UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Virologie Moléculaire
Relations structure-fonction de Erm, un membre du groupe PEA3 appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit
Sébastien MAUËN
Thèse de doctorat présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
2006
UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine
Laboratoire de Virologie Moléculaire
Relations structure-fonction de Erm, un membre du groupe PEA3 appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS
Promoteur de thèse : Professeur Yvan de Launoit
Sébastien MAUËN
Thèse de doctorat présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales
2006
« La flèche lancée par l’Adepte ne devait pas retomber »
Le passeur de lumière.
Bernard Tirtiaux.
Remerciements
J’adresse tout d’abord mes remerciements aux membres du jury qui me font l’honneur de juger ce travail,
Monsieur le Pr Gilbert Vassart (président de jury), Monsieur le Pr Daniel Christophe,
Monsieur le Dr Decio Eizirik, Monsieur le Dr Simon Saule, Monsieur le Dr Vincent Villeret.
Je voudrais ensuite remercier mon Directeur de thèse, le Pr Yvan de Launoit.
Cher Yvan, voilà cinq ans tu m’as donné la chance de réaliser mon mémoire au sein du laboratoire de Virologie Moléculaire que tu dirigeais jadis. Après cette étape, tu m’as permis de poursuivre mon travail et de réaliser cette thèse que je présente aujourd’hui. Pour tout cela mais aussi les longues discussions, la confrontation de nos points de vue respectifs sur certains sujets, ta disponibilité malgré un emploi du temps plus que chargé, la liberté que tu m’as laissée quant à l’orientation que j’ai donnée à ce travail, je te remercie du fond du cœur.
Je remercie ensuite tous les membres du laboratoire de Virologie Moléculaire:
Iolanda, Rachel, Pascale et anciennement Philippe, vous qui composez « l’équipe matinale » et que je retrouve toujours avec plaisir le matin devant un bon café. Merci pour votre bonne humeur, ces discussions que nous avons pu mener tambour battant mais aussi ces petites anecdotes et tranches de vie qui font de ce rendez-vous matinal un moment des plus agréables.
Carmen, Hélène, France, Benjamin et surtout Loïc, mes anciens et actuels « compagnons » de bureau et de paillasse. Merci pour vos conseils et votre bonne humeur mais aussi pour votre compréhension face au trust intensif de l’ordinateur dont j’ai pu faire preuve ces derniers mois.
Emmanuelle, un grand merci à toi pour nos longues discussions scientifiques ou non devant un café mais aussi pour les suggestions et conseils judicieux que tu as pu m’apporter tout au long de ce travail.
Merci enfin aux autres membres du laboratoire, David, Marylou, Perrine, Anne, François, et Nicole.
Le travail présenté dans cette thèse a été marqué par un esprit de collaboration entre notre laboratoire et plusieurs autres unités de recherche, aussi je tiens à remercier les différentes personnes qui ont participé avec plus ou moins de succès à ce travail :
Les Dr Jean-Luc Baert, Didier Monté et Marc Aumercier de l’Institut de Biologie de Lille, pour leur expertise sur les facteurs de transcription de la famille Ets.
Le Pr Rock Breton et son équipe du Centre de Recherche en Endocrinologie Moléculaire et Oncologique de l’Université de Laval, le Pr Victor Stalon et son équipe du service de Microbiologie de l’ULB, et surtout le Dr Nicole Moguilevsky, qui m’a si gentiment accueilli
un an durant au sein de son unité du service de génétique appliquée à Gosselies, pour leurs conseils, suggestions et savoir faire quant à la production et la purification de protéines.
Le Pr Jean Marie Ruysschaert et le Dr Vincent Raussens du service de Structure et Fonction des Membranes biologiques de l’ULB pour leur aide précieuse dans les études structurelles présentées dans ce travail.
Le Dr Vincent Villeret de l’Institut de Biologie de Lille et son équipe pour leur expertise dans l’étude cristallographique de protéines.
Le Dr Frédérick Libert de l’IRIBHM, pour son expertise dans la technique des micro-arrays.
Le Pr Muriel Moser et son équipe pour leur expertise dans la production d’anticorps monoclonaux
Le Pr Carine Van Lint et le Dr Dominique Demonté du service de Virologie Moléculaire de Gosselies pour leurs aides et conseils en biologie moléculaire.
Je tiens aussi à remercier le FRIA et le FNRS, via son opération Télévie, qui ont permis le financement et la réalisation de ce travail.
Je profite de cette occasion pour remercier les différentes personnes qui forment mon cercle familial et qui ont contribué à leur manière à la réalisation de ce travail :
Maman, merci pour les sacrifices que tu as consentis et merci de m’avoir laissé mener ma barque, de m’avoir laissé depuis bien longtemps décider de ce que je voulais faire sans jamais t’interposer dans mes choix quant à ma carrière et ma vie.
Colette, Guy, Sarah, Marianne et Michel, vous qui composez ma belle-famille, je vous remercie pour vos encouragements et toute l’aide que vous avez pu m’apporter durant ces dernières années.
Carine et le Chat, merci pour vos encouragements et votre soutien.
Julie, mon ange, mon amour, cela fait sept ans qu’on se connaît. Depuis toutes ces années, tu m’as encouragé lors des moments d’abattement, tu m’as remonté le moral aux moments où j’en avais besoin, tu as accepté tant d’absences au nom du travail sans jamais te plaindre, pour tout cela je te remercie du fond du cœur.
Je te remercie aussi pour ce petit rayon de soleil que tu nous as apporté un 3 juin il y a deux ans, notre fils Noah, que j’aime tout aussi profondément que toi. A vous deux vous êtes les piliers sur lesquels je peux me reposer à tout moment, vous représentez tout ce dont un homme peut rêver et c’est pour cela que je vous dédie ce travail.
Merci à vous tous,
Sébastien
Résumé
La grande famille des facteurs de transcription Ets est caractérisée par un domaine de liaison à l’ADN, le domaine ETS, qui présente une structure de type hélice-tour-hélice ailé et qui reconnaît la séquence nucléotidique GGAA/T. Ces facteurs sont des protéines modulaires, dont les domaines sont structurellement conservés, régulent la transcription de leurs gènes cibles. L’action régulatrice de ces facteurs de transcription, ainsi que leur spécificité, dépendent de leurs sites d’expression, du taux auquel ils sont exprimés ainsi que des modifications post-traductionnelles qui les touchent. Au sein de la famille Ets, les trois membres du groupe PEA3 - Erm, Pea3 et Er81 - sont impliqués dans divers processus tant physiologiques tels que le développement des neurones sensitifs et moteurs que pathologiques tels que la croissance et l’invasion tumorale ou l’apparition de métastases, au niveau mammaire notamment.
Notre travail a eu pour ambition de mieux comprendre les relations structure/fonction des membres du groupe PEA3, et plus particulièrement de Erm.
Pour réaliser l’étude structurelle des trois membres du groupe PEA3, nous les avons produits, via le système d’expression baculoviral, et purifiés. Dans ces conditions, nous avons obtenu plusieurs mg de la protéine Erm purifiée à plus de 95%. Nous avons dès lors réalisé des études par dichroïsme circulaire et spectrométrie infrarouge qui ont mis en évidence une faible structuration de la protéine. Ces résultats corrèlent avec les prédictions bioinformatiques pour la structuration en hélice α. Néanmoins, certaines divergences sont apparues en ce qui concerne la détermination de la structuration en feuillets β ; ces derniers étant probablement surévalués dans les études expérimentales suite à une forte propension à l’agrégation protéique. En parallèle, nous avons pris part à la démonstration du fait que la protéine Erm est modifiée par ubiquitinylation. Cette modification post-traductionnelle a pour conséquence de diriger Erm vers la voie de dégradation par le protéasome et donc de rendre ce facteur de transcription très labile. C’est ainsi qu’à l’heure actuelle, les tentatives de cristallisation de la protéine sont restées sans succès.
Afin de mettre en évidence les gènes régulés par les membres du groupe PEA3 dans le cancer mammaire métastatique, nous avons effectué des études par micro-array dans la lignée humaine MDA-MB-231. Lors d’expériences où l’expression de erm et de er81 a été diminuée par la technique des shRNA, nous n’avons malheureusement pas pu identifier de gènes dont l’expression était modulée de façon reproductible.
Enfin, dans le but de mieux cerner les mécanismes qui conduisent à la surexpression des facteurs de transcription du groupe PEA3, nous nous sommes intéressés à la régulation de leur expression. Aussi, suite au travail initié préalablement au laboratoire sur le gène erm humain, nous avons déterminé que la région promotrice située entre -344 à -321 pb est sensible à l’activation par la voie des PKCs conventionnelles (cPKCs). Cette région contient des sites putatifs de liaison pour les facteurs de transcription Pit-1, Oct-1, Hbp1, Cdx1 et 2, et un site CDE. Les expériences de mutagenèse dirigée et de retard sur gel indiquent que la régulation positive de erm par la voie des cPKCs semble être le résultat d’une levée de répression induite par un, voire plusieurs, répresseur(s) transcriptionnel(s) qui reste(nt) à identifier.
Abréviations
Abréviations
% Pourcent Aa Acide aminé
ADN Acide désoxyribonucléique ARN Acide ribonucléique
ARNm ARN messager
ATP Adénosine triphosphate
Bax Bcl2-associated X protein
CBP CREB Binding Protein
CIDD Central inhibitory domain of DNA binding COX Cyclooxygénase
CpG Dinucléotide composé d’une cytosine suivi d’une guanine Ct Carboxy-terminal(e)
DAG Diacylglycérol
DBD DNA Binding Domain
EBS Ets Binding Site
ERD Erf Repressor Domain
ERK Extracellular signal-regulated protein kinase
Ets E26 transformation specific ou E Twenty-Six
FGF Fibroblast Growth Factor
GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor HAT Histone acétyl-transférase
HCC Human hepatocellular carcinoma
HDAC Histone désacétylase
HGF Hepatocyte growth factor
HMT Histone méthyl-transférase IL Interleukine
iNos Inducible Nitric Oxide Synthase
IP3 Inositol trisphosphate
JNK c-Jun N-terminal kinase
kpb Kilo Paires de bases kDa KiloDalton
MAPK Mitogen activated protein kinase
MMP Métalloprotéases de la matrice (Matrix metalloprotase) NAD+ Nicotinamide adénine dinucléotide
nm nanomètre
NSCLC(s) Non-small-cell lung cancer(s)
Nt Amino-terminal(e) pb Paire(s) de bases
pCAF CBP-associated factor
PCR Polymerase Chain Reaction
PDK Phosphoinositide-dependent kinase
PIC Pre-initiation complex
PIP2 Phosphatidylinositol (4,5) diphosphate
Abréviations
PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate PKA Protéine kinase dépendante de l’AMPc PKC Protéine kinase C
PLC Phospholipase C
PMA 12-phorbol 13-myristate acétate
RNAPII ARN polymérase de type II
RMN Résonance Magnétique Nucléaire
RSK-1 p90 ribosomal S6 kinase 1
RT-PCR Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction SAPK Stress-activated protein kinase
SEK SAPK/ERK kinase
shRNA small hairpin RNA
SP-C Surfactant protein C
STAT4 Signal transducer and activator of transcription SUMO Small ubiquitin-related modifier
TAD Transactivation Domain
TFE Trifluoro-éthanol TBP TATA Binding Protein
TGF Transforming Growth Factor
TMPRSS2 Transmembrane protease, serine 2 TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
TRE TPA Responsive Element
Ttox Thyméléatoxine
Ubc9 Ubiquitin Conjugating Enzyme 9
uPa Urokinase (Urokinase Plasminogen Activator)
Tables des Matières
Table des matières
A. INTRODUCTION
... 1A.1. La régulation de l’expression génique
... 1Les acteurs de la régulation transcriptionnelle
... 1A.1.1. La chromatine... 2
A.1.1.1. Les modifications covalentes du nucléosome ... 3
L’acétylation et la désacétylation des histones ... 3
La phosphorylation des histones... 5
La méthylation des histones ... 6
Ubiquitinylation et sumoylation des histones ... 7
A.1.1.2. Les modifications non covalentes du nucléosome... 8
A.1.1.3. La méthylation de l’ADN ... 9
A.1.2. La machinerie basale de transcription ...10
A.1.3. Les facteurs régulateurs de la transcription ...11
A.1.3.1. Les domaines fonctionnels des facteurs de transcription ... 11
Les domaines de liaison à l’ADN ... 12
Les domaines régulateurs ... 13
A.1.3.2. Modulation de l’activité des facteurs de transcription... 14
Les modifications post-traductionnelles... 14
Les cofacteurs transcriptionnels ... 16
Les co-activateurs transcriptionnels... 17
Les co-répresseurs transcriptionnels... 17
A.2. Les facteurs de transcription de la famille ETS
... 19A.2.1. Phylogénie de la famille... 19
A.2.2. Les facteurs de transcription Ets : des protéines aux domaines multiples... 20
A.2.2.1. Le domaine ETS ... 21
Tables des Matières
A.2.2.2. Les domaines modulateurs de la transcription... 22
A.2.3. Rôles biologiques... 23
Les facteurs de transcription du groupe PEA3... 24
A.2.4. Organisation génétique et évolution au sein des espèces... 24
A.2.5. Des activateurs transcriptionnels aux domaines conservés... 25
A.2.6. Modulation du potentiel régulateur des facteurs de la famille Ets... 26
A.2.6.1. Partenaires protéiques et régulation transcriptionnelle ... 26
A.2.6.2. Modifications post-traductionnelles des membres du groupe PEA3 : Implication sur la régulation transcriptionnelle ... 27
A.2.7. Rôles biologiques des facteurs de transcription du groupe PEA3 ... 29
A.2.7.1. Implication dans l’embryogenèse et la morphogenèse... 29
A.2.7.2. Expression chez l’adulte... 31
A.2.7.3. Les gènes cibles ... 31
A.2.7.4. Implication dans l’oncogenèse... 32
Dans les cancers de la cavité buccale ... 33
Dans le cancer du poumon... 33
Dans les cancers gastro-intestinaux ... 34
Dans les cancers « gynécologiques » ... 34
Réarrangements chromosomiques et leur implication dans le cancer ... 36
A.2.8. Les membres du groupe PEA3 : des protéines régulatrices de la transcription régulées transcriptionnellement... 36
B. OBJECTIFS DE CE TRAVAIL
... 39C. RESULTATS
... 40C.1. Etude de la structure et des modifications post-traductionnelles de la protéine Erm
... 40C.1. Expression, purification et prédictions structurelles du facteur de transcription Erm... 40
C.1.1.1. Contexte... 40
Tables des Matières
C.1.1.2. Stratégie... 40
C.1.1.3. Article... 42
C.1.1.4. Résultats complémentaires... 52
C.1.2. L’ubiquitinylation de Erm induit sa dégradation et régule positivement son pouvoir transactivateur... 55
C.2.1. Contexte... 55
C.2.2. Stratégie... 56
C.2.3. Article... 57
C.1.3. Conclusion, discussion et perspectives... 67
C.2. Identification de nouveaux gènes cibles des facteurs de transcription Erm et Er81
... 71C.2.1. Contexte... 71
C.2.2. Stratégie... 71
C.2.3. Résultats... 72
Diminution de l’expression de erm et er81 par shRNA... 72
Résultats de l’analyse par micro-array (1)... 72
Confirmation des différentiels d’expression par RT-PCR ... 73
Résultats de l’analyse par micro-array (2)... 74
Confirmation des différentiels d’expression par RT-PCR (2) ... 75
C.2.4. Conclusion, discussion et perspectives... 75
C.3. Régulation de l’expression de Erm par la voie cPKC dans les cellules lymphoblastiques Molt4
... 77C.3.1. Contexte... 77
La famille des protéines kinases C (PKC)... 77
C.3.2. Stratégie... 84
C.3.3. Résultats... 85
Identification de la région du promoteur de erm sensible à l’activation de la voie des PKCs conventionnelles... 85
Tables des Matières
AP-1 n’est pas l’ « acteur » principal impliqué dans l’augmentation
de l’expression de erm suite à l’activation de la voie des cPKCs... 87
Sites de liaison potentiels de facteurs de transcription se liant à la région – 344 et -321 du promoteur de erm ... 89
C.3.4. Conclusion, discussion et perspectives... 91
D. Annexes
... 96D.1. Article Annexe
... 96D.2. Protocoles Annexes
... 107D.2.1. RT-PCR... 107
D.2.2. Oligonucléotides utilisés lors des amplifications par RT-PCR... 108
D.2.3. Marquage et purification de la sonde pour retard sur gel... 110
D.2.4. Préparation des extraits nucléaires... 111
D.2.5. Retard sur gel... 112
D.2.6. Mutagenèse dirigée... 113
D.2.7. Oligonucléotides utilisés lors de la mutagenèse dirigée... 114
D.3. Résultats Annexes
... 115D.3.1. Micro-array après diminution de l’expression de erm et er81 dans des cellules MDA-MB-231... 115
D.3.2. Sites putatifs de liaison de facteurs de transcription dans la région du promoteur de erm comprise entre -420 et +95 pb... 121
D.3.3. Sites putatifs de liaison de facteurs de transcription après mutagenèse dirigée ... 123