Thesis
Reference
Caractérisation, identification et quantification de biomarqueurs et principes actifs dans des compléments alimentaires ou des
phytopréparations
MATHON, Caroline
Abstract
Les compléments alimentaires ne sont pas soumis à des contrôles qualités stricts et sont facilement accessibles. Partant de ces constatations, le Service de la consommation et des affaires vétérinaires de Genève fait régulièrement des campagnes d'analyses pour vérifier la qualité et l'innocuité de ces produits, en particulier les produits à base de plantes. Pour limiter le nombre d'analyses, une méthode LC-MS/MS générique et évolutive a été développée afin d'identifier un maximum de végétaux (90 plantes en juin 2014) en une seule analyse de 15 minutes. Pour cela, chaque plante a été associée à un ou plusieurs biomarqueurs, caractérisés par un temps de rétention, deux transitions de masse et trois spectres de masse générés à trois énergies de collision. Parallèlement à cette méthode générique, plusieurs méthodes spécifiques ont été mises au point et validées afin de détecter et quantifier des toxines naturelles. Des alcaloïdes pyrrolizidiniques hépatotoxiques ont été recherchés dans des thés et infusions dans le but d'étayer une évaluation des risques menée par [...]
MATHON, Caroline. Caractérisation, identification et quantification de biomarqueurs et principes actifs dans des compléments alimentaires ou des phytopréparations. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2014, no. Sc. 4715
URN : urn:nbn:ch:unige-415019
DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:41501
Available at:
http://archive-ouverte.unige.ch/unige:41501
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Section des Sciences Pharmaceutiques Dr Philippe Christen
S
ERVICE DE LA CONSOMMATION ET DES AFFAIRES VÉTÉRINAIRES DEG
ENÈVESecteur des Analyses Générales Dr Stefan Bieri
Caractérisation, identification et quantification de biomarqueurs et principes actifs dans des compléments alimentaires ou des
phytopréparations
T
HÈSEPrésentée à la Faculté des sciences de l’université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques
par
Caroline Mathon
de
Besançon (France)
Thèse N° 4715 GENÈVE Atelier ReproMail
2014
Par ces quelques mots, je souhaite exprimer ma gratitude à toutes les personnes ayant plus ou moins directement contribué à l’aboutissement de ce travail de thèse.
Tout d’abord, ce travail a été possible grâce à une étroite collaboration entre le service de la consommation et des affaires vétérinaires de Genève et le laboratoire de pharmacognosie de la section des sciences pharmaceutiques de l’université de Genève.
Ainsi, je remercie vivement Dr Patrick Edder, chimiste cantonal, et Professeur Muriel Cuendet, responsables respectifs de ces deux entités, de m’avoir donné la chance de travailler dans leurs groupes.
Je tiens à exprimer mes plus sincères remerciements à mon directeur de thèse, Dr Philippe Christen, et tout autant de gratitude à mon codirecteur Dr Stefan Bieri. Je vous remercie pour toute l’attention que vous avez portée à ce travail. Je vous remercie pour votre grande disponibilité tout au long de ces années, malgré vos nombreuses et importantes charges de travail. Votre rigueur, votre clairvoyance et vos compétences m’ont beaucoup apporté. Je vous suis particulièrement reconnaissante pour votre encadrement, votre enthousiasme, votre soutien et toutes les discussions intéressantes que nous avons eues. Du coup, MERCI.
Je souhaite remercier le professeur Jean-Luc Wolfender, le Dr Olivier Potterat, ainsi que le Dr Patrick Edder pour avoir accepté de juger ce travail de thèse et pour leur lecture attentive. Leurs commentaires et remarques pertinentes ont contribué à l’amélioration de ce manuscrit.
Ces années de doctorat ont été l’occasion de nombreuses interactions et rencontres avec des collaborateurs, des chercheurs, des doctorants, des stagiaires... Je tiens à remercier toutes les personnes de l’entreprise CAMAG de Muttenz. Tout particulièrement le Dr Eike Reich et le Dr Anita Ankli avec qui de nombreux échanges intéressants ont eu lieu à travers plusieurs projets. Mes remerciements vont également aux collaborateurs de l’office fédéral de la sécurité alimentaire des affaires vétérinaires pour les nombreuses discussions enrichissantes et fortes en échanges d’idées.
Spécialement Alex GGP. pour son dynamisme et la découverte de Bouli, Charlotte P. pour son optimisme, Julien B. pour sa zénitude, Marco G. R. pour toute sa bonne humeur communicative et Soura C. pour son écoute.
Je remercie tout autant mes collègues du SCAV, en particulier les personnes des Analyses Générales. Charlyne S., Christophe B., Pierre Z. : super coloc de bureau, Véronique S. et Yves J., vous m’avez apporté beaucoup, tant humainement que scientifiquement.
Durant ces années de doctorat à Genève, j’ai rencontré des personnes formidables et eu un soutien inconditionnel de plusieurs amis. Je tiens à vous remercier pour votre appui, votre présence et tous les superbes moments que nous avons partagés. Dr Adeline C., qui a pris le navire doctorat en marche en même temps que moi. Monique D. tu m’as appris énormément, je te dois beaucoup. Dr Nadine B. et Dr Philippe E. votre expérience a été d’une grande aide et m’a permis d’éclairer à de nombreuses reprises ma lanterne. Dr Florence M. ta présence et tes conseils sont très motivants. Erika B. merci pour tous ces moments conviviaux, ta disponibilité et ton écoute. Sandra V., c’est à tes côtés que j’ai commencé la phyto.
Un grand merci à toutes les personnes qui m’ont permis de m’aérer l’esprit pour augmenter mon efficacité au travail, Emilie C., Marinette M., Natalie S. et tous les autres.
Enfin, je souhaite remercie du fond du cœur ma famille pour être toujours présente.
Merci Lionel pour la relecture attentive de ce manuscrit. Merci papa. Merci maman pour ton soutien. Merci mes frère et sœurs chéris d’être vous-mêmes et toujours disponibles. Et un grand merci à mes neveux, dont les sourires et l’innocence sont venus apporter apaisement, joie et bonheur à ces belles années de thèse.
T
ABLE DES MATIÈRESRemerciements i
Table des matières 1
Résumé 7
Communications scientifiques 9
Liste des abréviations 13
Avant-propos 17
Chapitre 1. Introduction 21
1.1 Les compléments alimentaires ... 21
1.1.1 Les règlementations et définitions ... 21
1.1.1.1 Composition ... 22
1.1.1.2 Allégations ... 22
1.1.2 Les phytopréparations et autres suppléments nutritionnels ... 23
1.1.3 Le marché des compléments alimentaires... 24
1.1.3.1 Consommation mondiale ... 24
1.1.3.2 Consommation européenne ... 25
1.1.3.3 Consommation suisse ... 25
1.1.3.4 Consommation française ... 26
1.1.4 Les risques liés aux compléments alimentaires et phytopréparations ... 28
1.1.4.1 Automédication ... 28
1.1.4.2 Informations annoncées erronées ... 29
Toxicité et confusion des végétaux ... 30
a. Toxicité aiguë ... 30
Toxicité chronique ... 31
Confusion ... 32
Emballage et allégations ... 33
b. Adultération ... 33
c. 1.2 Approches analytiques ... 34
1.2.1 Echantillonnage ... 35
1.2.2 Préparation d’échantillons ... 36
1.2.2.1 Extraction ... 37
Extraction solide-liquide ... 37
a. Extraction sur phase solide ... 39
b. Extraction liquide-liquide ... 40 c.
1.2.2.2 Filtration ... 41
1.2.3 Chromatographie ... 41
1.2.3.1 Chromatographie en phase liquide ... 47
Phases monolithiques... 49
a. Phases sub-2 µm, ultra-haute performance ... 50
b. Phases core-shell ... 51
c. Phases HILIC... 52
d. Phases permettant la séparation de stéréo-isomères ... 52
e. 1.2.3.2 Chromatographie gazeuse bidimensionnelle ... 53
1.2.3.3 Chromatographie sur couche mince ... 55
1.2.4 Détection ... 59
1.2.4.1 Spectrométrie de masse ... 60
Sources d’ionisation ... 61
a. Sources compatibles avec la LC ... 62
Sources compatibles avec la GC ... 65
Sources de désorption... 66
Analyseurs de masse ... 67
b. Quadripôle ... 68
Triple quadripôle ... 70
Time-of-flight... 75
Orbitrap ... 76
Tandem Orbitrap ... 78
Comparaison des analyseurs de masse ... 79
Détecteurs ... 80
c. 1.2.4.2 Spectrophotométrie UV-visible ... 81
1.3 Bibliographie et références ... 82
1.3.1 Bibliographie ... 82
1.3.2 Références ... 83
Chapitre 2. Recherche de biomarqueurs d’origine végétale dans des compléments alimentaires et phytopréparations par HPLC-MS/MS 91 2.1 Résumé ... 91
2.2 Introduction ... 97
2.3 Materials and method ... 98
2.3.1 Botanicals, chemicals and reagents ... 98
2.3.2 Herbal food supplements ... 99
2.3.4 HPLC-ESI-MS/MS ... 99
2.3.5 Matrix effect assessments ... 101
2.4 Results and discussion ... 102
2.4.1 Method development ... 102
2.4.1.1 Qualitative analysis ... 106
2.4.1.2 Limits of quantification and matrix effects ... 108
2.4.2 Applications ... 111
2.5 Conclusions ... 113
2.6 References ... 113
Chapitre 3. Recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques dans des thés et infusions du marché suisse par HPLC/MS-MS 117 3.1 Résumé ... 117
3.2 Introduction ... 121
3.3 Materials and method ... 122
3.3.1 Standards, reagents and samples ... 122
3.3.2 Sample preparation ... 124
3.3.3 Plant extracts... 124
3.3.4 HPLC-MS/MS parameters... 124
3.3.5 High resolution mass spectrometry ... 125
3.3.6 Isomer separation ... 126
3.3.7 Validation ... 127
3.4 Results and discussion ... 127
3.4.1 Compound identification ... 128
3.4.2 High mass resolution analyses ... 129
3.4.3 Validation ... 132
3.4.4 PA concentrations in beverages ... 133
3.4.5 Botanical composition of 70 samples ... 135
3.4.6 Plant extraction ... 136
3.5 Conclusion ... 136
3.6 Acknowledgments ... 137
3.7 References ... 138
3.8 Supplementary data ... 141
Chapitre 4. Quantification de l’anisatine dans plusieurs espèces d’anis étoilés par HPLC-
MS/MS 145
4.1 Résumé ... 145
4.2 Introduction ... 149
4.3 Materials and method ... 150
4.3.1 Chemicals ... 150
4.3.2 Plant samples ... 150
4.3.3 Sample preparation ... 151
4.3.4 Purification ... 151
4.3.5 LC-MS conditions ... 152
4.3.6 Matrix effect characterisation ... 153
4.3.7 Calibration and validation ... 154
4.3.8 Infusion ... 155
4.4 Results and discussion ... 155
4.4.1 Extraction ... 155
4.4.2 Purification ... 155
4.4.3 Matrix effect assessments ... 156
4.4.4 Separation ... 158
4.4.5 Method validation ... 159
4.4.6 Analysis of star anise ... 160
4.4.7 Infusion ... 161
4.5 Conclusion ... 162
4.6 Acknowledgments ... 163
4.7 References ... 163
Chapitre 5. Identification formelle et dosage de la caféine dans des infusions de tilleul par UHPLC-MS/MS 167 5.1 Résumé ... 167
5.2 Introduction ... 170
5.3 Materials and method ... 171
5.3.1 Chemicals and samples ... 171
5.3.2 Sample preparations ... 171
5.3.3 UPLC-TOF-HRMS... 171
5.3.4 GC×GC-TOF-MS ... 172
5.3.5 UPLC-MS/MS conditions ... 173
5.3.6 Calibration and validation ... 173
5.3.7 Brewing times... 174
5.4 Results and discussion ... 174
5.4.1 Validation ... 177
5.4.2 Brewing times... 179
5.4.3 Analysis of linden teas ... 179
5.4.4 Significance of caffeine content ... 180
5.5 Conclusion ... 181
5.6 Acknowledgements ... 181
5.7 References ... 182
Chapitre 6. Dosage de la sibutramine par HPTLC-UV dans des compléments alimentaires amaigrissants 185 6.1 Résumé ... 185
6.2 Introduction ... 189
6.3 Materials and methods ... 190
6.3.1 Standards, reagents, and samples ... 190
6.3.2 Sample preparation ... 191
6.3.3 HPTLC parameters ... 191
6.3.4 Method validation ... 192
6.3.5 TLC-MS ... 192
6.3.6 HPTLC-UV, HPLC-UV, and HPLC-MS comparisons ... 193
6.4 Results and discussion ... 194
6.4.1 TLC-MS ... 195
6.4.2 HPTLC-UV, HPLC-UV, and HPLC-MS comparisons ... 196
6.4.3 Analysis of diet food ... 197
6.5 Conclusion ... 198
6.6 References ... 199
6.7 Application note ... 202
6.7.1 Introduction ... 203
6.7.2 Sample preparation ... 204
6.7.3 Layer ... 204
6.7.4 Sample application ... 204
6.7.5 Calibration and spiked samples ... 204
6.7.6 Chromatography ... 204
6.7.7 Densitometry... 205
6.7.8 Mass spectrometry... 205 6.7.9 Results and discussion ... 206
Chapitre 7. Discussion et Perspectives 209
Annexes 213
Annexe I. Les compléments alimentaires en chiffres ... 214 Annexe II. Liste des plantes et herbes dans les denrées alimentaires ... 215 Annexe III. Posters ... 227
R
ÉSUMÉDepuis une quinzaine d’années, la consommation de compléments alimentaires et boissons additionnelles est en forte et quasi constante augmentation dans les pays occidentaux. Les compléments alimentaires, cocktails de vitamines, de minéraux et/ou extraits de plantes sont largement répandus dans le monde. En Suisse, environ ¼ de la population consomme régulièrement des compléments alimentaires. La tendance actuelle est d’avoir recours à des produits traditionnels et naturels, considérés comme sains par les consommateurs.
Les compléments alimentaires, étant par définition des denrées alimentaires, ne sont pas soumis à des contrôles qualités stricts et sont facilement accessibles. Partant de ces constatations, le service de la consommation et des affaires vétérinaires de Genève fait régulièrement des campagnes d’analyses pour vérifier la qualité et l’innocuité de ces produits, en particulier les produits à base de plantes. De nombreuses méthodes analytiques existent pour détecter des végétaux mais sont en général limitées à la détection d’un composé ou d’une classe de composés. Afin de gagner du temps en limitant le nombre d’analyses pour une même préparation, une méthode générique a été développée. Le but de cette méthode évolutive est de déceler, sans a priori sur leur contenu, un maximum de végétaux indésirables dans les compléments alimentaires en une seule analyse. Pour ce faire, chaque plante a été associée à un ou plusieurs biomarqueurs. Ces composés ont été caractérisés par un temps de rétention en HPLC, deux transitions de masse et également trois spectres de masse générés à trois énergies de collision, à l’aide d’un triple quadripôle avec trappe à ions linéaire. Dans les matrices biologiques complexes que sont les compléments alimentaires, il est nécessaire d’avoir de nombreux points d’identification pour reconnaitre de façon non ambiguë un composé et la plante qui lui est associée. En juin 2014, la méthode comptait 115 biomarqueurs permettant la caractérisation de 90 végétaux, en une seule analyse de 15 minutes.
En parallèle à cette méthode générique, des méthodes spécifiques ont été mises au point et validées dans le but de détecter des composés cibles. En effet, des méthodes spécifiques sont nécessaires pour la mise en évidence et surtout la quantification de composés présents en faible concentration ou dont la préparation d’échantillon ne pouvait pas être générique car trop peu sensible. La méthode générique nécessite une extraction non spécifique ce qui limite la sensibilité des analyses. Plusieurs méthodes basées sur une
séparation en HPLC couplée à une détection en spectrométrie de masse ont permis la détection et la quantification de toxines naturelles présentes dans les plantes. Des alcaloïdes pyrrolizidiniques ont été recherchés dans des thés et infusions dans le but d’étayer une évaluation des risques menée par l’Office fédéral de la sécurité alimentaire et des affaires vétérinaires liée à ces composés. Une autre méthode a été développée pour extraire de façon spécifique l’anisatine des anis étoilés et la quantifier par HPLC-MS/MS.
Différentes techniques orthogonales de séparations chromatographiques (GC, LC) et de détection (TOF-HRMS, TOF-HSMS, MS/MS) ont été utilisées pour confirmer la présence de caféine dans des infusions pour faciliter l’endormissement à base de tilleul. La caféine a ensuite été quantifiée par UPLC-MS/MS dans des infusions de tilleul.
Une technicité de détection et de quantification moins onéreuse, à savoir la HPTLC couplée à la spectrophotométrie UV a été développée pour doser l’adultération en sibutramine dans des compléments amaigrissants achetés via l’Internet.
C
OMMUNICATIONS SCIENTIFIQUESArticles
Survey of pyrrolizidine alkaloids in teas and herbal teas on the Swiss market using HPLC-MS/MS
C. Mathon, P. Edder, S. Bieri, P. Christen. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Accepté le 27 août 2014.
Unexpected occurrence of caffeine in sleep-inducing herbal teas
C. Mathon, P. Edder, P. Christen, S. Bieri. CHIMIA. 2014. 68: 705-709.
10.2533/chimia.2014.705
Screening and determination of sibutramine in adulterated herbal slimming supplements by HPTLC-UV densitometry
C. Mathon, A. Ankli, E. Reich, S. Bieri, P. Christen. Food Additives & Contaminants: Part A.
2014. 31: 15-20. 10.1080/19440049.2013.861934
Analysis of the neurotoxin anisatin in star anise by LC-MS/MS
C. Mathon, B. Bongard, M. Duret, D. Ortelli, P. Christen, S. Bieri. Food Additives &
Contaminants, Part A. 2013 .30:1598-1605. 10.1080/19440049.2013.804955
Multi-targeted screening of botanicals in food supplements by liquid chromatography with tandem mass spectrometry
C. Mathon, M. Duret, M. Kohler, P. Edder, S. Bieri, P. Christen. Food Chemistry. 2013. 138:
709-717. 10.1016/j.foodchem.2012.10.091
Note d’application
HPTLC determination of sibutramine in adulterated herbal slimming supplements
C. Mathon, A. Ankli, E. Reich, S. Bieri, P. Christen. Camag Bibliography Service. CBS 112. 2014
Communications orales
Food, food supplements: Are they really healthy?
C. Mathon, B. Bongard, M. Duret, D. Ortelli, P. Edder, P. Christen, S. Bieri; PhD Day, Hermance (Suisse), 31 mai 2013.
Targeted screening of botanicals in herbal dietary supplemnts by LC-MS/MS with an Information Dependent Acquisition approach
C. Mathon, NRC Workshop – Natural Products in Health and Food Sciences, Nestlé Research Center, Lausanne (Suisse), 16 mars 2012.
Targeted screening of botanicals in herbal dietary supplements by LC-MS/MS
C. Mathon, International symposium on phytochemicals in nutrition and health, Bari (Italie), 27-30 septembre 2011.
Targeted screening of botanicals in herbal dietary supplements by LC-MS/MS
26ème séminaire de 3ème cycle en sciences pharmaceutiques, "Analysis on the top", Zermatt (Suisse), 5-9 septembre 2011.
Posters
Unexpected occurrence of caffeine in sleep inducing beverages
C. Mathon, E. Edder, S. Bieri, P. Christen, Meeting of Swiss Analytical Scientists CHanalysis, 29-30 novembre 2013, Beatenberg (Suisse).
Analytical strategy for the screening of botanicals in food supplements
C. Mathon, M. Duret, P. Edder, S. Bieri, P. Christen, Swiss Pharma Science Day, 28 août 2013, Berne (Suisse).
ANISATIN: a neurotoxin occurring in various star anise species
C. Mathon, B. Bongard, M. Duret, D. Ortelli, P. Christen, S. Bieri, Current and future food safety issues: Not Intentionally Added Substances (NIAS), SFSM, 27-28 juin 2013, Neuchâtel (Suisse).
Screening and determination of sibutramine in adulterated herbal slimming supplements by HPTLC
C. Mathon, M. Duret, A. Ankli, E. Reich, S. Bieri, P. Christen, International Symposium for Thin-Layer Chromatography, 6-8 juillet 2011, Bâle (Suisse).
L
ISTE DES ABRÉVIATIONSLes abréviations utilisées au cours de ce travail sont répertoriées ci-dessous. Une partie d’entre elles sont des acronymes anglais, reconnus par la communauté scientifique internationale.
α facteur de sélectivité
ADC automatic developing chamber AED atomic emission detector AGC automatic gain control
AFSSA agence française de sécurité sanitaire des aliments
ANSES agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail
APCI atmospheric pressure chemical ionization APPI atmospheric pressure photoionization ASE accelerated solvent extraction
ATS automatic TLC sampler
BM biomarker
Bw body weight
CA compléments alimentaires CE collision energy
CES collision energy spread CI chemical ionization CIS cooled injection system CM concentration phase mobile cps counts per second
CS concentration phase stationnaire CVr repeatability
CVR intermediate fidelity
Da Dalton
DART direct analysis in real time DDA data dependent acquisition
DFI département fédéral de l’intérieur ECD electron capture detector
EFSA European Food Safety Authority, autorité européenne de sécurité des aliments
EI electron impact ionization
ELSD evaporative light scattering detector
EMS enhanced MS
EPI enhanced product ions ESI electrospray ionization ER extraction recovery
eV electron volt
EY extraction yield
FDA Food and Drug Administration FID flame ionisation detector FLD fluorescence detector FWHM full width at half maximum
GC gas chromatography, chromatographie en phase gazeuse H hauteur équivalente à un plateau théorique
HFS herbal food supplements
HILIC hydrophilic interaction liquid chromatography HPLC high performance liquid chromatography HPTLC high performance thin layer chromatography HRMS high resolution mass spectrometry
HSMS high speed mass spectrometry ICR ion cyclotron resonance
i.d. internal diameter, diamètre interne IDA information dependent acquisition ISTD internal standard
k coefficient de rétention K coefficient de partage LC chromatographie liquide
LDAI loi fédérale sur les denrées alimentaires et les objets usuels
LIT linear ion trap
LLE liquid-liquid extraction LOD limit of detection LOI limit of identification LOQ limit of quantification m/z mass-to-charge ratio
MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
MF matrix factor
MOE margin of exposure
MRM multiple reaction monitoring
MS mass spectrometry
N nombre de plateaux théorique
NL neutral loss
ODAIOUs ordonnance sur les denrées alimentaires et les objets usuels OFSP Office fédéral de la santé publique
OSAV Office fédéral de la sécurité alimentaire et des affaires vétérinaires PA pyrrolizidine alkaloids, alcaloïdes pyrrolizidiniques
PANO pyrrolizidine alkaloids N-oxide PE process efficiency
PGC porous graphitic carbon column PFP pentafluorophenyl
PTFE polytetrafluoroethylene
Q quadripôle
QC quality control QqQ triple quadripôle
QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe RevFit reverse fit
RMN résonnance magnétique nucléaire
RP reversed phase
RPC chromatographie phase inverse (de polarité)
RS résolution
RT room temperature
SCAV Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires SIM selected ion monitoring
SLE solid-supported liquid-liquid extraction, extraction liquide-liquide sur support solide
S/N signal to noise ratio
SPE solid phase extraction, extraction sur phase solide SRM selected reaction monitoring
TDU thermal desorption unit
Th Thomson
TIC total ion chromatogram
TLC thin layer chromatography, chromatographie sur couche mince
tM temps mort
TN true negative
TOF time of flight
TP true positive
tR retention time
u unité de masse atomique, 1 u = 1.660 540 × 10–27 kg UHPLC ultra high performance liquid chromatography UPLC ultra high performance liquid chromatography
UV ultraviolet
VS validation standard
W largeur de pic
A
VANT-
PROPOSCocktails de vitamines, de minéraux et/ou extraits de plantes, les compléments alimentaires sont largement répandus en Suisse avec plus de ¼ de la population qui en consomme régulièrement. Depuis une quinzaine d’années, la consommation de compléments alimentaires et boissons additionnelles destinés à compléter l’alimentation, en particulier les produits à base de plantes, est en forte et quasi constante augmentation dans les pays occidentaux. Cette consommation moderne de produits issus de plantes qui portent des allégations « naturel » s’inscrit dans la suite des médecines traditionnelles ancestrales comme les médecines chinoise ou ayurvédique. La tendance actuelle est d’avoir recours à des produits traditionnels et naturels, considérés comme sains par les consommateurs, dont l’objectif principal est d’améliorer sa santé. Ces denrées complémentaires à l’alimentation représentent une importante niche économique et de par leur définition ne sont pas soumis à des contrôles de qualité stricts.
De plus, la facilité d’accès à ces produits et la non-nécessité d’autorisation de mise sur le marché en font des produits pouvant induire des problèmes de santé publique.
Toutefois, les législations européenne et suisse se sont renforcées ces dernières années en termes d’allégations autorisées. Quant aux plantes et végétaux autorisés à entrer dans la composition des compléments alimentaires, l’Europe est en train d’édicter des directives. La Suisse a mis en place une liste de plus de 300 végétaux, afin de distinguer ceux ayant des propriétés thérapeutiques de ceux pouvant être incorporés dans des compléments alimentaires.
Ce travail de thèse est consacré à l’étude de compléments alimentaires à base de plantes, en particulier de ceux annoncés comme « naturels » et diverses boissons chaudes. Il a été effectué en collaboration entre le groupe de pharmacognosie de la Section des sciences pharmaceutiques de l’Université de Genève et de l’Université de Lausanne (EPGL), sous la direction du Docteur Philippe Christen et le secteur des analyses générales du Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires (SCAV) de Genève, sous la co-direction du Docteur Stefan Bieri.
Objectif
Basé sur les risques liés à la consommation de suppléments nutritionnels, et afin d’augmenter la sécurité du consommateur, ce travail de thèse est axé sur la mise au point de méthodes pour l’analyse d’échantillons complexes à base de plantes.
L’objectif de ce travail était de mettre au point des méthodes analytiques permettant de contrôler l’adéquation entre les plantes contenues dans les compléments alimentaires et les directives et règlementations en vigueur.
Structure du manuscrit
Ce manuscrit est divisé en sept chapitres :
Le Chapitre 1 est une introduction du sujet. Il est constitué de deux parties. La première partie est consacrée aux compléments alimentaires, à leur définition et aux règlementations les concernant. La seconde partie décrit des approches analytiques utilisées pour l’analyse de denrées alimentaires.
Les chapitres 2 à 6 sont basés sur des publications publiées ou soumises pendant ce travail de thèse.
Le Chapitre 2 décrit une méthode générique et évolutive élaborée pour la détection simultanée de nombreuses plantes par l’intermédiaire de biomarqueurs. Cette méthode basée sur une séparation HPLC et un mode de détection IDA en MS combinant la recherche de transitions de masse puis la caractérisation des ions détectés par trois spectres de masse complémentaires à fait l’objet d’une publication. Cette méthode et les résultats d’une campagne d’analyse de plus de 100 compléments alimentaires sont présentés dans ce chapitre.
Le Chapitre 3 présente le développement et la validation d’une méthode HPLC-MS/MS pour le dosage de neuf alcaloïdes pyrrolizidiniques dans des thés et infusions. Ces molécules hépatotoxiques ainsi que de nombreux isomères sont très largement présents dans la nature. Dans une majorité des 70 échantillons analysés, des alcaloïdes pyrrolizidiniques ont
été détectés.
Le Chapitre 4 est consacré à une méthode spécifique pour la quantification de l’anisatine dans des anis étoilés. Cette méthode a été développée à la suite de l’intoxication d’un nourrisson survenue en Suisse après la prise de boissons à base de badiane.
Dans le Chapitre 5 sont détaillées différentes techniques analytiques (GC×GC-TOF HSMS ; UPLC-TOF HRMS) ayant permis l’identification formelle de caféine dans les fleurs de tilleul.
Après une caractérisation via ces méthodes orthogonales, les concentrations de caféine ont été mesurées dans des infusions de tilleul à l’aide d’une méthode UHPLC-MS/MS.
Le Chapitre 6 comprend une méthode HPTLC-densitomètrie-UV développée et validée pour déceler et doser la sibutramine dans des compléments alimentaires adultérés. Une cinquantaine de compléments alimentaires et deux boissons instantanées ont été analysés lors de deux campagnes d’analyses. Une majorité des échantillons annoncés comme
« naturels » était adultérés par de la sibutramine.
Enfin le Chapitre 7 conclut sur ce travail de thèse et offre quelques propositions de perceptives pour le futur des analyses des compléments alimentaires.
Chapitre 1. I
NTRODUCTION1.1 Les compléments alimentaires 1.1.1 Les règlementations et définitions
Comme décrit dans l’article 2 de l’ordonnance 817.022.104 du Département Fédéral de l’Intérieur (DFI) sur les aliments spéciaux, les compléments alimentaires (CA) sont définis comme « des produits qui contiennent des vitamines, des sels minéraux ou des substances particulières sous forme concentrée et ayant un effet nutritionnel ou physiologique, et qui sont destinés à compléter l'alimentation avec ces substances » [DFI 2005b].
Ces dernières années, l’essor de suppléments nutritionnels a nécessité la mise en place de règlements nationaux et internationaux. La première directive européenne sur les CA (directive 2002/46/CE) date de 2002 [Parlement européen et Conseil de l'Union européenne 2002], et depuis, a été modifiée et complétée par plusieurs règlements afin de préciser la composition de ces produits.
Les CA sont considérés comme des denrées alimentaires spéciales et sont soumis en Suisse à la loi 817.0 (LDAI) et à l’ordonnance relative 817.02 (ODAIOUs) sur les denrées alimentaires et les objets usuels [Assemblée Fédérale de la Confédération suisse 1992, Conseil Fédéral Suisse 2005]. Les « denrées alimentaires sont des produits nutritifs, qui sont destinés à la constitution et à l’entretien de l’organisme humain et ne sont pas prônés comme médicaments » (article 3, LDAI).
La définition des CA, valable en Suisse, est équivalente à la définition européenne décrite dans la directive de 2002 [Parlement européen et Conseil de l'Union européenne 2002] et à la définition de la U.S. Food and Drug Administration (FDA) [Congress of the United States of America 1994].
Ces trois règlementations autorisent diverses formes galéniques, telles que des liquides, des poudres, des comprimés ou des capsules [Congress of the United States of America 2010].
1.1.1.1 Composition
Les vitamines et minéraux sont autorisés dans des quantités proportionnelles à la consommation journalière recommandée, et sont toutes décrites dans l’ordonnance sur les aliments spéciaux 817.022.104 [DFI 2005b].
En plus de ces composants, des additifs (édulcorants, aromes, colorants,…) peuvent être présents selon l’ordonnance 817.022.31 sur les additifs admis dans les denrées alimentaires [DFI 2013] et également un certain nombre de substances et préparations végétales.
Ces dernières années, les législations européennes et suisses se sont renforcées au niveau des allégations autorisées, sur les qualités des produits et sur les composants autorisés, dont les végétaux [Parlement européen et Conseil de l'Union européenne 2006].
L’autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA, European Food Safety Authority) est actuellement en train de mettre en place un compendium de plantes autorisées, en se basant sur les listes de plantes autorisées dans chaque pays membre [European Food Safety Authority 2009]. En Suisse, une liste de plus de 300 végétaux, faisant office de recommandation, a été établie conjointement par l’Office fédéral de la sécurité alimentaire et des affaires vétérinaires (OSAV) et l’institut suisse des produits thérapeutiques Swissmédic [Federal Office of Public Health of Switzerland 2014]. Dans ce répertoire, les végétaux sont classés en deux catégories principales, à savoir les plantes admises dans les denrées alimentaires et les plantes non admises dans les denrées alimentaires mais pouvant entrer dans la composition de produits thérapeutiques après autorisations de mise sur le marché par Swissmédic.
1.1.1.2 Allégations
Les effets des CA proclamés via diverses allégations sur les emballages des produits ou dans des publicités sont également soumis à une ordonnance (817.022.21) [DFI 2005a] et doivent
Cette liste de végétaux a servi de base au développement de la méthode de recherche de biomarqueurs dans les CA décrite au Chapitre 2, page 91.
être fondés scientifiquement, et ne peuvent en aucun cas induire le consommateur en erreur. Les allégations sont des messages ou représentations qui affirment, suggèrent ou impliquent qu’une denrée alimentaire possède des propriétés bénéfiques particulières. Deux catégories d’allégations sont autorisées pour les CA, à savoir les allégations nutritionnelles ou de santé et sont respectivement en annexes 7 et 8 de l’ordonnance 817.022.21.
Toutefois, d’autres allégations peuvent être indiquées sous réserve d’acceptation de dérogation préalablement demandée à l’OSAV.
1.1.2 Les phytopréparations et autres suppléments nutritionnels
En parallèle au marché des CA, il existe un très grand nombre de produits utilisés pour soulager certains maux ou aider à rester en bonne santé. Parmi les plus consommés, on peut citer les aliments enrichis en vitamines et/ou minéraux comme certains jus de fruits ou céréales. Ensuite les aliments fonctionnels (fonctional food) également appelés
« nutriceuticals », « foodceuticals », « designerfoods » ou encore alicaments, mot-valise composé des mots aliment et médicament, qui sont des aliments ayant en plus des propriétés nutritives et des avantages au niveau du bien-être du consommateur. Par exemple, les effets des proanthocyanidines contenus dans la canneberge (Vaccinium macrocarpon Aiton), fraiche ou en jus, sont reconnus par l’agence nationale de sécurité de l’alimentation, de l’environnement et du travail (ANSES) comme limitant l’adhésion d’Escherichia coli T. Escherich aux cellules épithéliales urinaires [ANSES 2011].
Ces dernières années de nouveaux fruits, souvent exotiques, ont fait leur apparition sur le marché européen avec diverses propriétés et en particulier des effets « anti-âge ». Les plus en vogue sont les baies de Goji (Lycium barbarum L. ou L. chinense Miller) issues de la médecine traditionnelle chinoise, connues comme contenant de nombreux antioxydants et riches en vitamine C (42 mg/100 g) [Potterat 2010] ou les fruits d’açai (Euterpe oleracea Mart.) qui sont vendus pour leurs vertus amaigrissantes ou pour ralentir le vieillissement. A côté de ces nouveaux alicaments, de nombreuses plantes issues de la médecine traditionnelle sont couramment utilisées comme la fleur de tilleul (Tilia europea L.) connue pour ses effets sédatifs légers [Laffitte 1999]. En plus des plantes, de nombreux produits dérivés de la ruche, (comme le miel, le pollen ou encore la gelée royale) sont commercialisés avec diverses vertus.
Tous ces produits, ainsi que les boissons permettant un apport supplémentaire de nutriments ou vitamines sont disponibles dans les supermarchés, parapharmacies, pharmacies, ainsi que via l’Internet au travers duquel une partie importante des ventes est réalisée. Ces produits sont des denrées alimentaires dont la mise sur le marché ne nécessite pas d’autorisation. Ils ne sont donc pas soumis à des processus de contrôle stricts, comme le sont les médicaments ou les produits à base de principes actifs végétaux.
1.1.3 Le marché des compléments alimentaires
Après une très forte croissance du marché des CA entre 2000 et 2008 (environ 20% par an), les ventes des CA ont stagné en 2008 et connu un recul de 6% en 2009, à la suite des restrictions sur les allégations en Europe. Depuis, les ventes sont à nouveau en augmentation chaque année avec environ 2% de croissance prévue pour les années 2014 et 2015 [XERFI 2014].
1.1.3.1 Consommation mondiale
Le marché mondial des CA représentait environ 4% du chiffre d’affaires de l’industrie de la santé [Lyonbiopole 2011] avec en 2013, plus de 68 milliards de dollars [ReportLinker 2014].
Figure 1-1. Augmentation des prix de vente (RSP retail selling prices) entre 2009 et 2010 des compléments alimentaires et des vitamines (VSD vitamins and dietary supplements) [Euromonitor international 2014].
Plus de 56% de la population américaine consomme des compléments alimentaires [Marques-Vidal et al. 2007], ce qui fait des habitants des Etats-Unis les plus grands consommateurs au monde, avec environ 1/3 du marché mondial (20 milliards). Le second pays consommateur de CA est le Japon avec environ 15 milliards de dollars, puis la Chine arrive en troisième position avec 12% du marché mondial. Le marché européen représente environ 14% du marché mondial, et connait une croissance plus faible que dans les autres parties du globe, sans doute en raison d’une législation plus stricte.
1.1.3.2 Consommation européenne
Entre 15 et 20% des Européens consomment des CA [van der Horst & Siegrist 2011], ce qui a généré en 2006 un marché d’environ 18 milliards d’euros. Les consommations et les augmentations des ventes sont très variables d’un pays à l’autre. Entre 1997 et 2005, le marché des CA contenant d’autres substances que des vitamines et minéraux (43% du marché) a connu une croissance comprise entre 20% au Royaume-Uni et jusqu’à 219% en Pologne [Commission of the European communities 2008].
En 2008, les Norvégiens dépensaient en moyenne 87 € par an et par habitant en CA, suivis des Italiens avec en moyenne 26 €, 19 € pour les Allemands, 14 € pour les Français et 6 € pour les Espagnols [Synadiet 2014]. Les marchés italien et allemand représentent chacun 1/5 du marché européen, 12% des ventes sont liés au marché français et la Suisse représente quelques 2% du chiffre européen.
1.1.3.3 Consommation suisse
En 2006, une étude menée sur plus de 6100 habitants de Lausanne a montré que plus d’un quart (25.7%) d’entre eux consommaient des CA [Marques-Vidal et al. 2007]. La consommation augmente avec le niveau d’éducation et l’âge des sujets, en particulier chez les femmes, avec une importante augmentation des produits riches en calcium.
L’institut des décisions environnementales de l’ETH Zurich a mené une étude en 2010 pour connaitre les habitudes et a priori de Suisses vis-à-vis des CA. Plus de 6000 personnes ont répondu par e-mail à un questionnaire parmi lesquelles, 42% ont déclaré consommer des CA et plus de 1100 personnes (18%) en consommer plusieurs fois par semaine [van der Horst & Siegrist 2011]. Les personnes interrogées utilisent les compléments alimentaires
dans le but de promouvoir leur bien-être et leur santé. Dans ce panel, une plus grande proportion de consommateurs de CA a une alimentation « saine » et consomme moins de boissons sucrées par rapport aux personnes consommant peu ou pas de CA.
En 2011, 147 individus consommant des CA ont été interrogés à la sortie de divers points de ventes à Lausanne (supermarchés, pharmacies, salles de sport) [Troxler et al.
2013]. Parmi ces personnes, 49% utilisaient un produit « tout-en-un » (mélange de minéraux et vitamines), 2% en utilisaient plusieurs en même temps. La composition des CA, en particulier « tout-en-un », était souvent ignorée des consommateurs. Les dépenses par mois et par habitant étaient comprises entre 2 et 200 CHF avec une moyenne 37 CHF ± 30 CHF.
Dans ces trois études, ce sont les femmes qui consommaient le plus de CA.
1.1.3.4 Consommation française
En 2013, le marché de l’automédication en officine représentait environ 3.4 milliards d’euros avec plus de 600 millions d’euros pour le seul marché des CA [AFIPA 2014]. Les vitamines et minéraux représentent, en 2013, 24% des parts de marché en officine. Les CA ciblant les voies digestives, la peau ou les tranquillisants, ou encore les compléments minceur représentent chacun environ 10% du marché.
Environ la moitié des ventes de CA est réalisée en officine. Les ventes directes ou par l’Internet s’élèvent à environ 1/5 des ventes, 17% des ventes sont faites dans des magasins spécialisés, 7% dans des supermarchés et enfin les ventes en parapharmacies représentent 6% du marché français [Synadiet 2014], Figure 1-2.
Figure 1-2. Les circuits de distribution des CA en France en 2013 [Synadiet 2014]. M€: millions d’euros; GMS : grandes et moyennes surfaces ; VD : vente directe ; VCP : vente par correspondance.
En 2013, toutes voies de distribution confondues, le marché des CA pesait plus d’un milliard d’euros avec une augmentation moyenne de 3.5% (par rapport à 2012), comprise entre -0.5 et 4.9% suivant les circuits de distribution [Synadiet 2014]. Les allégations minceur représentent près d’un quart des ventes de produits (23%), suivi par les produits augmentant la vitalité et le tonus (16%). Quant aux compléments alimentaires pour réguler le sommeil et/ou le stress, ils représentent 9% du marché français. Les répartitions des ventes en fonction des allégations varient passablement d’un circuit de distribution à un autre (Figure 1-3).
Pharmacies 649 M€
48%
Para- pharmacies
88 M€
6%
VD, VPC, e-commerce
290 M€
21%
Magasins spécialisés
234 M€
17%
GMS 92 M€
7%
Figure 1-3. Répartition des catégories de CA par circuit de distribution. GMS : grandes et moyennes surfaces. [Synadiet 2014]. Détails des chiffres dans l’Annexe I.
1.1.4 Les risques liés aux compléments alimentaires et phytopréparations
Plusieurs problèmes peuvent être associés à l’utilisation de CA et phytopréparations.
L’automédication mais également des informations erronées ou des compositions différentes de celles annoncées peuvent avoir des conséquences dramatiques sur la santé des consommateurs.
1.1.4.1 Automédication
L’utilisation de CA, d’alicaments ou de phytopréparations se fait le plus souvent par automédication. Seuls 21% des consommateurs ont utilisé des CA sur le conseil d’un professionnel de santé [Troxler et al. 2013]. Une partie des utilisateurs se renseigne auprès de leur entourage ou de l’Internet et plus de la moitié des personnes interrogées n’informe pas leur médecin de leur prise de CA. La composition des préparations, en particulier celles
« tout-en-un » est souvent ignorée des consommateurs et 21% d’entre eux ne connaissaient pas les propriétés de leurs CA [Troxler et al. 2013]. Pour les ¾ des consommateurs lausannois, les compléments alimentaires ne présentent pas de risque pour la santé [Troxler et al. 2013].
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100% Digestion
Circulation
Senior / ménopause Solaire
Autres
Opthalmologie Beauté
Defenses immunitaires Sommeil / Stress Bien être Tonus / vitalité Minceur / drainage
L’automédication, le manque de connaissances sur les produits consommés et la non-information du praticien peuvent avoir des conséquences négatives sur la santé, comme des interactions médicamenteuses, des effets secondaires ou des surdosages de vitamines ou de minéraux.
Un apport excessif en vitamines entraîne des hypervitaminoses également appelées survitaminoses. Des hypervitaminoses A sont décrites dans la littérature liées à une consommation de CA. Ainsi un enfant de six ans a été hospitalisé pour une hypercalcémie, des maux de ventre, des vomissements [Vyas & White 2011]. L’enfant était soumis à divers régimes dont une consommation de vitamine A de 30 000 IU par jour, dose 10 fois supérieure aux recommandations journalières conseillées pour un enfant (3 000 IU).
Ramanathan et al. rapportent le cas d’un patient souffrant de prurit et d’ictère à cause d’un apport en vitamine A légèrement supérieur à la dose journalière recommandée (5082 IU au lieu de 5000 IU) uniquement avec les boissons et compléments alimentaires ingérés et ceci depuis des années [Ramanathan et al. 2010].
Une consommation excessive de vitamine C et de fer peut provoquer une concentration trop importante en fer dans le sang ce qui génère une fatigue importante, comme rapporté pour une femme consommant trop de vitamine C [Mallory et al. 2003].
La prise de CA à base de plantes peut entrainer de nombreuses interactions médicamenteuses comme c’est le cas avec le millepertuis. Il est connu que le millepertuis, utilisé pour le traitement des états dépressifs [Laffitte 1999], peut interagir avec plusieurs classes de molécules dont les antirétroviraux [Bruneton 2005], [Bunchorntavakul & Reddy 2013]. En plus de cette interaction, Bunchorntavakul et Reddy décrivent plus d’une dizaine de plantes ou composés pouvant interagir avec différentes classes de composés, comme l’aspirine et la warfarine ou les médicaments inhibiteurs des protéases [Bunchorntavakul &
Reddy 2013].
En plus de l’automédication et de la surconsommation dangereuse, des hypervitaminoses peuvent être liées à une concentration différente de celle annoncée sur l’emballage.
1.1.4.2 Informations annoncées erronées
Un excès de vitamine D provoque une hypercalcémie, des insuffisances rénales et divers
troubles comme fatigue, irritabilité, douleur, vertiges, …. De nombreux cas d’intoxications à la vitamine D dus à des CA achetés en officine, à travers le monde (Espagne, Etats-Unis, Italie, Pays-Bas, Turquie), ont été récemment reportés dans la littérature [Kaptein et al.
2010, Araki et al. 2011, Anik et al. 2013, Benemei et al. 2013, Kara et al. 2014]. Tous ces articles relatent des concentrations mesurées en vitamine D entre 100 et 1000 fois plus élevées que celles annoncées.
Les concentrations annoncées ainsi que la composition peuvent être fausses. Des plantes ou ingrédients peuvent être absents. Le risque pour le consommateur est moindre mais il est trompé.
Des plantes peuvent être ajoutées à la suite d’une confusion avec une autre plante, ou substituée par une plante moins onéreuse. Ce qui peut avoir des conséquences plus graves, en particulier, si la plante ajoutée par erreur est toxique.
Les noms des végétaux présents dans une phytopréparation peuvent induire en erreur le consommateur ou être faux, comme ce fut le cas pour un CA où les noms, latin et vernaculaire n’indiquaient pas la même plante. Dans ce dernier cas, Pimpinella anisum L., communément appelé anis vert, était associé à l’anis étoilé (Illicium verum Hook f.) [Mathon et al. 2013].
Enfin, de nombreux compléments alimentaires, en particulier ceux vendus via l’Internet, sont adultérés avec des molécules synthétiques pharmacologiquement actives dans le but d’augmenter leurs efficacités.
Toxicité et confusion des végétaux a.
Il existe un risque pour la santé du consommateur lié aux plantes présentes dans les CA. En effet, des plantes contenant des molécules toxiques peuvent entrer dans la composition de certaines préparations [Walker 2004].
Toxicité aiguë
Bunchorntavakul et Reddy décrivent des intoxications hépatiques survenues après la consommation de CA à base de plantes. De nombreuses intoxications sont dues à la présence de métaux lourds mais beaucoup sont dues à des plantes. Les racines d’Atractylis gummifera L. contiennent des diterpenoïdes (atractyloside et carboxyatractyloside) qui quelques heures après l’ingestion provoquent des maux de tête, des vomissements, des
douleurs abdominales, des diarrhées et des convulsions [Bunchorntavakul & Reddy 2013].
Ces molécules également présentes dans Callilepis laureola DC. peuvent entrainer des lésions aux reins et au foie, provoquant le décès après cinq jours dans plus de 90% des cas sévères.
Le créosotier, Larrea tridenta (Sessé & Moc. Ex DC.) Coville, dont la molécule active est l’acide nordihydroguiarétique entraîne également des problèmes hépatiques, tout comme Ephedra sinica Stapf connu pour ses vertus décongestionnantes et aidant à perdre du poids [Bunchorntavakul & Reddy 2013].
La yohimbe (Pausinystalia yohimba Pierre ex Beille) qui contient des alcaloïdes dont la yohimbine, est une plante utilisée comme aphrodisiaque, hallucinogène et également amaigrissant. A forte concentration (> 5000 ng par mL de sang) la yohimbine est toxique pour l’homme et peut entraîner la mort, comme ce fut le cas pour deux hommes aux Etats- Unis ayant consommés des CA à base de yohimbe [Anderson et al. 2013].
Toxicité chronique
D’autres plantes, comme la consoude (Symphytum officinale L.) ou le tussilage (Tussilago farfara L.) contiennent d’autres composés toxiques : les alcaloïdes pyrrolizidiniques. Une partie de cette classe de composés est connue pour être hépatotoxique, mutagène et carcinogène pour l’homme tout comme pour un certain nombre d’animaux de rente [Fu et al. 2004, BfR 2013]. Ces plantes étaient utilisées en infusion en médecine traditionnelle suisse. La fleur de tussilage, farfarae flos, faisait encore partie de la Pharmacopée Helvétique VI [Schweiz. Eidgenössische Pharmakopöekommission 1971]. Aujourd’hui de faibles quantités d’alcaloïdes pyrrolizidiniques (PAs pyrrolizidine alkaloids) sont mesurées dans diverses denrées alimentaires comme les miels [Beales et al. 2004, Betteridge et al. 2005, Kempf et al. 2008, Kempf et al. 2011, Cramer & Beuerle 2012, Griffin et al. 2013, Orantes- Bermejo et al. 2013], les pollens [Kempf et al. 2010a, Kempf et al. 2010b, Dubecke et al.
2011] ou encore dans des plantes pour infusions [Mroczek et al. 2004, Oberlies et al. 2004, Pour détecter le plus possible de molécules toxiques ou indésirables pouvant
être présentes dans des compléments alimentaires ou phytopréparations, une méthode analytique a été mise au point. Chapitre 2, page 91.
Altamirano et al. 2005, Zhang et al. 2007, Griffin et al. 2014].
D’autres alcaloïdes, dont la berbérine, la chélérythrine ou encore la chélidonine, sont présents dans la chélidoine (Chelidonium majus L.). Cette herbe vivace est administrée pour lutter contre les troubles des voies biliaires et les syndromes du côlon irritable mais peut entraîner des problèmes hépatiques dans les mois qui suivent sa consommation [Bunchorntavakul & Reddy 2013].
Plusieurs rapports de lésions hépatiques survenues plusieurs semaines après la consommation de germandrée, Teucrium chamaedrys L. ont été rapportés. Les fleurs de cette plante sont utilisées contre l’hypertension, la goutte, le diabète ou encore l’obésité [Bunchorntavakul & Reddy 2013].
Confusion
Des plantes toxiques peuvent être présentes dans des denrées alimentaires suite à des confusions entre différents genres ou espèces. La dangerosité de cette contamination est proportionnelle à la toxicité de la plante ajoutée par erreur et à sa concentration dans le produit final. La contamination peut avoir des conséquences dramatiques pour le consommateur, comme ce fut le cas à la suite de confusions entre deux espèces d’anis étoilés [Ize-Ludlow et al. 2004b, Perret et al. 2011].
L’anis étoilé japonais, Illicium anisatum L., est toxique pour l’homme car il contient une quantité importante de neurotoxines dont l’anisatine [Lane et al. 1952]. Cette molécule est également présente dans l’anis étoilé chinois, I. verum Hook f., mais les concentrations sont environ mille fois plus faibles [Lederer et al. 2006]. Les différentes espèces d’Illicium sont morphologiquement difficilement reconnaissables, de plus une caractérisation macroscopique n’est possible que sur des fruits d’anis entiers. Or ils peuvent être commercialisés sous forme pulvérisée.
Une étude portant sur la quantification de neuf PAs dans 70 thés et infusions est présentée, avec les détails analytiques sur la mise au point et la validation de la méthode dans le Chapitre 3, page 117.
Emballage et allégations b.
Aujourd’hui il existe une très grande diversité de CA, tant par le prix, la formulation galénique mais également par les allégations annoncées. En effet, ils sont vendus avec des vertus très variées : de la préparation au bronzage, à l’augmentation des capacités de mémoire ou encore pour lutter contre le stress et les problèmes de sommeil ou pour faciliter la perte de poids. Un certain nombre de paramètres, comme les ingrédients, doivent être indiqués sur les emballages des CA [Parlement européen et Conseil de l'Union européenne 2011]. Seules les allégations de santé vérifiées par une étude scientifique peuvent être décrites sur l’emballage d’un produit. Lors de campagnes d’analyse de composition de CA, une grande partie des emballages n’était pas conforme, soit par un manque d’information soit par des allégations non-conformes à la législation en vigueur.
Cet aspect d’étiquetage ne sera pas traité dans ce manuscrit puisque ces non- conformités sont décelables en étudiant l’étiquetage et ne nécessitent pas de méthodes analytiques.
Adultération c.
Lors de ce travail de thèse, un intérêt particulier a été porté aux produits annoncés comme amaigrissants car ces derniers sont les plus consommés et présentent régulièrement des problèmes de santé publique. Ces compléments ayant des vertus amaigrissantes, tout comme les compléments indiqués dans les troubles de l’érection sont en grande partie vendus via l’Internet. Ce mode d’achat est le moins sûr de tous, et le plus difficile à contrôler. Tous les jours, de nouveaux sites internet fleurissent et proposent tous une multitude de CA aux vertus miraculeuses. Dans le but d’augmenter l’efficacité des CA annoncés comme 100% naturels, les fabricants adultèrent fréquemment ces produits
« naturels » avec diverses molécules. Ces fraudes peuvent s’avérer très dangereuses, puisque la molécule active non déclarée peut interagir avec un traitement suivi par le consommateur. De plus, de nombreux compléments amaigrissants vendus sur l’Internet
Pour différencier les espèces d’Illicium et assurer la non-toxicité de denrées à base d’anis étoilé, une méthode analytique a été développée pour quantifier l’anisatine. Cette méthode et les résultats mesurés dans plusieurs échantillons sont présentés dans le Chapitre 4, page 145.
contiennent de la sibutramine, molécule retirée des marchés européen et américain car les risques d’accidents cardio-vasculaires étaient supérieurs au bénéfice en terme de perte de poids [European Medicines Agency 2010, Food and Drug Administration 2010].
Dans le but de sécuriser le marché des CA à base de plantes, des méthodes analytiques ont été développées. Les techniques mises en jeu dans ces méthodes, ainsi que les techniques les plus couramment utilisées pour les analyses de denrées alimentaires sont détaillées dans la partie suivante.
1.2 Approches analytiques
L’analyse chimique est une série de processus dont le but est d’identifier et/ou de doser une substance spécifique ou les constituants d’une solution ou d’un mélange ou encore de déterminer la structure de composés (Figure 1-4). Dans la littérature, il existe de nombreuses méthodes analytiques pour détecter soit des composés spécifiques soit des classes de composés présents dans des plantes ou dans des denrées alimentaires. Ces méthodes utilisent diverses techniques de préparation d’échantillon, de séparation pour les matrices et également diverses techniques de détection. Le choix de chaque étape sera déterminé en fonction du résultat attendu, qualitatif ou quantitatif, de la matrice analysée, des propriétés physico-chimiques des composés recherchés et en fonction du domaine de concentration à étudier. Le temps d’analyse, la fiabilité des techniques ou encore le coût d’analyse sont autant de facteurs importants pour le choix d’un processus d’analyse.
Des compléments amaigrissants achetés sur l’Internet et annoncés comme 100% naturels ont été analysés afin de rechercher et doser la sibutramine contenue dans ces échantillons. Pour ce faire, une méthode a été développée et validée. Chapitre 6, page 185.
Figure 1-4. Représentation schématique d’un processus d’analyse avec les étapes les plus généralement utilisées. Des étapes supplémentaires peuvent être nécessaires, comme une précipitation de protéines ou une dérivation pour certaines analyses en chromatographie gazeuse. A contrario certaines étapes schématisées ci-dessus peuvent être inutiles. Le choix de chaque étape d’un protocole d’analyse dépend de l’analyte, de la matrice et également du résultat attendu (qualitatif, quantitatif et rapidité de réponse).
1.2.1 Echantillonnage
La première étape d’un processus d’analyse est le choix de l’échantillon qui doit être représentatif de l’ensemble du lot. Le prélèvement utilisé pour l’analyse doit être une réplique miniature de l’échantillon. Des variations de teneurs peuvent être observées entre les échantillons ou à l’intérieur d’un échantillon en particulier pour les échantillons solides.
Les erreurs d’échantillonnage sont inversement proportionnelles aux quantités prélevées.
