylation fonctionnels ont été récemment identifiés chez Erm. Parmi ces sites, trois sont situés dans le CIDD (aux positions 263, 293 et 350) et leur modification par le polypeptide SUMO entraîne une diminution du potentiel transactivateur de Erm sans toutefois moduler sa capacité à se lier à l’ADN (Degerny et al., 2005). Nous avons montré dans le second projet présenté dans ce chapitre que la protéine Erm peut être dégradée par le protéasome 26S, notamment suite à son ubiquitinylation, et que cette modification post-traductionnelle influence aussi son activité transactivatrice et ce, indépendamment de sa dégradation. Le domaine transactivateur Ct de Erm responsable de l’instabilité de la protéine semble conditionner la dégradation par le protéasome. Toutefois, la délétion de cette région n’influence pas le taux d’ubiquitinylation de la protéine, ce qui suggère que ce domaine pourrait agir comme un signal de dégradation en s’associant par exemple directement au protéasome. Un tel mécanisme a déjà été décrit pour la dégradation des protéines p21^Cip1 et IkBα par le protéasome 20S (Touitou et al., 2001; Alvarez-Castelao and Castano, 2005). Il n’est toutefois pas exclu que l’ubiquitinylation de Erm exerce aussi un rôle dans sa dégradation dépendante du protéasome. Les résidus polyubiquitinylés serviraient de site de reconnaissance par le protéasome et le domaine Ct de site d’initiation de la dégradation, ce qui est en accord avec une récente étude faisant état de la nécessité de la présence d’une région, autre que les résidus polyubiquitinylés, directement reconnue par le protéasome pour la dégradation rapide de la protéine (Prakash et al., 2004). Il est rapporté que cette région doit être non structurée. Aussi, les résultats issus de l’étude structurelle de Erm suggèrent que le domaine Ct n’est que très peu structuré puisqu’il semble ne présenter qu’une seule hélice α située juste en aval du domaine ETS.

Dans le cas de la sumoylation de Erm, la diminution du potentiel transactivateur n’est pas due à un différentiel de liaison à l’ADN (Degerny et al., 2005). En revanche, rien n’indique que l’ubiquitinylation sur Erm n’affecte pas sa liaison à l’ADN. En effet, les résidus

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cibles de cette modification n’ont pas encore pu être identifiés et certains pourraient se situer au sein du CIDD et en moduler l’activité. Aussi, comme perspective de ce travail, nous proposons tout d’abord d’identifier les résidus touchés par cette modification par une approche in vitro sur des délétants de Erm. Les sites potentiels d’ubiquitinylation ainsi identifiés pourraient ensuite être testés in cellulo après mutagenèse dirigée combinatoire.

Nous nous proposons aussi d’étudier l’influence de l’ubiquitinylation et plus particulièrement de la monoubiquitinylation sur la liaison à l’ADN de Erm notamment par des approches de modifications in vitro en lysats de réticulocytes déplétés pour la molécule d’ubiquitine où cette dernière serait remplacée par la forme mutante empêchant la polyubiquitinylation.

Enfin, nous avons débuté, sans succès, la cristallogenèse de la protéine Erm. Pour l’instant, nous n’avons pas encore identifié les conditions optimales quant à la formation d’un cristal. Ceci peut s’expliquer, par la tendance qu’à la protéine à s’agréger à de fortes concentrations, par le fait qu’une relativement grande proportion de la protéine semble ne pas être structurée, et très probablement par le fait que cette protéine est très instable (cf. le travail sur l’ubiquitinylation). Aussi, il nous semble intéressant d’investiguer la possible implication des modifications post-traductionnelles ciblant ce facteur de transcription et plus particulièrement le CIDD dans sa structuration. Nous proposons donc d’effectuer des analyses différentielles de ce domaine modifié post-traductionnellement in vitro par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge. Ce type d’expérience a déjà permis la mise en évidence, comme dans le cas de la β-caténine, d’une différence de conformation entre les formes phosphorylées ou non de la protéine (Megy et al., 2005) mais aussi, comme dans le cas de la protéine tau, la mise en évidence de l’apparition d’une hélice de polyproline suite à son hyperphosphorylation (Bielska and Zondlo, 2006). Nous envisageons aussi de réaliser la cristallogenèse de la forme modifiée post-traductionnellement ou non de cette portion de protéine. Une telle approche a déjà pu mettre en évidence que l’influence de la sumoylation sur l’activité de la thymine DNA glycosylase passe par un changement conformationnel de cette protéine (Steinacher and Schar, 2005; Baba et al., 2006).