Préparation d’échantillons

Équation 1-1. Ecart-type global

Pour limiter la dispersion des mesures pour un échantillon, il est important d’avoir une méthode analytique juste et reproductible mais avant tout d’avoir un prélèvement d’échantillon représentatif du contenu total, sans erreur systématique si tout le contenu ne peut être analysé.

1.2.2 Préparation d’échantillons

Un échantillon est constitué d’une matrice et des composés cibles, appelés analytes. La préparation d’échantillons est liée au niveau de concentration des analytes et à la matrice dans laquelle se trouvent les composés. Cette étape clé, dans le processus d’analyse, doit être reproductible et ce, particulièrement pour les matrices solides qui nécessitent une série d’étapes préparatoires dont l’homogénéisation de l’échantillon. Les matrices biologiques sont des ensembles complexes qui contiennent un grand nombre de composés ayant des

propriétés physico-chimiques très diverses. Les molécules présentes dans la matrice peuvent interférer avec les composés cibles et ainsi biaiser les résultats obtenus ou les rendre non-reproductibles. Pour limiter ces problèmes, appelés effet matrice, les échantillons sont préparés afin d’obtenir sélectivement les composés cibles.

La sélectivité de la préparation d’échantillon peut être faite au niveau de l’extraction des composés ou dans une étape ultérieure de purification ou de filtration. Un prétraitement de l’échantillon peut également être utilisé pour concentrer les analytes, stabiliser un échantillon ou pour un changement de phase.

La préparation des extraits doit être compatible avec les techniques de séparation et de détection choisies.

Les procédures de préparation d’échantillons les plus couramment utilisées pour l’analyse de denrées alimentaires seront résumées dans cette section.

1.2.2.1 Extraction

L’ajout d’un solvant à un solide ou un autre liquide non-miscible permet d’extraire un ou des composés cibles. Ce processus est très largement utilisé en chimie analytique et différentes technicités peuvent être employées.

Extraction solide-liquide a.

La plus simple est la solubilisation d’un solide en présence d’un liquide. Le système solide-liquide peut être agité, chauffé ou encore soumis à diverses ondes (ultrasons ou microondes), pour accélérer le processus. Un appareil de type Soxhlet peut être utilisé pour avoir une extraction en continue.

Tableau 1-1. Comparaison des temps moyens d’extraction et des volumes de solvant pour une extraction à l’aide de plusieurs techniques. D’après [Dionex 2013]

Technique Temps moyen d'extraction Volume de solvant

(h) (mL)

Soxhlet 4 - 48 150 - 500

Soxhlet automatique 1 - 4 50 - 100

Ultrasons 0.5 - 1 150 - 200

Supercritique 0.5 – 2 5 - 50

Microondes 0.5 - 1 25 - 50

ASE 150/350 0.2 - 0.3 5 - 200

L’élévation de la température et/ou de la pression permet d’augmenter et d’accélérer l’extraction. Le système d’extraction accélérée par solvant (ASE) combine ces deux facteurs (température et pression) dans le but d’augmenter l’efficacité du processus d’extraction et permet d’extraire de façon automatisée des solides. Avec l’ASE, un échantillon peut être extrait à l’aide d’un solvant ou d’un mélange de solvants.

Une cellule d’extraction, contenant la matrice solide est remplie de solvant d’extraction, cette étape dure entre 20 et 60 s. Ensuite, environ 5 min sont nécessaires pour mettre la cellule sous pression (1500 psi) dans un four à la température désirée (Figure 1-5).

L’échantillon est ensuite traversé par un volume défini de solvant frais, pendant environ 5 min. Enfin, le système est purgé pendant 30 à 90 s avec de l’azote, afin de récupérer le maximum d’extrait. Environ 15 min sont nécessaires pour obtenir des extraits dépourvus de particules. Pour augmenter le rendement d’extraction, les volumes et les temps d’extraction peuvent être augmentés, ou plusieurs cycles d’extraction peuvent être réalisés successivement.

Figure 1-5. Représentation d’un ASE® [Dionex 2014].

L’ASE permet également des extractions successives dans des conditions de température, pression ou volume différents. Des solvants différents peuvent être utilisés dans le but de purifier ou d’extraire plusieurs classes de composés ayant des propriétés chimiques différentes. En effet, un premier système de solvants peut être utilisé pour purifier un extrait en éliminant des composés indésirables. Après séchage par un flux d’azote, le système peut être extrait à l’aide d’un autre système de solvants dans d’autres conditions.

Extraction sur phase solide b.

Des supports solides sont fréquemment utilisés pour extraire des composés. L’extraction sur phase solide (SPE) permet d’extraire des composés, de purifier par filtration une solution et

L’ASE a permis d’extraire la caféine des feuilles de tilleul, comme décrit dans le Chapitre 5, page 167.

L’ASE a été utilisée pour extraire l’anisatine des anis étoilés après avoir dégraissé les échantillons à l’aide de n-hexane pour éviter que les composés contenus dans cette phase n’interfèrent avec l’anisatine durant l’analyse.

Chapitre 4, page 145.

également de concentrer un échantillon. Le principe est simple : la solution à extraire est éluée sur une phase stationnaire préalablement conditionnée (Figure 1-6). Les composés d’intérêt vont être adsorbés sur la phase solide dont les propriétés chimiques sont choisies en fonction des analytes. Une étape de rinçage permet d’éliminer les composés non-adsorbés sur la phase solide. Enfin, les composés d’intérêt vont être désorbés à l’aide d’un solvant adéquat.

Figure 1-6: Schématisation du processus d’extraction sur phase solide

Des SPE dites dispersives sont très largement utilisées pour des analyses multi-composés dans les denrées alimentaires. Développés en 2003 par le département de l’agriculture des Etats-Unis, les QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) sont des kits permettant une extraction en présence de divers sels puis une purification de type SPE dispersive [Schenck & Hobbs 2004].

Extraction liquide-liquide c.

Lorsque l’échantillon est sous forme liquide ou nécessite une solubilisation, une extraction liquide-liquide (LLE liquid-liquid extraction) permet de concentrer les analytes ou d’extraire sélectivement certains composés. Les deux liquides doivent être non-miscibles ou très

fonction de leur constante de partage, K partage.

⁄ Équation 1-2. Loi de distribution de Nernst

Les LLE peuvent être également réalisées sur support solide (SLE solid-supported liquid-liquid extraction). La SLE est faite en deux étapes. La première est le dépôt de l’échantillon sur la phase solide constituée de terre de diatomée inerte. Après plusieurs minutes d’équilibre (typiquement 10 min), la colonne est éluée avec un solvant organique adéquat pour récupérer les analytes d’intérêt. Contrairement à la SPE, le volume de solution aqueuse déposé sur la phase solide ne doit pas excéder la capacité de la phase, ainsi une concentration de l’échantillon est possible mais dans de plus petites proportions par rapport à une SPE.

1.2.2.2 Filtration

La matrice liquide est éluée à travers un filtre afin de séparer les particules en suspension dans la solution. Il existe une grande variété de filtres en fonction de leur capacité, de leur taille, du diamètre des pores et de la matière du support. La taille du filtre sera choisie en fonction du volume à filtrer. Le diamètre des pores sera fonction de la taille des particules solides à retenir mais également en fonction de la technique de séparation choisie afin de préserver par exemple les colonnes de chromatographie liquide (LC). Enfin la matière du support peut interagir avec les analytes et devra être sélectionnée par rapport à la nature chimique des composés analysés.

L’ultrafiltration permet de concentrer ou d’éliminer des protéines voir des peptides par centrifugation à travers des micropores. Des pores de 0.1 µm retiennent des composés de 5000 Da ou plus. Et les plus gros diamètres de 5 µm ne laissent pas passer des protéines de plus de 300,000 Da.