Royaume du Maroc
Université Mohammed V de Rabat Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat
Centre d’Etudes Doctorales des sciences de la vie et de la santé
Année 2017 N° d’ordre : 19/15 CSVS
Thèse de doctorat
Titre
L’effet des variations génétiques du gène d’IL28B sur la réponse
au traitement de l’hépatite C chronique chez les patients
marocains
Formation doctorale : Biologie médicale, pathologie humaine et
expérimentale et environnement
présentée par
Nadia KANDOUSSI
Soutenue publiquement le 28/07/2017
Devant les membres de jury :
Pr Mimoun ZOUHDI
Pr Saâd MRANI
MD, PES, FMPR, Université Mohammed V, Rabat MD, PhD, PES, FMPR,
Université Mohammed V, Rabat
Président
Directeur de thèse
Pr Abdelkader BELMEKKI MD, PES, FMPR, Université
Mohammed V, Rabat
Examinateur
Pr Yassine SAKHSOUKH MD, PES, FMPR, Université
Mohammed V, Rabat
Rapporteur
Pr Mohammed EL AZAMI AL IDRISSI
Pr, FMPF, Université Sidi Mohamed Ben Abdellah, Fès
Rapporteur
Pr Hassan SEDDIK MD, PES, FMPR, Université
Mohammed V, Rabat
Rapporteur
Pr Bahia BENNANI Pr, FMPF, Université Sidi
Mohamed Ben Abdellah, Fès
Examinateur
Pr El Mostafa ELFAHIME Pr, CNRST, Université
Mohammed V, Rabat
II
DEDICACES
Je dédie ce travail :
A l’âme de ma très chère maman Yamna
Qui m’a quitté cette année, et avec qui, je n’ai pas eu la chance de partager la joie de voir le résultat de mon travail. Tu étais la plus douce et la plus merveilleuse des mamans, tu m’as tout donné sans compter, grâce à toi ce travail a pu avoir lieu, grâce à toi je deviens Docteur. Tout au long de mes études, tu n’as pas cessé de me soutenir et de m’encourager, tes prières pour moi, ton amour, ta générosité exemplaire et ta présence constante ont fait de moi ce que je suis aujourd’hui. A mon tour, je te dédie ce travail qui concrétise ton rêve le plus cher et qui n’est que le fruit de tes conseils et tes efforts. Aucun hommage ne saurait transmettre à sa juste valeur, l’amour, le dévouement, la gratitude et le profond respect que je porte pour toi. J’implore Dieu, le tout puissant, t’avoir en sa sainte miséricorde.
A mon très cher père Sidi Mohammed
Qui m’a aidé à découvrir le savoir, le trésor inépuisable. De tous les pères, tu as été le meilleur, tu as su m’entourer d’attention, m’inculquer les valeurs nobles, m’apprendre le sens du travail, de l’honnêteté et de responsabilité. Tu as été, et tu seras toujours un exemple à suivre pour tes qualités, ta persévérance et ton perfectionnisme. Les mots ne pourront jamais exprimer la profondeur de mon respect et mon amour éternel. Merci d’avoir été toujours là pour moi, un grand soutien tout au long de mes études.
A mes très chers frères et sœurs
Mohammed, Hicham, Ilham, Hayat, Hajar et Asmae et mes neveux, les petits Youssef et Ismail, je vous dédie ce travail témoignant mon amour et mon attachement. Puisse nos fraternels liens se pérenniser et se consolider encore. Je ne pourrai d’aucune manière exprimer ma profonde affection et mon immense gratitude pour vos sacrifices consentis, votre aide, votre générosité extrême qui ont été pour moi une source de courage, de confiance et de patience.
A mes collèges
Je vous dédie ce travail en témoignant des souvenirs passés ensemble.
III
REMERCIEMENTS
A Monsieur le Professeur Mimoun ZOUHDI, Président du jury
Merci infiniment d’avoir accepté de présider ce jury malgré votre agenda chargé. D’avoir accepté de lire, critiquer et instruire cette Thèse. Merci pour votre contribution à l’amélioration de ce document.
A Monsieur le Professeur Saâd MRANI, Directeur de la thèse
Vous m’avez fait l’honneur de diriger cette thèse. Je vous remercie Professeur d’avoir encadré ce travail. D’avoir m’accueillir au sein de votre laboratoire et m’intégrer dans votre équipe de recherche. Sans vos connaissances, vos conseils, vos critiques et votre aide, ce travail n’aurait pas été possible. Votre dynamisme et ton enthousiasme ont été moteurs pour moi. Votre perfectionnisme m’a amené à atteindre le meilleur de moi-même. Merci pour vos encouragements, votre confiance et ce que vous m’avez apporté professionnellement.
Au Docteur Saâd ELKABBAJ, Directeur du laboratoire de recherches et d’analyses médicales de la Gendarmerie Royale de Rabat
Je vous remercie pour votre aide précieuse que vous m’avez apportée tout au long de cette thèse, vos conseils et votre soutien depuis mon arrivée au laboratoire.
A Monsieur le Professeur JAMAL TOUFIK, Directeur du Centre d’Etudes Doctorales des sciences de la vie et de la santé
Merci de m’avoir accueilli au sein votre école doctorale et de m’avoir permis d’effectuer cette thèse dans de bonnes conditions. Je serais toujours admiratif de votre rigueur scientifique, de votre créativité, de votre efficacité et de votre amour pour cette école.
Mention spéciale au Pr Hicham ELANNAZ. Je tiens à vous remercier pour le temps et
l’intérêt consacré au suivi de ce travail, pour votre orientation ficelée et pour votre culture et conseils scientifiques incontestables, dont vous m’avez fait bénéficier, ainsi que vos qualités humaines qui vous valent l’admiration et le respect. Votre soutien, et votre entière disponibilité, votre gentillesse et bienveillance qui m’ont été précieux pour mener ce travail à bon port.
IV
À toute l’équipe de recherche en Virologie Moléculaire et Onco-biologie
J’ai eu un grand plaisir de travailler avec vous. Je vous remercie infiniment pour votre soutien, vos encouragements, de m’avoir guidé au cours des différentes manipulations de biologie moléculaire et m’aider à la rédaction des articles.
À toute l’équipe du Laboratoire de biologie moléculaire du CNRST de Rabat
Je tiens à remercier le Professeur El Mostapha ELFAHIM et tout le personnel de la plateforme de biologie moléculaire du CNRST pour leur collaboration, assistance technique, et également pour leurs orientations et renseignements scientifiques et techniques.
Aux Professeurs membres de jury
Je vous remercie très sincèrement pour l’honneur que vous m’avez fait en participant au jury de ma thèse, d’avoir accepté de m’apporter votre expertise pour l’évaluation et l’amélioration de ce travail.
Merci également à tous mes amis qui m’ont aidé et conseillé
Enfin, je voudrais rendre hommage à toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail.
V
RESUME
La réponse au traitement de l'hépatite C dépend de divers facteurs. En outre, les facteurs génétiques de l'hôte impactent cette réponse. Plusieurs études génomiques ont révélé que les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) à proximité du gène de l’interleukine 28B (IL28B), prédisent la clairance spontanée de l'infection par le VHC ainsi que la réponse virologique soutenue (SVR) après une thérapie par le PEG-IFN / Ribavirine (RBV). Deux SNP rs12979860 et rs8099917, sont particulièrement prédictifs d'une réponse favorable au traitement chez les patients infectés par le génotype 1 du VHC.
Au Maroc, peu de données sont rapportées à ce sujet. L’objectif de travail a été d’étudier la fréquence des génotypes des deux polymorphismes rs12979860 et rs8099917, chez une population marocaine, et l’impact des différents génotypes sur la réponse au traitement standard du VHC.
Au total, 187 personnes infectées par le VHC ayant reçu le PEG-IFN / RBV ont été recrutées dans ce travail. L'étude a été approuvée par le comité d’éthique de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, tous les patients ont donné leur consentement écrit. Une fiche d'information est complétée pour chaque patient avec des données anthropométriques, cliniques, biologiques et thérapeutiques.
Le premier SNP rs12979860 a été identifié par une PCR en temps réel, basée sur l'analyse des courbes de fusion à haute résolution (High Technical Resolution Melting). Le deuxième SNP rs8099917 a été analysé par séquençage génomique.
Parmi les 187 patients, la SVR a été obtenue chez 55% des patients ; 168 échantillons ont été testés avec succès pour le polymorphisme rs12979860. La fréquence des génotypes était de 25% pour le génotype CC, 41% pour le génotype CT et 34% pour le génotype TT. La SVR a été obtenue chez 76% des patients ayant le génotype CC. Les génotypes du SNP rs8099917 ont été déterminés chez 173 patients. La distribution des fréquences des trois génotypes était 67 % TT, 32 % TG et 1 % pour le génotype GG. Le taux de SVR était de 65% pour le génotype TT et de 36% pour le génotype TG, alors que deux patients ayant le génotype GG n'avaient pas atteint de SVR. Conclusion : Ce constat ajoute des preuves que ces SNP peuvent être exploré comme un outil pour améliorer la prédiction de la réponse virologique et la surveillance thérapeutique chez les patients atteints d'hépatite C chronique, en mesure d'estimer le potentiel de succès du traitement.
Mots clés : Virus du HCV ; Hépatite C chronique ; Traitement du HCV ; Réponse au
VI
ABSTRACT
The response to treatment of hepatitis C depends on multiple factors. In addition, several genetic factors of the host impact this response. Several genome-wide association studies have revealed that single nucleotide polymorphisms (SNPs), in close proximity to gene of IL28B, predict spontaneous clearance of VHC infection, as well as sustained virologic response (SVR) following peg-IFN/ribavirin therapy among patients infected with VHC. Two SNPs
rs12979860 and rs8099917, are reportedly highly predictive of a favorable treatment
response, among VHC genotype 1 infected patients. It is in this context that we conducted this work. Our objective was to study the frequency of the genotypes of the two polymorphisms,
rs12979860 and rs8099917, in a Moroccan population and their impact on the response to the
standard treatment of VHC.
A total of 187 VHC-positive people who received PEG-IFN/RBV were recruited into the study. The study was approved by the ethics committee of Faculty of Medicine & Pharmacy of Rabat and all the patients gave their written informed consent. An information sheet is completed for each patient with anthropometric, clinical, biological and therapeutic data.
The first SNP rs12979860 was identified by a real-time PCR based on the analysis of the high-resolution melting curves (High Technical Resolution Melting). The second SNP
rs8099917 was analyzed by sequencing.
In the first study, among the 187 patients, SVR was achieved in 55% patients, 168 were successfully genotyped and tested for rs12979860 IL28 polymorphism. The frequency of genotypes was 25% CC, 41% CT and 34% TT, demonstrating a C allele frequency of 46%. The SVR was observed in 76% of patients with the CC genotype. The genotypes of the
rs8099917 SNP were determined in 173 patients. The genotype frequency was 67% for the
TT genotype, 32% for the TG genotype and 1% for the GG genotype. The SVR rate was 65% for the TT genotype and 36% for the TG genotype, whereas two patients with a GG genotype in this study had not achieved SVR. Conclusion: This finding adds evidence that these SNPs can be explored as a tool to improve virologic response prediction and therapeutic surveillance in patients with chronic hepatitis C, able to estimate the potential for successful treatment.
Key words: Chronic hepatitis C; HCV virus; HCV treatment; Gene polymorphism; IL28B;
VII
صخلم
ت يئابولا دبكلا باهتلا جلاعل ةباجتسلاا دمتع C بكلا باهتلا سوريفل ينيجلا طمنلا لثم ةفلتخم لماوع ىلع د ( VHC ) ، لمحلا تايوتسمو ،يسوريفلا ةدمو ةعرجلا ،جلاعلا ةلتك رشؤمو ،مسجلا رمو سنجلاو نيلوسنلأا ةمواقمو رمعلا فيلتلا ةلح ىلإ ةفاضلإاب .ىرخلأا تاسوريفلا عم صيخشتلاو ،كلذ لل ةيثارولا لماوعلا نم ديدعلا رثؤت ضيرم لاا هذه ىلع ةباجتس . نأ ةيمونيجلا تاساردلا نم ديدعلا تفشك دقو لاكشأ ددعت اديتويلكوينلا ت ( ةيدرفلا SNPs نيج نم برقلاب ، ) نيكولريتنلاا 28 ب Interleukine:IL28B) ) ي ، رت ٲ س لختلا ص ىودع نم يئاقلتلا دبكلا باهتلا VHC كلذكو لاا تس ةباج لا ةيسوريف لا ( ةرمتسم SVR جلاعلا دعب ) ب Ribavirine (RBV) و PEG-IFN نم نينثا . SNPs rs12979860 و rs8099917 ، يف ا ةمدقم نيجل IL28B ، صاخ لكشب ئبنت لا منلا نم نوناعي نيذلا ىضرملا جلاعل ةيتاوم ةباجتس ط يثارولا 1 لا دبكلا باهتل . VHC يف مل ،برغملا لاا ريرقت متي لا نم ليلقلا تايطعم نم فدهلا ناك .عوضوملا اذه لوح لمعلا ةسارد وه ا ددرت طامنلا ةيثارولا ا ددعتل ل نيلكش rs12979860 و rs8099917 ىدل ةيبرغملا ةنكاسلا ةيثارولا طامنلأا فلتخم ريثأت و، ع ىل لا يرايعملا جلاعلل ةباجتسلاا دبكلا باهتل .VHC هذه تلمش ةساردلا 187 اباصم يئابولا دبكلا باهتلا سوريفب نيذلا فنص نم جلاعلا اوقلت PEG-IFN\RBV لا يف زكرم يس نبا يعماجلا يئافشتسلاا ان برغملا طابرلاب . تمت ةيلكب تايقلاخلأا ةنجل لبق نم ةساردلا ىلع ةقفاوملا ديصلاو بطلا ةل ،طابرلاب ةيطخلا مهتقفاوم ىضرملا عيمج ىطعأ دقو . ءلم مت ضيرم لكل تامولعملا ةقرو و لمشت يتلا تانايبلا ا ،ةيرشبل ،ةيريرسلا ةيجلاعلاو ةيجولويبلا . فرعتلا مت ىلع لوأ SNP rs12979860 ةطساوب PCR ف يقيقحلا تقولا ي ، ادانتسا إ يلاعلا راهصنلاا تاينحنم ىل ةقدلا ة ( HRM ) ليلحت مت . 12979880 rs ةطساوب ليلحت .يمونيجلا لسلستلا نمض نم 187 ضيرم ، ليجست مت ةرمتسملا ةيسوريفلا ةباجتسلاا ةبسنب 55 % رابتخا مت .ىضرملا نم 168 ب ةنيع حاجن لأا ددعتل لاكش rs12979860 . ناك رتاوت لآاك ةيثارولا طامنلاا يت : 25 % ثارولا طمنلل ي CC و 41 % ارولا طمنلل يث CT و 34 % يثارولا طمنلل TT . 76 % يثارولا طمنلا يوذ نيباصملا نم CC ةرمتسم ةيسوريف ةباجتسا ىلع اولصح . ل ةيثارولا طامنلأا ديدحت مت rs8099917 ىدل 173 تلاك ثلاثلا ةيثارولا طامنلأا تاددرت عيزوت ناك .ضيرم يلا : 67 % يثارولا طمنلل TT ، 32 % يثارولا طمنلل TG ، و 1 % يثارولا طمنلل GG . سملا ةيسوريفلا ةباجتسلاا تلجس ةرمت يثارولا طمنلل TT ةبسنب 65 % طمنللو يثارولا TG ةبسنب 36 % ، نيح يف أ منلا يوذ نيباصملا نم نينثا ن يثارولا ط GG ةرمتسملا ةيسوريفلا ةباجتسلاا اورهظي مل . ةلدأ فيضت ةجيتنلا هذه ديفت ةيناكمإ تسا مادخ كلت لا SNP ةيجلاعلا ةبقارملا نيسحتل ةادأك و عقوتل ارشؤم ا ةباجتسلا ةرمتسملا ةيسوريفلا ىضرملل ب نيجلاعملا PEG-IFN \ RBV . تاملكلا :ةلادلا لا سوريف VHC ، يدبكلا يسوريفلا ءابولا C ، لا جلاع VHC ، جلاعلل ةباجتسلاا ، لأا ددعت لاكش ، IL28B ، تانيكولريتنلاا .VIII
PRODUCTIONSCIENTIFIQUE
Publications: KANDOUSSI.N; ELANNAZ.H; TAGAJDID.R; TOUIL.N et al. The effect of interleukin-28B rs12979860 polymorphism on the therapeutic response of Moroccan patients with chronic hepatitis C.Gene.2015Aug;568(1).
KANDOUSSI. N; ELANNAZ.H; MELLOUL.M, TAGAJDID.Reda et al. Genetic Variation in Interleukin 28B rs8099917 and Response to Antiviral Therapy in Moroccan patients with chronic hepatitis C. Gene Reports.2017; 8:84–87.
Kandoussi N, Abi R, Kasouati J, Tagajdid R, Elkochri S, Elmchichi B, et al. HDV Co-infection Rates in Moroccan Chronic Hepatitis B Patients.SM J Hepat Res Treat. 2017; 3(1): 1013.
Communications orales:
KANDOUSSI.N; TAGAJDID.MR; BELEFQUIH.B et al. Association study of IL28B
rs12979860 polymorphisms with response / resistance to standard treatment of Moroccans patients infected with hepatitis C virus. Premières Journées Franco-Maghrébines de Virologie. Octobre 2013.
Communications affichées :
KANDOUSSI.N; EL ANNAZ.H; TAGAJDID.MR et al. La variabilité génétique du Virus de l’Hépatite C au Maroc. Premières Journées Franco-Maghrébines de Virologie. Octobre 2013. KANDOUSSI.N; TAGAJDID.MR ; BELEFQUIH.B et al. Association study of IL28B
rs12979860 polymorphisms with response / resistance to standard treatment of Moroccans patients infected with hepatitis C virus. 5Th European Congress of Virology. Lyon. September
11-14, 2013.
KANDOUSSI.N; EL ANNAZ.H; ELKABBAJ.S; ZOUHDI.M ; MRANI.S. La variabilité génétique du virus de l’hépatite C au Maroc.4èmes journées scientifiques du CEDOC. Février.2013
KANDOUSSI.N; EL ANNAZ.H; ELKABBAJ.S; ZOUHDI.M ; MRANI.S. La prévalence du diabète chez les patients atteints du VHC& HBV. Les journées scientifiques du CEDOC. Janvier 2012.
KANDOUSSI.N; EL ANNAZ.H; ZOUHDI.M ; MRANI.S. La susceptibilité génétique de la résistance au traitement et la sévérité de l’hépatite B au Maroc. Les journées scientifiques du CEDOC. Janvier 2011.
IX
TABLE DES MATIERES
DEDICACES ... II REMERCIEMENTS ... III RESUME ... V ABSTRACT ... VI صخلم ... VII PRODUCTIONSCIENTIFIQUE ... VIII
TABLE DES MATIERES ... IX
LISTE DES TABLEAUX ... XIV
LISTE DES FIGURES ... XV
LISTE DES GRAPHES ... XVI
LISTE DES ABREVIATIONS ... XVII
LISTE DES ANNEXES ... XIX
INTRODUCTION GENERALE ... 1
I REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ... 3
1. Virus de l’hépatite C ... 4
1.1. Historique ... 4
1.2. Structure virale et organisation génomique ... 5
1.2.1. Structure du virus ... 5
1.2.2. Génome viral ... 6
1.2.3. Structure et Fonction des protéines virales ... 7
1.2.3.1. Protéine Core ou noyau ... 7
1.2.3.2. Protéines E1/E2 de la surface virale ... 8
1.2.3.3. Protéine p7 ... 9
1.2.3.4. Protéines non structurelles ... 9
X
1.3.1. Attachement et entrée du virus... 12
1.3.1.1. Déterminants cellulaires ... 13
1.3.2. Signaux annonçant l'entrée du VHC ... 17
1.3.3. Réplication de l’ARN ... 18
1.3.4. Traduction des protéines virales ... 20
1.3.5. Maturation des particules de VHC ... 21
1.3.6. Assemblage et libération des particules virales ... 22
1.3.7. Voie de sécrétion constitutive ... 22
1.4. Variabilité génétique ... 25
1.4.1. Variabilité inter-individus : les génotypes et sous-types du VHC ... 25
1.4.2. Variabilité intra-individus : les quasi-espèces ... 27
1.4.3. Recombinaison génétique ... 28
2. Epidémiologie ... 29
2.1. Prévalence et répartition mondiale du VHC... 29
2.2. Mode de transmission ... 31
3. Réponse immunitaire à l’infection par le VHC ... 32
3.1. Réponse immunitaire innée ... 32
3.1.1. Les cellules tueuses naturelles (cellules NK) ... 36
3.1.2. Monocytes, macrophages et cellules de Kupffer ... 37
3.2. Réponse immunitaire spécifique ... 38
3.2.1. Réponse humorale ... 38
3.2.2. Réponse cellulaire T ... 39
4. Histoire naturelle et évolution de la maladie ... 43
4.1. Signes et symptômes ... 43
4.1.1. Hépatite C aiguë ... 43
4.1.2. Hépatite C chronique ... 44
XI
4.2. Diagnostic biologique de l’infection à VHC ... 47
4.2.1. Diagnostic sérologique ... 47
4.2.1.1. Recherche des anticorps anti-VHC ... 47
4.2.2. Diagnostic moléculaire ... 48
4.2.2.1. Recherche d’ARN du VHC ... 48
4.2.2.2. Génotype du VHC ... 48
5. Traitement ... 49
5.1. Molécules antivirales standards ... 49
5.1.1. Interférons ... 49
5.1.1.1. La voie de signalisation d’IFN lors de l'infection par le VHC ... 53
5.1.1.2. Mécanisme d’action et pharmacocinétique ... 54
5.1.1.3. Propriétés biologiques de l’IFNα ... 57
5.1.1.4. Pharmacologie des IFNs ... 59
5.1.2. Ribavirine ... 59
5.1.2.1. Mécanisme d’action et pharmacocinétique ... 60
5.1.2.2. Pharmacologie de la Ribavirine ... 62
5.1.3. Algorithme de traitement des patients infectés par VHC ... 64
5.1.4. Amélioration des traitements actuellement disponibles... 65
5.2. Agents antiviraux à action directe (DAA) ... 65
5.2.1. Inhibiteurs de protéases ... 67
5.2.2. Inhibiteurs de polymérases... 68
5.2.2.1. Analogues nucléosidiques ... 68
5.2.2.2. Analogues non nucléosidiques ... 68
5.3. Autres approches thérapeutiques ... 70
5.3.1. Immunomodulation de la voie des IFN ... 70
5.3.2. Cyclosporine A ... 70
XII
5.3.4. ARN interférents ... 71
5.3.5. Micro-ARN (miRNA) ... 71
5.3.6. Inhibiteurs de l’α-glucosidase ... 71
5.4. Réponse au traitement ... 72
5.4.1. Réponse virologique soutenue (SVR) ... 72
5.4.2. Réponse virologique rapide (RVR) ... 72
5.4.3. Réponse virologique précoce (RVP)... 73
5.4.4. Non-réponse ... 73
5.5. Facteurs influençant la réponse au traitement ... 73
5.5.1. Facteurs viraux ... 74
5.5.2. Facteurs de l’hôte ... 74
6. Cytokines ... 76
6.1. Interleukines ... 78
6.1.1. Interleukine 28B (IL28B)... 79
6.1.2. Association des polymorphismes d’IL28B et la réponse au traitement du VHC 80 6.1.3. Niveaux d’expression d’IL28B ... 81
6.1.4. Rôle fonctionnel des polymorphismes IL28B ... 83
II TRAVAUX DE THESE ... 86 1. Contexte de l’étude ... 87 2. Objectifs ... 87 3. Patients et Méthodes ... 88 3.1. Patients ... 88 3.2. Matériels et Méthodes ... 88
3.2.1. Collecte des données ... 88
3.2.2. Prélèvements ... 89
XIII
3.2.4. Extraction d’ADN ... 90
3.2.5. Détermination des génotypes des SNP rs12979860 du gène d’IL28B ... 91
3.2.6. Détermination des génotypes des SNP rs8099917 du gène d’IL28B ... 93
3.3. Analyse statistique ... 97
4. Résultats ... 97
4.1. Etude du polymorphisme rs12979860 ... 97
4.1.1. Caractéristiques des patients ... 97
4.1.2. Génotypage du SNP rs12979860 d’IL28B et la réponse virologique ... 100
4.2. Etude du polymorphisme rs8099917 ... 103
4.2.1. Caractéristiques des patients ... 103
4.2.2. Analyse des génotypes du SNP rs8099917 ... 105
5. Publication de résultats ... 109
6. Discussion ... 118
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ... 120
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 121
XIV
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Séquences des amorces utilisées pour la détermination du rs12979860 par HRM 91 Tableau 2 : Séquences des amorces utilisées pour l’amplification du rs8099917 ... 93 Tableau 3: Données démographiques et biologiques des patients ... 98 Tableau 4: Distribution des génotypes du polymorphisme rs12979860 selon la réponse au traitement. ... 100 Tableau 5: Association du rs12979860 et le génotype du VHC ... 102 Tableau 6: Résultats de l'analyse univariée et multivariée des facteurs associés à la réponse au traitement chez les patients atteints du VHC génotype 1(n=112) ... 102 Tableau 7: Données démographiques et biologiques chez tous les patients étudiés en fonction de leur réponse au traitement. ... 104 Tableau 8: Répartition génotypique du polymorphisme rs8099917 IL28 selon la réponse au traitement ... 107 Tableau 9: Répartition des génotypes du rs8099917 en fonction du VHC ... 108 Tableau 10: Résultats des analyses univariées et multivariées des facteurs associés à une réponse virologique soutenue (SVR) chez tous les patients (n = 173) ... 108
XV
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Schéma simplifié de la structure du virus de l'hépatite C. ... 5
Figure 2: Organisation du génome du virus de l'hépatite C1 ... 7
Figure 3: Entrée, réplication et assemblage du virus de l'hépatite C1 ... 24
Figure 4: Arbre de l'évolution des génotypes du VHC1 ... 26
Figure 5: Sous-types du virus du VHC1 ... 26
Figure 6: Quasi-espèce virale1 ... 28
Figure 7: Répartition mondiale de l’infection au VHC (en %)1 ... 30
Figure 8: Activation immunitaire innée par l'ARN du VHC1 ... 35
Figure 9 : Modulation de l'immunité innée pendant l'infection par le virus de l'hépatite C (VHC)1. ... 42
Figure 10 : Schéma des voies de signalisation des IFN de type I et III (Sadler, 2008) ... 56
Figure 11: Mécanismes d’action décrits pour la RBV (Jeulin et al. 2009) ... 62
Figure 12: Evolution de la prise en charge thérapeutique du VHC1 ... 66
Figure 13: Photo du gel après amplification du fragment d'ADN de 522 pb du SNP rs8099917 ... 94
Figure 14:Exemple de chromatogramme de la séquence d’ADN contenant le SNP rs8099917 ... 107
XVI
LISTE DES GRAPHES
Graphe 1: Association de la charge virale initiale du VHC et la réponse au traitement ... 99 Graphe 2: Répartition des génotypes du VHC chez les patients ... 99 Graphe 3: Taux de la réponse au traitement chez les patients infectés par le génotype 2 du VHC ... 99 Graphe 4: Répartition des génotypes du VHC selon les tranches d'âge des patients ... 100 Graphe 5: Réponse au traitement chez les patients ayant le génotype CC du rs12979860 ... 101 Graphe 6: Répartition des génotypes du rs12979860 chez les trois groupes de patients ... 101 Graphe 7: Répartition des génotypes du rs12979860 selon le génotype du VHC ... 102 Graphe 8: Taux de la réponse au traitement chez tous les patients ... 104 Graphe 9: Taux de la réponse au traitement chez les patients infectés pas le génotype 2 du VHC ... 105 Graphe 10: Répartition des génotypes du VHC selon la réponse au traitement ... 105 Graphe 11: Répartition des génotypes du SNP rs8099917 chez les trois groupes de patients (Répondeurs ; Non répondeurs ; Rechuteurs) ... 108
XVII
LISTE DES ABREVIATIONS
Ac Anticorps
ADME Absorption, Distribution, Métabolisation, Elimination
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire
ALAT Alanine Amino Transférase
ALD Affection de Longue Durée
ARN Acide Ribonucléique
ARNm ARN messager
ASAT Aspartate Amino Transférase
CD81 "Cluster of Differentiation 81"
CHC Carcinome hépatocellulaire
CLDN Claudine
DC-SIGN "Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Nonintegrin"
ELISA "Enzyme Linked Immune-sorbent Assay"
FDA "Food and Drug Administration"
GAG Glycosaminoglycane
GTP Guanosine triphosphate
VHB Virus de l’Hépatite B VHC Virus de l’Hépatite C HDL "High Density Lipoproteins"
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine HVR1 "Hyper-Variable Region 1"
IFN Interféron
IFN-Peg Interféron pégylé
Ig Immunoglobuline
IL Interleukine
IL28B Interleukine 28B
INN Inhibiteur Non Nucléosidique
INNTI Inhibiteur Non Nucléosidique de la Transcriptase Inverse
INTI Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse
IP/r Inhibiteur de la Protéase potentialisé par le ritonavir
IRES "Internal Ribosome Entry Site"
JAK Janus kinase
XVIII
LD "Lipid Droplet"
LDL "Low Density Lipoprotein"
LDLR "Low-Density Lipoprotein Receptor"
LTC Lymphocyte T Cytotoxique
MTP "Microsomal Triglyceride transfer Protein"
NC Non codante
NK "Natural killer"
NS Protéine Non Structurale du VHC
NTR “untranslated regions”
OMS Organisation Mondiale de la Santé
ORF "Open Reading Frame"
PCR "Polymerase Chain Reaction"
PDVL Lipo-viro particules
Peg-IFN /RBV Interféron Pégylé/Ribavirine
PKR Protein Kinase R
RE Réticulum Endoplasmique
RHV Région Hypervariable
RT-PCR "Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction"
RT-PCR Real Time PCR
RVR Réponse Virologique Rapide
SVR Réponse Virologique Soutenue
SNP "single-Nucleotide Polymorphism"
SRB1/Cla-1 "Scavenger Receptor Class B type 1"
TGO Transaminase Glutamino-Oxaloacétique.
TGP Transaminase Glutamyl-Pyruvique
TK Thymidine Kinase
Tmax Temps Maximum
UTR "Untranslated Transcribed Region"
XIX
LISTE DES ANNEXES
1
INTRODUCTION GENERALE
Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus enveloppé, d'ARN simple brin qui appartient à la famille des Flaviviridae, genre hépacivirus. L'infection par le virus de l'hépatite C est un problème majeur de santé mondial, elle affecte environ 3% de tous les individus et une des principales causes d’hépatite chronique, de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. Actuellement, plus de 200 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par ce virus. Au Maroc, la prévalence des anticorps anti-VHC est de 1,6%. L’hépatite C chronique est une cause majeure de la cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. Le traitement de l'infection chronique par le VHC par l'interféron Pégylé/Ribavirine (Peg-IFN/RBV) produit une réponse virologique soutenue (SVR) dans seulement 40 à 50% des patients atteints du VHC de génotype 1 et environ 60 % chez les patients infectés par le génotype 4, alors que plus de 80% des patients avec des génotypes 2 ou 3 atteignent une SVR. En plus du coût qui reste relativement élevé, ce type de traitement peut entraîner de nombreux effets secondaires indésirables, d’où l’intérêt majeur d’apporter d'autres soins et d'avoir une approche économique susceptible de prédire la réponse thérapeutique.
Il existe de nombreux facteurs de prétraitement qui peuvent influer la réponse au traitement avec Peg-IFN/RIB chez les patients atteints d'hépatite C chronique (HCC), tels que l'âge, le sexe, l'origine ethnique, l'indice de masse corporelle, la résistance à l'insuline, la stéatose hépatique, le degré de fibrose hépatique, le génotype du VHC, la charge virale de base et cinétique virale en cours de traitement ou avec des niveaux plus élevés d'AST de prétraitement et les facteurs génétiques de l’hôte.
Les interférons (IFN) sont des cytokines-clés produites par les cellules immunitaires et jouent un rôle essentiel dans la défense naturelle contre l'infection par le VHC chez l’hôte. Les gènes codant pour ces cytokines sont polymorphes à des sites spécifiques, certains polymorphismes situés au sein du gène ou des régions régulatrices ont été associés à un niveau d'expression différent de ces cytokines.
Le gène de l’interleukine 28B (IL28B) est une cytokine qui code pour l’interféron λ3 (IFN- λ3), qui induit une activité antivirale par lui-même et par l'intermédiaire du complexe Janus kinase et le Signal Transducteur et Activateur de la Transcription (JAK-STAT), ce qui induit la stimulation d’autres gènes d’IFN (ISG) qui ont également une activité antivirale contre le VHC.
2 Plus récemment, des polymorphismes (SNP), à proximité du gène IL28B sur le chromosome 19, ont été identifiés par des études d'associations génomiques et sont fortement associés à une SVR ou à la non-réponse au traitement par le Peg-IFN/RBV seul ou en combinaison avec du Telaprevir. Ces variations génétiques à proximité du gène IL28B sont également associées au risque de la persistance virale chez les patients atteints d'hépatite aiguë C.
L’objectif de notre travail est de déterminer les variations génétiques près du gène d’IL28B et leurs impacts sur la réponse au traitement par le Peg-IFN/RBV chez une cohorte de patients marocains atteints de l’hépatite C chronique.
I REVUE
BIBLIOGRAPHIQUE
1. Virus de l’hépatite C
1.1. Historique
Dans les années 1970, des études épidémiologiques décrivaient de nouveaux cas d’hépatites virales transmises lors de transfusions sanguines. Ces hépatites ont été nommées « non-A non-B » car de nouveaux tests diagnostiques avaient permis de montrer que les virus des hépatites A et B n’étaient pas responsables de ces nouveaux cas. C’est seulement en 1989 que l’équipe de Mickaël Houghton a identifié pour la première fois le virus responsable de cette nouvelle hépatite virale : le virus de l’hépatite C ou VHC [1]. Le génome viral a été ensuite séquencé et la comparaison avec d’autres séquences virales connues a permis de classer le VHC au sein de la famille des Flaviviridae dans un nouveau genre Hepacivirus [1,2]. Les isolats de différents individus ont montré une diversité génétique substantielle, cette variation a été résumée en génotypes et sous-types, dans une classification de consensus, puis des règles formelles ont été adoptées pour l'affectation et la désignation du futur génotype et variant [3]. Après le développement de tests sérologiques, qui ont détecté l’anticorps anti-VHC, des études ont noté que la majorité des patients atteints du carcinome hépatocellulaire (CHC) ont été testés positifs à l’anticorps anti-VHC, indiquant une association entre le VHC et CHC [4].
Plus de vingt ans de recherches, les études ont fourni une meilleure compréhension du virus de l'hépatite C, y compris les propriétés générales de l'ARN viral, des protéines et du cycle de vie. Cet effort facilite le développement d’outils de diagnostic et de traitements antiviraux efficaces. À l'heure actuelle, il est recommandé d'effectuer le test de dépistage sérologique chez les individus à haut risque, par ailleurs les tests d'acide nucléique sont recommandés pour confirmer les infections par le VHC actif. La quantification d'ARN et le génotypage du VHC sont importants pour déterminer la durée optimale du traitement antiviral et prédire la probabilité de réponse au traitement.
Au début des années 2000, l’interféron pégylé plus ribavirine sont devenus la norme standard du traitement contre l’infection par le VHC. En 2014, le Bocéprévir, le Télaprévir, Simeprevir, et Sofosbuvir Harvoni sont approuvés par la FAD pour le traitement des infections par le VHC. La nouvelle thérapie "tout orale" sans interféron, anti-VHC, sera probablement disponible dans les prochaines années [5]. Cependant, le coût élevé des traitements antiviraux, la résistance virale et l’efficacité prophylactique du vaccin seront le prochain défi dans la lutte contre l'infection par le VHC [5].
1.2. Structure virale et organisation génomique 1.2.1. Structure du virus
Le VHC est un petit virus enveloppé au sein de la famille des Flaviviridae, genre
Hepacivirus [6]. Il est constitué d'un simple brin d’ARN, d’environ9.6 kb avec un rayon
d'environ 25 nm. La nucléocapside du virus a une masse volumique de 1,25 g / cm3 dans le saccharose [7]. Les particules de VHC ont une taille d'environ 55-60 nm de diamètre [8]. Le virion du VHC est constitué d’ARN génomique enfermé dans une nucléocapside formée par la protéine de noyau et entourée par une bicouche lipidique contenant les glycoprotéines virales E1 / E2 (Figure 1) [9]. Ces virions existent dans le sérum de patients, associés à des lipoprotéines enrichies en triglycérides de basse densité (LDL) et des lipoprotéines de très basse densité (VLDL) [10], et par conséquent présentent une large gamme de densités plus enrichies en lipides, des particules de densité inférieure tendant à avoir la plus haute infectiosité [11].
1.2.2. Génome viral
Le génome du VHC est un ARN monocaténaire linéaire de polarité positive, composé de 3 régions principales : d’une extrémité 5’ non-codante (5’UTR), d’un cadre ouvert de lecture unique codant la polyprotéine virale et d’une extrémité 3’ non-codante (3’UTR) [12]. L'UTR en 5' n’est pas plafonnée et se replie en une structure d'ARN secondaire comprenant quatre grands domaines structuraux distincts, I à IV. Cette structure est formée avec une partie du domaine de noyau de codage, un site d'entrée interne des ribosomes (IRES : médie la liaison directe de sous-unités ribosomiques) et des facteurs cellulaires qui conduisent à la traduction. L’UTR 5' contient 341 nucléotides situées en amont du codon d'initiation de traduction ORF, la région la plus conservée du génome [13]. Le cadre de lecture ouvert (codes ORF) contient 9024 à 9111 nucléotides, code pour un polypeptide avec environ de 3.010 à 3.033 d'acides aminés en fonction du génotype du VHC [13]. L'UTR 3' est plus courte et moins structurée que l'UTR 5 ' et contient environ 225 nucléotides. Elle est organisée en trois sections de 5' à 3'. Ces trois parties comprennent une tige-boucle d'ARN, c’est une région variable de 30 à 40 nucléotides, un long poly (U) - poly (U/UC) et une "queue X" en 3'-terminale hautement conservée [14]. Cette extrémité est essentielle pour la réplication virale.
L'ORF code pour au moins onze protéines, y compris les trois protéines structurales, un petit canal ionique : protéine p7, six protéines non-structurelles (NS) et des protéines structurales du Frameshift 'F' constituées de protéines de base 'C’et de protéines d’enveloppe 'E'. La fonction opérée par la protéine P7 est indéterminée. Les protéines non structurales sont constituées de types NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B [15]. Elles sont disposées dans l'ordre suivant : NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Figure 2).
Figure 2: Organisation du génome du virus de l'hépatite C1
1Organisation génomique du VHC : Représentation schématique du génome d'ARN à brin positif de 9,6 kb. Des structures
secondaires d'ARN simplifiées dans les régions 5 'et 3' non codantes (NCRs) sont affichées. La traduction par médiation interne du site d'entrée du ribosome (IRES) produit un précurseur de polyprotéine qui est transformé en protéines structurales et non structurales matures. Les positions des nucléotides sont indiquées par des nombres sur la partie supérieure du schéma. Les positions d'acides aminés sont indiquées par des nombres dans la partie inférieure du schéma. La région codante est représentée par des rectangles montrant les protéines codées correspondantes. Les pointes de flèches solides désignent les clivages par la peptidase du signal de réticulum endoplasmique. La pointe de flèche ouverte indique un autre traitement C-terminal de la protéine de noyau par peptidase de peptide signal. Les étoiles rouges indiquent des clivages par les protéases NS2 et NS3-4A du virus de l'hépatite C.(Natalia Echeverría, Gonzalo Moratorio, Juan Cristina et al. Hepatitis C virus genetic variability and evolution. World J Hepatol. Apr 28, 2015 ; 7(6) : 831-845)
1.2.3. Structure et Fonction des protéines virales 1.2.3.1. Protéine Core ou noyau
La protéine de capside du VHC comprend la première protéine de structure à l'extrémité amino de la polyprotéine [16,17]. C’est un polypeptide de 191 acides aminés, hautement conservé qui emballe son génome ARN pour former la nucléocapside virale [18]. La protéine du cadre de lecture alternatif (ARFP) / core + 1 / F est produite à la suite d'un décalage -2/+1 du cadre ribosomique dans la région de coeur codant.
La détection d’anticorps et de cellules T spécifiques de la protéine F chez des patients infectés par le VHC, suggère qu’elle est exprimée pendant l’infection par le VHC in vivo (Gao, 2008). Elle n’est pas essentielle à la réplication virale ou à la production de virus infectieux (Vassilaki, 2008), mais pourrait agir comme un facteur de régulation (Branch, 2005).
En plus de leur rôle dans l'assemblage des particules virales, les protéines du noyau semblent exercer plusieurs fonctions biologiques sur les cellules hôtes : la régulation des gènes dont la transcription, l'apoptose, l'altération de signalisation d’IFN, la transformation des cellules et l’interférence avec le métabolisme des lipides [19,20]. Elles jouent également un rôle dans la pathogenèse [21] et peuvent être impliquées dans l'hépatocarcinogenèse et la stéatose [18]. Beaucoup de ces effets biologiques de la protéine de capside sont censés offrir un avantage à la survie du virus.
1.2.3.2. Protéines E1/E2 de la surface virale
E1 et E2 sont des protéines transmembranaires de type I fortement glycosylées [22], contenant jusqu'à 6 et 11 sites potentiels de glycosylation respectivement [23], et formant des hétérodimères non covalents. E1 (33-35 kDa) et E2 (70-72 kDa) constituent l'enveloppe virale et sont nécessaires pour l'entrée virale en se liant au récepteur présent dans les interactions immunitaires hôte/virus [24,25].
La glycoprotéine E2, connue sous le nom HVR1-3, contient trois régions hypervariables (HVR) [26], ayant des séquences d'acides aminés variant de 80% entre différents isolats de VHC, qui sont sous pression de sélection continue exercée par le système immunitaire de l'hôte. Cependant, elle crée des problèmes importants pour générer la neutralisation efficace d’anticorps. Des expériences ont démontré que les protéines E1/E2 peuvent former des particules pseudovirales capables de provoquer la réponse par les anticorps [27,28]. Fait intéressant, il a également été rapporté que l’E2 peut interagir avec la protéine kinase PKR, une molécule-clé dans la signalisation induite par l'antiviral IFN [29]. Ces protéines d'enveloppe ont suscité un grand intérêt en raison de leur utilisation potentielle dans le développement d'un vaccin du VHC [27,30].
1.2.3.3. Protéine p7
Le P7 est un polypeptide de 63 d’amino acide, situé entre les protéines structurales et non structurales. Cette protéine est incorporée dans les pores de la membrane et fonctionne comme un canal ionique, servant de signal à la translocation de NS2 dans la lumière du réticulum endoplasmique pour un clivage plus ample. Le P7 est également essentiel pour l'assemblage et la libération de particules de virions infectieux [31,32].
Une étude chez un chimpanzé porteur d'un virus présentant des mutations du P7 n'a pas pu établir l'infection, ce qui indique le rôle essentiel de cette protéine dans le cycle de vie du virus [33].
1.2.3.4. Protéines non structurelles
La protéine NS2
C’est une protéine transmembranaire de 21-23 kDa, ancrée au réticulum endoplasmique avec son terminus carboxy, tandis que son extrémité terminale amino est située dans le cytosol [30]. Le résidu très hydrophobe de la N terminale de NS2 se forme de trois ou quatre protéines hélices transmembranaires insérées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), alors que le domaine C terminal de la protéine NS2 joue un rôle important dans l’activité de protéase NS2/3 avec le domaine N terminal de la NS3 [34,35]. La NS2 est l'autoprotéase virale qui joue un rôle-clé dans l'assemblage viral et la médiation du clivage entre NS2 et NS3 [36]. Elle est également essentielle pour la fin du cycle de la réplication virale. Elle peut être phosphorylée par la protéine kinase CK2 et elle est impliquée dans la modulation de l'apoptose cellulaire et la transcription [37].
La NS3
C’est un polypeptide de 67 kDa qui possède des activités multifonctionnelles. L'extrémité N terminale de la NS3 a une activité de sérine protéase et son extrémité C terminale a une activité hélicase/NTPase [38,39]. Les protéines NS3 sont liées à la membrane du RE à travers l'interaction avec les protéines NS4A. L'activité enzymatique hélicase/NTPase du NS3 est indispensable à la réplication de l'ARN virale.
La protéase du VHC perturbe les voies de signalisation d'interféron (IFN) et de toll-like receptor-3 (TLR3) par clivage de protéines de l'hôte, y compris le domaine de recrutement des caspases de la protéine de signalisation antiviral mitochondrial « Mitochondrial
antiviral-signaling protein »(MAVS) [40] et l'interféron-β inducteur d'adaptateur ( TRIF )« TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) » contenant le domaine (TIR )« Translation Initiation Region »est un adaptateur pour répondre à l'activation de récepteurs analogues (TLR) [41]. Des études antérieures ont montré que la NS3 ou son fragment peuvent inhiber la phosphorylation AMPc à médiation par la protéine kinase dépendante et interagir avec, ou affecter les fonctions cellulaires de l'hôte [42].
La résolution de la structure tri-dimensionnelle de NS3 et du complexe NS3-NS4A a récemment révélé que cette protéase est proche des chymotrypsines [43].
La NS4A
C’est un polypeptide de 54 acides aminés qui forme un complexe stable avec la NS3 et agit comme cofacteur pour la protéase NS3. La NS4B est une petite protéine hydrophobe exigée pour le recrutement d'autres protéines virales [44,45]. La protéase NS3/4A est essentielle pour les clivages des protéines virales non structurales. Elle est également nécessaire pour la phosphorylation de la NS5A et peut directement interagir avec la NS5A. Ainsi, elle est la cible de choix pour la thérapie anti-VHC.
La NS4B, petite hydrophobe de 27 kDa, recrute une autre source virale de protéines non structurelles pour former le complexe de réplication.
La NS5
La NS5 est clivée en NS5A et NS5B. La NS5A, phosphoprotéine hydrophile 56 à 58 kDa, est nécessaire pour la réplication virale. La NS5A est constituée de trois domaines [46]. Bien que les domaines des NS5A I et II soient importants pour la réplication [47], le domaine III a été montré comme important pour l’ensemble viral [48]. C’est une métalloprotéine dimère de liaison au zinc qui lie l’ARN viral et divers facteurs de l'hôte à proximité immédiate de la capside du VHC et des gouttelettes lipidiques [36]. La NS5A est associée à la membrane de protéine. Elle dispose d'une base structurelle de l'interaction avec d'autres protéines virales. La NS5A est phosphorylée par des kinases sérines cellulaires [46], y compris MEK1, MKK6, AKT, p70S6K, et la protéine kinase dépendante AMPc [47,49]. En outre, la NS5A semble avoir la capacité de moduler plusieurs fonctions cellulaires, y compris la transformation cellulaire, la transcription et l'apoptose. L’interaction de la NS5A avec d'autres facteurs cellulaires peut affecter la résistance au traitement du VHC par l’IFN et l'inhibition de l'IFN induit les protéines kinases [46]. Les inhibiteurs du NS5A-VHC ont montré un effet antiviral chez les patients et sont en développement clinique rapide [36].
La NS5B, une protéine de 65 kDa, est un ARN dépendant, ARN polymerase (RdRp) responsable de la synthèse de nouveaux ARN génomiques, en tant qu'élément central de la réplication du VHC [50]. La structure de la protéine porte la typique ''Droite'' du domaine polymérase [51]. Le processus moléculaire précis de la NS5B dans la réplication d'ARN reste à définir, mais des complexes de réplication composés de multiples protéines apparaissent être impliqués [52]. Le cofacteur de réplication cellulaire, la cyclophiline A, peut améliorer l'activité de liaison à l'ARN de la NS5B, et la cyclosporine présente une activité anti-VHC par le biais de ce mécanisme [53]. La NS5B est devenue une cible majeure de la thérapie antivirale [54].
1.3. Cycle viral
1.3.1. Attachement et entrée du virus
L'entrée du virus dans la cellule hôte implique une série complexe d'interactions y compris la fixation, l'entrée et la fusion. L’attachement viral initial à ses récepteurs / co-récepteurs peut impliquer HVR1-VHC E2 [55,56], par des protéoglycanes de sulfate d'héparane exprimés sur la surface des hépatocytes [57,58]. Les récepteurs de LDL (LDLR) peuvent se lier au VHC et promouvoir son interaction d’entrée cellulaire [59], le VHC-LDLR peut être non-productif et peut potentiellement conduire à une dégradation de la particule virale [60].
À la suite de l'attachement aux facteurs d'entrée, le VHC est internalisé dans les cellules cibles par l'intermédiaire d'un pH dépendant et l’endocytose médiée par un récepteur, également
appelé endocytose clathrine dépendante [61]. L’engagement du récepteur ainsi que le pH
acide de l'endosome déclenchent la fusion de l’enveloppe du virus et la membrane de l'endosome, conduisant à la libération du génome viral dans le cytoplasme [11,62].
De multiples récepteurs cellulaires et les facteurs d'entrée pour le VHC ont été identifiés, y compris le récepteur scavenger de classe B type I (SRB1), et CD81 [63,64], les protéines de jonctions serrées, claudine-1 (CLDN1) et occludine (OCLN) [65,66] et les DC-SIGN
« Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin » /
L-SIGN « Liver/lymph node-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing integrin » [67]. Plus récemment, des facteurs d'entrée supplémentaires ont été identifiés, les récepteur kinases tyrosines (RTK), Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), Ephrin type-A receptor 2 (EphA2) [68] et les récepteurs de Niemann-Pick C1-like 1 absorbeurs du cholestérol (NPC1L1) (Figure 3) [69].
1.3.1.1. Déterminants cellulaires 1.3.1.1.1. Molécules de capture
Glycosaminoglycanes
Les chaînes de glycosaminoglycane (GAG) forment des protéoglycanes sur la surface cellulaire, fournissent des sites d'accueil primaires pour la liaison de différents virus et d'autres micro-organismes aux cellules eucaryotes. L'héparane sulfate (GAG) est une molécule de liaison cellulaire importante pour plusieurs virus et peut servir de site d'ancrage pour la fixation initiale du VHC avant que le virus ait transféré à l'entrée par des récepteurs de haute affinité. Plusieurs auteurs ont montré que l’héparine, un homologue des héparanes sulfates, et l’héparinase, capable de dégrader les héparanes sulfates à la surface des cellules, inhibaient l’adsorption du VHC [70].
Lectines : DC-SIGN / L-SIGN
Les lectines de type C ont des rôles divers. Elles peuvent servir tant au niveau de l’adhésion cellulaire que comme des récepteurs d’identification des agents pathogènes. Elles contiennent des domaines d’identification pour les carbohydrates (CRD) « Carbohydrate
Recognition Domain ». Ces molécules sont capables de reconnaître des structures glycanes de
manière dépendante du Ca2+. Elles ne sont pas spécifiques du VHC car elles ne sont pas
exprimées au niveau des hépatocytes. Parmi les formes membranaires de ces lectines, on retrouve les molécules la DC-SIGN et la L-SIGN. La DC-SIGN est exprimée dans les cellules de Kupffer, qui sont des macrophages hépatiques immobiles localisés à proximité des cellules épithéliales des sinusoïdes du foie (LSEC) et des hépatocytes. La L-SIGN est fortement exprimée sur les cellules épithéliales des sinusoïdes du foie (LSEC), capillaires caractérisés par la présence de macrophages résidents, induit des interactions entre LSEC et lymphocytes. La liaison de type C mannose lectines DC-SIGN et L-SIGN servent de récepteurs d'adhésion à la médiation contact entre les cellules dendritiques, les lymphocytes T et les cellules endothéliales. La DC-SIGN et la L-SIGN reconnaissent des structures glucidiques sur les pathogènes [71] et se lient à la glycoprotéine d'enveloppe E2 avec une affinité élevée [67]. La L-SIGN et la DC-SIGN exprimées sur les cellules B humaines ou les cellules HLA ont été montrées comme capturant et transmettant le VHCpp de cellules Huh7 d'hépatome humain dans des systèmes modèles de co-culture [72].
1.3.1.1.2. Récepteurs d'entrée
Tétraspanine CD81
Les tétraspanines sont des protéines largement exprimées qui régulent la morphologie cellulaire, la motilité, l'invasion, la fusion et la signalisation. Ces protéines contiennent quatre domaines transmembranaires, courts domaines intracellulaires et extracellulaires, et deux boucles, une petite boucle extracellulaire (SEL) et une grande boucle extracellulaire (LEL) (SEL et LEL : « small and large extracellular loop ») [73].
La CD81 est un membre de la superfamille des tétraspanines exprimé de manière ubiquiste. Elle forme un réseau à la surface de cellule, lequel joue un rôle dans l’organisation de la membrane, par interactions avec diverses protéines. Il a été montré que CD81 fait partie du complexe de récepteurs des antigènes exprimés dans les cellules B et T et est fortement enrichi dans les exosomes, suggérant qu’il puisse être impliqué dans la régulation de la fusion des vésicules. La CD81 est susceptible d'être impliquée après la phase très précoce de l'entrée du VHC, La participation à une phase ultérieure, après internalisation du virus, a également été suggérée [74,75]. La CD81 se lie aux grandes boucles extracellulaires du VHC à travers sa glycoprotéine d'enveloppe E2 [64,76]. Bien que les deux protéines se lient étroitement [76], des études de décours temporel avec des anticorps spécifiques de la CD81, qui bloquent l'infection par le VHC, ont indiqué que la CD81 médie un événement post-jointe dans l’entrée du VHC [77]. La région de liaison E2 à la CD81 est masquée par sa région hypervariable 1 (HVR1), ce qui suggère que la protéine E2 natif peut avoir besoin de subir un changement conformationnel avant que ce co-récepteur soit engagé [78].
Le traitement des particules virales avec la CD81 soluble les rend sensibles à l'acide, ce qui indique que l'interaction avec la CD81 peut aider à amorcer les glycoprotéines de VHC à faible activation de pH pendant l’entrée du virus [74]. En outre, la fonction d’entrée du VHC/ CD81 nécessite une interaction avec la CLDN1 [79], la CD81 contribuant à définir le tropisme du VHC pour les cellules humaines [80,81]. Plus précisément, le VHC est capable d'infecter les souris qui expriment la CD81 humaine et l'OCLN dans le foie [80,81].
Protéines des jonctions serrées Claudine-1 et occludine Claudine-1 (CLDN1)
Les claudines possèdent quatre domaines transmembranaires. Elles interagissent via leurs domaines extracellulaires avec celles de la cellule voisine pour établir le contact cellule-cellule. Les claudines sont capables de se polymériser et de former des pores qui permettent une diffusion sélective des ions et molécules à travers l’espace paracellulaire, la Claudine-1 (CLDN1), est identifiée comme un facteur essentiel d'entrée du VHC. Cette protéine est composée de 24 membres impliqués dans la formation des jonctions serrées, elle est localisée
aux jonctions serrées à la surface basolatérale des hépatocytes et des autres cellules polarisées [82]. Bien que la CLDN1 n’interagisse pas directement avec les glycoprotéines de VHC, elle contribue à des étapes de post-liaison d'entrée du VHC en interagissant avec la CD81, ce qui facilite l'intériorisation du virus [65,79]. La CLDN1 est fortement exprimée dans le foie, mais aussi dans d'autres tissus [83]. Récemment, les anticorps monoclonaux anti-CLDN1 ont été montrés in vitro comme inhibant l'infection par le VHC dans les hépatocytes, par la neutralisation des interactions entre E2 du VHC et CLDN1 [60,84].
Occludine (OCLN)
L’OCLN est une protéine de jonction serrée qui est nécessaire pour l'entrée du VHC, mais il est difficile de savoir si l'OCLN interagit directement avec les particules du VHC [81]. Les deux protéines des jonctions serrées (CLDN1 et OCLN) identifiées par criblage de la banque d'ADNc de facteurs cellulaires qui permettent l'infection par pseudoparticules du VHC, se sont avérées être des facteurs d'entrée essentiels pour le VHC [65,66]. Fait intéressant, ni la CLDN1 ni l'OCLN ne semblent interagir directement avec des particules de VHC. Cependant, la CLDN1 peut interagir avec la CD81 en tant que partie du complexe de récepteur du VHC [79,85], il est suggéré que la CLDN1 et l'OCLN sont impliquées dans une phase ultérieure de l'entrée du VHC, après le SRBI et la CD81.
NPC1L1
Le NPC1L1 a été identifié comme un facteur d'entrée du VHC. L'ézétimibe, un inhibiteur spécifique du NPC1L1, bloque l'entrée du VHC dans une culture cellulaire et chez des souris portant des greffons de foie humain, et le knockdown du NPC1L1 inhibe l'entrée du VHC dans une culture cellulaire [69]. Le NPC1L1 se localise dans la surface apicale, canaliculaire des hépatocytes polarisés, où il fonctionne dans le recaptage de bile de cholestérol et peut être internalisé à des compartiments endosomaux [86]. Le rôle spécifique du NPC1L1 en entrée du VHC est inconnu, mais implique probablement l'absorption du cholestérol. Étant donné que le VHC pénètre dans les hépatocytes du côté basolatéral, le NPC1L1 peut médier ces effets dans les endosomes.
Récepteurs de Scavenger SR-BI
Le SR-BI ou CLA-1 (CD36 et LIMPII Analogue-1) est une glycoprotéine de 509 acides aminés avec une grande boucle extracellulaire ancrée à la membrane de plasma, à l'extrémité N et aux extrémités C des domaines transmembranaires avec des extensions courtes dans le cytoplasme [87]. Le SR-BI contribue à la fixation du virus par interaction avec les lipoprotéines. Ainsi que l'activité de transfert du lipide, le SR-BI médiatise un événement post-obligatoire qui est important pour produire l’entrée virale [88,89], suite au transfert de lipides, SR-BI se lie à E2 en interagissant avec la HVR148 E2 [88], ce qui expose les déterminants d’E2 qui lui permettent de se lier au CD8.
Récepteurs de LDL
Le récepteur de LDL (LDLR) transporte les lipoprotéines contenant du cholestérol dans la cellule par endocytose via des puits recouverts de clathrine. Les complexes récepteur-ligand sont livrés dans les endosomes où le pH faible induit la libération de lipoprotéines qui procèdent ensuite vers les lysosomes où le cholestérol libre est généré par hydrolyse des esters de cholestérol [90].
1.3.2. Signaux annonçant l'entrée du VHC
Des études récentes montrent que l'axe CD81-CLDN1 d'entrée du VHC dépend de l'intégrité des voies de transduction des signaux spécifiques. Les inhibiteurs de la protéine kinase A (PKA) ont été montrés comme perturbant l'interaction entre CD81 et CLDN1, conduisant à l’internalisation CLDN1 de la surface cellulaire et l'inhibition de l’entrée du VHC, mettant en évidence le rôle essentiel de la PKA dans ce processus.
En outre, l'engagement VHC E2-CD81 active le Rho, membre de la famille GTPase Rac1, RhoA et Cdc, qui modifient les filaments d'actine et les corticales permettant la mobilité latérale des complexes VHC-CD81 à des sites de contact cellule-cellule [91]. Ainsi, les Rho GTPases peuvent être nécessaires au VHC-CD81 pour interagir avec la protéine de jonction serrée CLDN1 avant l’internalisation du virus. Conformément à cela, un inhibiteur de la RhoA a été prouvé pour inhiber l'endocytose du complexe CD81-CLDN1 [75].
En plus des voies de signalisation PKA et Rho, des récepteurs de tyrosine kinases (RTK) ; le Récepteur du Facteur de Croissance Epidermique (EGFR) « epidermal growth factor receptor » et des récepteurs éphrine A2 (EphA2) ont été identifié dans la bibliothèque de siRNA spécifiques génome humain comme facteurs de l'hôte nécessaires pour l’entrée du VHC [68].
La signalisation EGFR et EphA2 favorise l'axe CD81-CLDN1 d'assemblage du virus et la libération au cours des étapes ultérieures du cycle de vie du virus, après la réplication de l'ARN, des particules de VHC naissantes formées par bourgeonnement dans le réticulum endoplasmique (RE), un processus qui doit réunir les génomes viraux à emballer, la protéine centrale virale, et les glycoprotéines E1-E2 dans une manière temporellement et spatialement organisée. Les particules virales naissantes transitent par la voie de sécrétion, où elles subissent une maturation et acquièrent leur faible densité avant exocytose à la surface cellulaire [92].
1.3.3. Réplication de l’ARN
Le brin positif d'ARN génomique sert de matrice pour la synthèse d'un brin négatif intermédiaire au cours de la première étape de la réplication. L'ARN brin négatif sert de modèle pour produire de nombreux brins de polarité positive qui seront ensuite utilisés pour la traduction de la polyprotéine, la synthèse de nouveaux intermédiaires de réplication ou l'emballage dans de nouvelles particules virales [93,94]. La NS5B RdRp catalyse une amorce dépendante de l'initiation de la synthèse d'ARN, soit par allongement d'une amorce hybridée à la matrice d'ARN ou par un mécanisme de recopie [95]. Plus récemment, la RdRp du VHC a été montrée capable d'initier la synthèse de nouveaux ARN dans certaines conditions expérimentales [96]. L'initiation de la synthèse d’ARN à l'extrémité 3' comprend le domaine I de l'UTR en 5', qui peut former une tige-boucle G/C-riche, l'UTR 3', et un élément de réplication, agissant en cis (5BSL3.2), constitué de 50 bases situées dans une grande structure cruciforme prévue à l'extrémité 3' de la région de codage NS5B du VHC [97]. L'initiation de la réplication de l'ARN est déclenchée par une interaction entre les protéines du complexe de réplication, la région X de l'extrémité 3' de l'UTR3 et 5BSL3.2 qui forme une structure de pseudonoeud avec une tige-boucle à l'extrémité de l'UTR 3’ [98].
Une forme phosphorylée de PTB a été trouvée dans le complexe de réplication et PTB a été montré comme interagissant avec deux structures tige-boucle conservées de l'UTR 3', interaction pensée moduler la réplication de l'ARN [99].
La réplication du VHC est catalysée par la protéine NS5B. Cependant, d'autres protéines de structure non virale sont aussi importantes. Le domaine hélicase NTPase la protéine NS3 a plusieurs fonctions importantes pour la réplication virale, y compris l'activité stimulée de l'ARN NTPase, la liaison à l'ARN et le développement de vastes structures secondaires d'ARN. La NS4B initialise la formation de complexes de réplication qui supportent la réplication du VHC. La protéine NS5A joue également un rôle régulateur important dans la réplication du virus. La protéine NS4B du VHC semble être suffisante pour induire la formation d'une bande membraneuse associée à la membrane [100]. La bande membraneuse est dérivée de membranes du RE [104]. Elle est riche en cholestérol et en acides gras, et son degré de saturation module la réplication du VHC [101].
Le génome du VHC est répliqué au sein des complexes de réplication associés aux membranes. En effet, les protéines non structurales du VHC et l’ARN s’associent à des structures vésiculaires périnucléaires qui dériveraient du RE et qui semblent être le siège de la
réplication virale. Cet ARN négatif intermédiaire sert ensuite de matrice pour la synthèse de nombreux brins d’ARN positifs [102]. Ces ARN positifs pourront alors être utilisés pour la traduction de nouvelles protéines, dans la synthèse de nouveaux intermédiaires de réplication ou encapsidés dans des particules virales. La bande membranaire est constituée de petites vésicules noyées dans une matrice membraneuse, complexe multiprotéique associé à la membrane qui contient toutes les protéines non structurales du VHC [100]. La bande membraneuse de VHC dans les cellules semble être induite par la NS4B éventuellement en combinaison avec la réplication de l'ARN viral [103]. La NS5A est censée se produire dans ces toiles avec le brin positif d'ARN en tant que matrice de la NS5B RdRp afin de générer le brin négatif réplicatif intermédiaire, pour produire du sens positif supplémentaire.
Les génomes naissants des brins positifs d’ARN peuvent être encore traduits pour produire de nouvelles protéines virales ou servir de modèles pour, outre la réplication de l'ARN, être assemblés à des virions infectieux.
Un certain nombre de facteurs cellulaires sont impliqués dans la réplication du VHC ; la cyclophiline, par exemple, est nécessaire pour la réplication du VHC, par son interaction avec les NS5A et NS5B, et le microARN-122, ce qui permet la réplication du VHC par sa liaison avec la région de 5'(5'UTR) du génome du VHC. Par conséquent, les facteurs de l'hôte peuvent aussi devenir des cibles potentielles pour les anticorps des thérapies anti-VHC. À l'heure actuelle, au moins deux agents hôtes ciblés ont atteint le développement clinique, y compris des inhibiteurs spécifiques de la cyclophiline A, des antagonistes de microARN-122 et le phosphatidylinositol 4-kinase IIIα (PI4KIIIα) [54,104].
La Cyclophiline A peut moduler la capacité de liaison à l'ARN NS5B polymérase et d'interagir avec NS5A. En tant que tels, les inhibiteurs de la cyclophiline ont un effet antiviral contre le VHC et le développement clinique [105]. Le PI4KIIIα, est une kinase lipidique, recrutée pour le web membraneux par la NS5A, assurant l'intégrité membraneuse de la réplication virale [106]. La faible densité synthèse/sécrétion des lipoprotéines est très impliquée dans la machine de la production de particules infectieuses du VHC. Le virus du VHC utilise cette voie lipoprotéine biosynthétique pour produire des particules virales matures et les exporter [107].
