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polymériques particulaires par des procédés sans

solvants toxiques pour l’ingénierie tissulaire du cartilage

Amin Swed

To cite this version:

Amin Swed. Encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires par des procédés sans solvants toxiques pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. Médecine humaine et pathologie. Uni-versité d’Angers, 2015. Français. �NNT : 2015ANGE0039�. �tel-01587784�

JURY

Docteur Hamid Elaissari, Université de Lyon 1

Examinateurs : Docteur Catherine Le Visage, Université de Nantes

Directeur de Thèse : Professeur Frank Boury, Université d’Angers

Amin Swed

Mémoire présenté en vue de l’obtention du

grade de Docteur de l’Université d’Angers sous le label de L’Université Nantes Angers Le Mans

École doctorale : Biologie-Santé

Discipline : Sciences pharmaceutiques

Spécialité : Pharmacologie clinique et expérimentale

Unité de recherche : INSERM U1066

Soutenue le 10 juillet 2015

Thèse N°: 1464

Encapsulation

de

protéines

dans

des

systèmes

polymériques particulaires par des procédés sans

solvant toxique pour l’ingénierie tissulaire du cartilage

i

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Jean-Pierre Benoit, directeur de l’unité de recherche INSERM MINT-U1066, pour m’avoir donné l’opportunité d’effectuer ma thèse au sein de son laboratoire.

Je remercie profondément le Professeur Frank Boury, mon directeur de thèse, pour m’avoir accueilli au sein de son équipe. Je le remercie aussi pour ses conseils, sa patience, ses encouragements et pour la confiance qu’il m’a accordée au cours de ma thèse.

J’adresse toute ma reconnaissance aux membres du jury, Madame Christine Jérôme, Professeur à l’université de Liège et Monsieur Hamid Elaissari, Directeur de recherches CNRS au sein de l’unité UMR 5007 à Lyon de me faire l’honneur de participer à ce jury et pour avoir accepté de consacré du temps à l’évaluation de ce travail de thèse en qualité de rapporteur.

Mes remerciements s’adressent également à Madame Catherine Le visage, Docteur à l’unité INSERM-U791 au sein de l’équipe LIOAD à Nantes, de me faire l’honneur de participer à ce jury en tant qu’examinateur.

Je remercie vivement le ministère syrien de l’éducation et l’université d’AL-Baath pour le financement qui m’a été accordé.

Je voudrais remercier Dr. Thomas Cordonnier de m’avoir aidé concernant les expériences in

vitro, la rédaction et la correction des articles.

Je tiens à remercier également Dr. Brice Calvignac de m’avoir transmis ses expériences et pour son soutien et sa gentillesse.

Je souhaite remercier infiniment mon amie et ma collègue au laboratoire Leila N. Hassani pour sa bonne humeur, sa sympathie, ses conseils, son soutien et ses encouragements.

ii

long de ma thèse.

Un grand merci aussi à mon collègue My-Kien Tran de m’avoir transmis ses expériences et pour ses conseils et sa gentillesse.

Je remercie chaleureusement mes collègues au bureau, Giovanna Lollo, Gaël le Roux, Delphine Séhédic et Fabien Violet pour tous les bons moments et les souvenirs qu’on a passé ensemble.

J’adresse mes sincères remerciements à l’équipe du MINT, pour son accueil et les bons moments qu’on a partagé ensemble.

Finalement, je remercie de tout mon cœur mes parents et mes sœurs pour leur soutien infini et leur amour inconditionnel. Grâce à eux, j’ai pu vivre plusieurs années en France pleines d’émotions et de bonheur.

iv

TABLE DES MATIERES ... iii

TABLE DES FIGURES ... vii

TABLE DES TABLEAUX ... ix

ABREVIATIONS ... xi

I. INTRODUCTION GENERALE ... 1

II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ... 4

II-1. Encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ... 5

II-2. Méthodes d’encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires .... 6

II-2.1. Emulsification-extraction du solvant ... 6

II-2.1.1. Emulsion simple ... 6

II-2.1.2. Emulsion double (multiple) ... 7

II-2.1.2.1. Emulsion eau/huile/eau (E/H/E) ... 7

II-2.1.2.2. Emulsion solide/huile/eau (S/H/E) ... 8

II-2.2. Séparation de phase (coacervation) ... 9

II-2.3. Nébulisation-séchage et nébulisation-séchage à froid. ... 9

II-2.4. Atomisation ultrasonique ... 10

II-2.5. Nébulisation électrique ... 11

II-2.6. Système microfluidique ... 11

II-2.7. Méthodes basées sur la fermeture des pores de particules et sur de gels thermosensibles ... 12

II-2.8. Méthodes basées sur la technologie des fluides supercritiques ... 13

II-2.8.1. Les procédés solvants : Procédé RESS ... 14

II-2.8.2. Les procédés anti-solvants ... 14

II-2.8.2.1. Procédé GAS ... 15

II-2.8.2.2. Procédé SAS ... 15

II-2.8.2.3. Procédé PCA ... 16

II-2.8.2.4. Procédé ASES ... 16

II-2.8.2.5. Procédé SFEE ... 16

II-2.8.3. Les Procédé où le CO2 est utilisé comme soluté : Procédé PGSS ... 17

II-3. Solvants organiques utilisés pour préparer des systèmes polymériques particulaires...18

II-3.1. Solvants organiques toxiques ... 18

II-3.2. Solvants organiques non toxiques ... 19

II-3.2.1. Glycofurol ... 20

II-3.2.2. Dimethyl isosorbide (isosorbide dimethyl ether) ... 20

v

II-4.3. Instabilité des protéines durant la libération ... 23

II-5. Stratégies d’amélioration de la stabilité des protéines dans des systèmes polymériques . 25 II-5.1. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant la formulation ... 25

II-5.1.1. Pegylation des protéines ... 25

II-5.1.2. Complexation des protéines avec des polyélyctrolytes (ion-pairing) ... 25

II-5.1.3. Encapsulation de la protéine à l’état solide ... 26

II-5.1.4. Ajout d’additifs pendant la formulation ... 26

II-5.1.4.1. Les sucres ... 26

II-5.1.4.2. Les tensioactifs ... 27

II-5.1.4.3. Les protéines ... 27

II-5.1.4.4. Les polymères ... 28

II-5.1.4.5. Les acides aminés et les alcools ... 28

II-5.2. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant le stockage ... 28

II-5.3. Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant la libération ... 29

II-5.3.1. Pegylation des protéines ... 29

II-5.3.2. Complexation des protéines avec des polyélectrolytes (ion-pairing) ... 30

II-5.3.3. Neutralisation de l’acidité locale dans les particules de PLGA ... 30

II-5.3.4. Formation de microenvironnement visqueux ... 31

II-5.3.5. Types de polymères et leurs propriétés physico-chimiques ... 31

II-5.3.6. Additifs ... 33

II-6. Application des systèmes particulaires polymériques chargés en facteurs de croissance pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. ... 33

II-6.1. Principe de l’ingénierie tissulaire ... 33

II-6.2. Les axes principaux de l’ingénierie tissulaire... 34

II-6.2.1. Les cellules ... 34

II-6.2.2. Les biomatériaux ... 35

II-6.2.3. Les facteurs de croissance ... 35

II-6.3. Ingénierie tissulaire du cartilage ... 36

III. TRAVAIL EXPERIMENTAL ... 48

CHAPITRE I : Encapsulation de protéines dans des nanoparticules de PLGA par la méthode de séparation de phase ... 49

PUBLICATION 1 : Protein encapsulation into PLGA nanoparticles by a novel phase separation method using non-toxic solvents... 50

CHAPITRE II : Encapsulation de protéines dans des microparticules de PLGA par la méthode d’émulsification/extraction du solvant en milieu CO2 ... 59

vi

PUBLICATION 3 : Sustained release of TGF-β1 from biodegradable microparticles prepared by a new

green process in CO2 medium ... 77

CHAPITRE III : Développement d’un biomatériau hybride en vue de la régénération tissulaire du cartilage ... 96

PUBLICATION 4 : Development of injectable hybrid biomaterial for cartilage tissue engineering ... 97

IV. DISCUSSION GENERALE ... 114

IV-1. Préformulation de la protéine sous forme de nanoprécipités ... 115

IV-2. Procédé de formulation par la séparation de phase (coacervation) ... 116

IV-3. Procédé de formulation par l’émulsification/extraction de solvant en milieu CO2 pressurisé "modified-PGSS". ... 118

IV-4. Caractérisation des systèmes polymériques particulaires ... 120

IV-5. Libération de protéines à partir de systèmes polymériques particulaires ... 120

IV-6. Cytocompatibilité des systèmes polymériques particulaires ... 121

IV-7. Comparaison des propriétés des systèmes particulaires préparées par les deux procédés d’encapsulation ... 121

IV-8. Développement d’un biomatériau hybride en vue de l’ingénierie tissulaire du cartilage. ... 122

V. CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 126

ANNEXES ... 129

Annexe 1 ... 130

viii

Figure 2. Procédé d’encapsulation par évaporation du solvant d’une émulsion double ... 8

Figure 3. Procédé d’encapsulation par nébulisation-séchage. ... 10

Figure 4. Procédé d’encapsulation par atomisation ultrasonique. ... 10

Figure 5. Procédé d’encapsulation par microfluidique. ... 12

Figure 6. Diagramme de phase d’un corps pur. ... 13

Figure 7. Schéma du procédé RESS ... 14

Figure 8. Schéma du procédé GAS. ... 15

Figure 9. Schéma du procédé SAS/PCA/ASES. ... 16

Figure 10. Schéma du procédé PGSS. ... 17

Figure 11. Dénaturation physique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ... 21

Figure 12. Dégradation chimique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires ... 22

Figure 13. Profil de libération de protéine à partir de microparticules de PLGA (50:50) et mécanismes de libération incomplète ... 24

Figure 14. Hydrolyse de PLGA ... 31

Figure 15. Principe de l’ingénierie tissulaire. ... 34

Figure 16. Etape de gélification du Si-HPMC ... 38

Figure 17. Interactions entre les composants lors de la séparation de phase. ... 117

x

Tableau 2. Classification des solvants organiques d’après la Pharmacopée Européenne (2005). ... 19 Tableau 3. Données comparatives sur la toxicité des solvants non-standardisée dans la Pharmacopée Européenne. ... 20 Tableau 4. Causes d’instabilité des protéines dans des systèmes particulaires de PLGA. ... 24 Tableau 5. Comparaison des propriétés des particules préparées par les procédés de séparation de phase et de modified-PGSS. ... 122

xii

BSA : Bovine serum albumin

CO2SC : Dioxyde de carbone supercritique

CSM : Cellules souches mésenchymateuses DMI : Dimethyl isosorbide

DMSO : Dimethyl sulfoxide E/H : Eau dans huile EPO : Erythropoietin

FDA : Food and drug administration FGF : Fibroblast growth factor FSC : Fluides supercritiques GA : Glycolic acid

GAS : Gas Anti-solvent GF : Glycofurol GOD : Glucose oxidase

GPTMS : Glycidoxypropyltrimethoxy silane HBcAg : Hepatitis B core antigen

H/E : Huile dans eau

HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonic acid IGF-1 : Insulin like-growth factor-1

LA : Lactic acid

mPEG INF : Methoxy-polyethylene glycol interferon MPs Microparticles

NGF : Nerve growth factor NMP : N-methyl pyrolidone NPs Nanoparticles

PCA : Precipitation by compressed anti-solvent PDE : Permitted daily exposure

PDGF : Platelet-derived growth factor PEG : Poly ethylene glycol

PEO-PPO-PEO : Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) PELA : Poly-lactide-poly(ethylene glycol)

xiii

PLCL : Poly(lactide-co-caprolacton) PLGA : Poly(lactic-co-glycolic acid) PMAA : Poly(methacrylic acid) PNVCL : Poly(N-vinyl caprolactam) POE : Polyoxyethylene

PVA : Poly vinyl alcohol

RESS : Rapid expansion of a supercritical solution

rhBMP-2 : Recombinant human bone morphogenetic protein 2 rhEGF : Recombinant human epidermal growth factor rhGH : Recombinant human growth hormone

S/H/E : Solide/huile/eau

SAS : Supercritical anti-solvent

SFEE : Supercritical fluid extraction of emulsion Si-HPMC : Silanized hydroxypropyl methylcellulose TGF-β1 : Transforming growth factor-beta1

2

Le cartilage est un tissu particulier non vascularisé. Ainsi, la capacité de réparation de ce tissu est limitée. De nombreuses stratégies thérapeutiques ont été développées pour la régénération du cartilage. Parmi celles-ci l’ingénierie tissulaire est une stratégie intéressante et peu invasive. Une des approches possibles de cette stratégie thérapeutique consiste en l’association de cellules, de biomatériaux et de facteurs de croissance. Les cellules sont isolées du patient puis cultivées in vitro dans le but de les amplifier. Elles sont ensuite combinées à un biomatériau et à des facteurs de croissance afin d’être réimplantées au niveau du cartilage lésé.

Dans ce cadre, l’objectif de ce travail de thèse, dans un premier temps, est d’encapsuler un facteur de croissance (transforming growth factor-beta1 (TGF-β1)) dans des particules polymériques en utilisant des procédés sans solvant toxique afin de protéger cette protéine fragile et de contrôler sa libération. Dans un deuxième temps, nous avons envisagé d’associer ces systèmes polymériques avec un hydrogel injectable contenant des cellules souches. La libération contrôlée du TGF-β1 à partir des particules permettrait la survie, la prolifération et la différenciation des cellules impliquées dans la régénération tissulaire du cartilage.

De nombreux procédés permettant l’encapsulation de protéines ont été décrits dans la littérature. L’inconvénient de ces procédés est l’utilisation de solvants volatils tels que les solvants halogénés. Ces solvants sont considérés toxiques pour la santé et pour l’environnement. Dans ce sens, le développement des procédés alternatifs permettant d’éviter les solvants toxiques est prometteur.

Pour cela, nous avons développé dans ce travail de thèse deux procédés de formulation en utilisant des solvants non toxiques afin d’encapsuler des protéines thérapeutiques dans des particules polymériques. Parmi les solvants injectables, non volatils et non toxiques, le glycofurol (GF) et le dimethyl isosorbide (DMI) ont été retenus pour la dissolution du polymère. L’acide poly lactique-co-glycolique (PLGA) a été choisi en tant que polymère pour l’encapsulation du fait qu’il soit biodégradable, biocompatible et approuvé par la FDA "Food and Drug Administration". Ayant la capacité d’induire la chondrogenèse, le TGF-β1 a été sélectionné en tant que facteur de croissance pour la régénération du cartilage. Afin d’obtenir un support 3D et de maintenir les cellules et les particules au niveau du tissu lésé, un hydrogel à base d’un dérivé cellulosique silanisé (Si-HPMC : silanized hydroxypropyl methylcellulose) a été utilisé du fait qu’il soit injectable, biodégradable et biocompatible.

3

Ce manuscrit est constitué de deux parties, la première partie bibliographique a pour but de définir l’état de l’art sur le sujet. Nous présenterons tout d’abord les méthodes d’encapsulation des protéines dans des systèmes polymériques particulaires. Cette analyse de la littérature décrit ensuite les solvants utilisés pour la formulation. De plus, nous aborderons les obstacles liés à la stabilité des protéines dans les systèmes polymériques et les stratégies utilisées afin de les surmonter. Enfin, nous décrirons l’utilisation de systèmes particulaires pour l’ingénierie tissulaire du cartilage.

Dans la deuxième partie de ce manuscrit, nous développerons le travail expérimental qui est divisé en 3 chapitres présentés sous forme de 4 articles publiés, soumis ou en préparation.

Dans le premier chapitre, nous décrirons l’encapsulation de protéines dans des nanoparticules de PLGA par une méthode de séparation de phase utilisant le glycofurol en tant que solvant non toxique. Dans un premier temps, une protéine modèle (lysozyme) a été encapsulée dans les nanoparticules afin de valider la faisabilité du procédé. Ensuite, une protéine thérapeutique (TGF-β1) a été incorporée dans les systèmes particulaires préparés. Les nanoparticules obtenues ont été caractérisées sur le plan de leurs caractéristiques physico-chimiques et leur efficacité pour l’encapsulation.

Le deuxième chapitre abordera l’encapsulation de protéines (le lysozyme et le TGF-β1) dans des microparticules de PLGA par un procédé en milieu CO2 basé sur la méthode

d’émulsification/extraction en utilisant le dimethyl isosorbide comme solvant non toxique. Les caractéristiques des microparticules obtenues ont été décrites.

Le dernier chapitre du travail expérimental est consacré au développement d’un biomatériau composé d’un hydrogel injectable contenant des cellules souches et des particules chargées en TGF-β1 en vue de la régénération du cartilage.

Enfin, le manuscrit clôture par une discussion générale permettant de faire une synthèse des résultats obtenus. Cette discussion est suivie par une conclusion générale qui résume les principales avancées et ouvre des perspectives pour la suite de ce travail de recherche.

4

5

II-1.

Encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques particulaires

Les protéines sont des biomolécules indispensables en thérapeutique pour le traitement de nombreuses maladies. La production de ces molécules est devenue de plus en plus courante grâce aux progrès des biotechnologies. Cependant, l’instabilité physique et chimique des protéines limite leur utilisation thérapeutique. Elles sont détruites par le pH gastrique et par les enzymes de l’organisme. De plus, elles ont une demi-vie courte. Il est donc utile d’encapsuler les protéines dans des systèmes polymériques particulaires afin de les protéger, de contrôler leur libération et améliorer ainsi leur efficacité thérapeutique [1, 2]. Dans ce sens, l’encapsulation des facteurs de croissance dans des nanoparticules ou microparticules d’acide poly (lactique-co-glycolique) PLGA est une approche intéressante pour utiliser ces protéines dans le cadre de l’ingénierie tissulaire.

Dans ce travail de thèse, le PLGA a été sélectionné comme polymère afin d’encapsuler ces protéines car il est biocompatible, biodégradable et approuvé par la FDA "Food and Drug Administration". Ce polymère est le plus couramment étudié pour développer des systèmes particulaires à libération contrôlée [3, 4]. Il existe plusieurs types de PLGA selon la masse moléculaire et les pourcentages d’acide lactique (LA) et d’acide glycolique (GA). La modification de ces paramètres peut induire des changements au niveau de leur hydrophobicité, solubilité et profil de dégradation [4-6] (Tableau 1).

Tableau 1. Durée de dégradation de différents types de PLGA commerciaux (Yeo et al. 2004).

Polymère (Medisorb®) LA/GA Viscosité (dL/g) Temps de dégradation (mois)

100 DL 100/0 0.66-0.8 12-18

8515 DL 85/15 0.66-0.8 5-6

7525 DL 75/25 0.66-0.8 4-5

6535 DL 65/35 0.66-0.8 3-4

5050 DL 50/50 0.66-0.8 1-2

Différentes méthodes d’encapsulation de protéines ont été développées. Néanmoins, quel que soit la technique utilisée, plusieurs contraintes doivent être prises en compte lors de l’encapsulation telles que la stabilité des protéines qui sont facilement dénaturées par les solvants organiques, leur adsorption aux interfaces, les forces de cisaillement et la température. De plus, il faut conserver leur activité biologique tout en ayant un rendement d’encapsulation élevé. Les particules obtenues doivent être bien isolées et permettre d’obtenir un profil de libération reproductible. La transposition du procédé à l’échelle industrielle (scale-up) est également importante. D’autre part, la quantité résiduelle du solvant organique

6

doit être inférieure à des valeurs limites imposées par les autorités réglementaires. Dans cette partie bibliographique nous présenterons les méthodes d’encapsulation des protéines les plus souvent utilisées.

II-2.

Méthodes d’encapsulation de protéines dans des systèmes polymériques

particulaires

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour la préparation de nano et microparticules chargées en protéine. Chaque méthode présente des avantages et des inconvénients et influence les propriétés des particules formées. Le choix de la méthode dépendra donc de la nature du polymère, de la protéine à encapsuler et de l’utilisation prévue.

II-2.1.Emulsification-extraction du solvant

Cette méthode consiste à former dans un premier temps une émulsion simple ou double à l’aide de phases organiques et aqueuses non miscibles puis dans un deuxième temps à l’extraction du solvant organique par diffusion et/ou par évaporation. Cette extraction induit la désolvatation et la précipitation du polymère permettant ainsi la formation des particules et l’encapsulation de la protéine présente dans la phase dispersée. Avec cette méthode, plusieurs paramètres influencent l’encapsulation de protéines et les propriétés physicochimiques des particules préparées. Les paramètres les plus critiques sont la structure et les propriétés intrinsèques des protéines, leur concentration, la composition et la masse molaire du polymère, le type de solvant organique utilisé, le ratio protéine/polymère, la concentration et la nature du tensioactif utilisé pour l’étape d’émulsification, la température et la vitesse d’agitation ainsi que la viscosité et le ratio des phases aqueuses et organiques.

II-2.1.1. Emulsion simple

Une émulsion est préparée à partir de deux phases non miscibles : la phase dispersée est composée d’un solvant organique où le polymère est dissout et la protéine est dispersée ou dissoute en présence d’un co-solvant. La phase dispersante est une phase aqueuse contenant le surfactant. La phase organique est émulsionnée sous agitation dans la phase aqueuse pour former une émulsion huile dans eau (H/E). L’élimination du solvant de la phase dispersé se fait par évaporation sous agitation pour les solvants volatils, ou par extraction pour ceux non volatils. Ainsi, le polymère précipite sous forme de particules [7] (Figure 1). L’inconvénient majeur de cette méthode est la déstabilisation des protéines au niveau de l’interface huile/eau ainsi que le faible rendement d’encapsulation du fait de la diffusion de la protéine de la phase

7

organique interne vers la phase aqueuse externe. Pour remédier à cela, la protéine peut être couplée à une molécule amphiphile telle que l’oléate de sodium pour former un complexe hydrophobe ce qui minimise l’adsorption et la diffusion vers la phase aqueuse [8].

Figure 1. Procédé d’encapsulation par évaporation du solvant d’une émulsion simple (Richard et al. 2000).

II-2.1.2. Emulsion double (multiple) II-2.1.2.1.Emulsion eau/huile/eau (E/H/E)

Cette méthode est la plus couramment utilisée car elle est plus adaptée pour l’encapsulation de macromolécules hydrophiles telles que les protéines. De plus, les paramètres de ce procédé sont faciles à contrôler et les instruments utilisés sont peu onéreux. Une solution aqueuse de la protéine est dispersée dans une solution organique de polymère pour former l’émulsion primaire eau dans huile (E/H). Celle-ci est ensuite dispersée dans un grand volume de solution aqueuse contenant un tensioactif ayant les caractéristiques physico-chimiques telles qu’une amphiphilie adaptée (balance hydrophile-hydrophobe (HLB)) et une viscosité suffisante, pour stabiliser thermodynamiquement et cinétiquement une émulsion eau dans huile dans eau (E/H/E). Ensuite, l’élimination du solvant se fait par extraction ou par évaporation, ce qui induit la précipitation du polymère et la formation des particules [9, 10] (Figure 2). L’inconvénient de cette méthode est la déstabilisation des protéines au niveau de l’interface eau/huile, celle-ci étant présente sous forme moléculaire dans la phase aqueuse interne [11].

8

Figure 2. Procédé d’encapsulation par évaporation du solvant d’une émulsion double (Richard et al. 2000).

II-2.1.2.2.Emulsion solide/huile/eau (S/H/E)

La protéine à l’état solide en l’absence d’eau préserve mieux son activité. En effet, en comparaison avec l’état dissout, la mobilité structurale est minimale à l’état solide ce qui augmente la stabilité lors du contact avec un solvant organique [12]. Ainsi, la méthode S/H/E a été développée afin d’empêcher l’adsorption et la dénaturation des protéines au niveau de l’interface eau/huile (E/H). De nombreuses techniques telles que la lyophilisation, la nébulisation-séchage (spray-drying), la nébulisation-séchage à froid (spray freeze-drying) et

9

la précipitation ont été utilisées pour former des particules solides de protéines avant de les encapsuler [11-14]. Les particules de protéines sont ensuite dispersées dans la solution de polymère puis la suspension obtenue est émulsionnée dans un grand volume de solution contenant un tensioactif pour obtenir l’émulsion S/H/E. Des nano ou des microparticules sont ainsi formées après l’élimination du solvant [15].

II-2.2.Séparation de phase (coacervation)

Ce procédé repose sur la désolvatation d’un polymère en milieu aqueux ou organique par l’abaissement de la température, l’addition de non-solvant du polymère ou l’addition d’un polymère incompatible. Deux phases sont ainsi présentes dans le milieu : le coacervat riche en polymère et le surnageant pauvre en polymère. La protéine, à l’état solide ou en solution, dispersée dans un solvant peut être encapsulée si les conditions d’étalement de la phase de coacervat sur la phase dispersée sont favorables [16, 17]. Bien que la méthode de coacervation permette d’obtenir des taux d’encapsulation satisfaisants, des limites comme les taux résiduels de solvants ou les difficultés de transposition à l’échelle industrielle persistent.

II-2.3.Nébulisation-séchage et nébulisation-séchage à froid.

Ce procédé se fait en une seule étape à partir d’une formulation liquide de la protéine qui peut être une solution, une dispersion ou une émulsion avec des matériaux enrobant. La formulation liquide est nébulisée pour former un aérosol avec un flux d’air et une température contrôlée permettant l’évaporation du solvant. L’aérosol est ainsi rapidement séché pour former des microparticules solides encapsulant la protéine; la poudre de microparticules et l’air contenant le solvant vaporisé sont alors séparés [18, 19] (Figure 3). L’avantage de ce procédé est la facilité de contrôler les propriétés des microparticules formées en modifiant les paramètres opératoires ainsi que la possibilité de transposition à l’échelle industrielle (procédé continu). Cependant, son application est encore limitée à cause de la perte de l’activité protéique à haute température. Afin d’éviter l’augmentation de la température, un procédé de nébulisation-séchage à froid a été développé. Dans un premier temps, une solution de protéine est nébulisée dans l’azote liquide puis lyophilisée. Dans un deuxième temps, les particules de protéines sont dispersées dans la solution de polymère afin d’obtenir la suspension solide/huile (S/H). Celle-ci est nébulisée dans un récipient contenant de l’éthanol congelé et superposé à l’azote liquide. Enfin, ce récipient est mis à -80ºC dans le but de faire fondre l’éthanol et d’extraire le solvant. Les microparticules formées sont solidifiées puis séchées au contact d’un flux d’azote à 2-8ºC [20, 21].

10

Figure 3. Procédé d’encapsulation par nébulisation-séchage (Richard et al. 2000).

II-2.4.Atomisation ultrasonique

L’avantage de cette méthode récente est que la production des particules est simple, se fait en une seule étape, de façon continue et aseptique en utilisant un transducteur ultrasonique combiné au flux de non-solvant. Lorsque la solution de polymère passe dans un orifice vibrant, les ondes acoustiques induisent des microgouttelettes uniformes qui restent en contact avec un flux de non-solvant du polymère. La solidification des particules est ainsi induite par l’évaporation de solvant [22] (Figure 4). Il est possible de contrôler la taille des particules en modifiant le diamètre d’orifice, la fréquence de vibration et le taux de flux de la solution de polymère ou de non-solvant. De nombreux procédés d’atomisation ultrasonique ont été développés : le système de Freitas et al. consiste à former une émulsion eau/huile/eau alors que celui de Felder et al. repose sur la formulation d’une émulsion eau/huile [23, 24].

11

II-2.5.Nébulisation électrique

La spectrométrie de masse est une application connue de la nébulisation électrique qui peut produire une phase gazeuse composée des ions proviennent d’une solution de protéines. L’avantage de cette méthode est de pouvoir former des particules monodispersées de différentes tailles [25]. Ce procédé comprend une pompe pour délivrer la formulation liquide avec une aiguille de potentiel électrique élevé et une électrode proche de l’aiguille. En absence de champ électrique, une gouttelette à l’extrémité de l’aiguille s’agrandit jusqu’à ce que sa masse dépasse la tension du liquide à l’interface aiguille-gouttelette. En présence du champ électrique le liquide forme un ménisque conique à l’extrémité de l’aiguille. Le jet induit ainsi des gouttelettes monodispersées et chargées ce qui empêche la coalescence par la répulsion électrostatique. Des protéines peuvent être encapsulées dans des particules polymériques par cette technique [26-28]. Les propriétés des particules formées sont modulables en fonction du voltage, du flux de liquide, de la concentration de polymère et du type de solvant.

II-2.6.Système microfluidique

Cette méthode a été utilisée récemment pour produire des microparticules dont la morphologie interne est constituée de cœurs aqueux. Il existe deux approches pour établir des systèmes microfluidiques. La première utilise des canaux traditionnels avec plusieurs revêtements hydrophiles ou hydrophobes permettant de fonctionnaliser la surface interne des canaux. Des particules polymériques peuvent être formées avec un cœur aqueux et une taille contrôlée en jouant sur l’hydrophobicité et le diamètre des canaux, la séquence de flux de la phase aqueuse ou organique ainsi que sur le taux de flux [29] (Figure 5A). La deuxième approche utilise trois flux. Des microparticules de taille désirée peuvent être obtenues en contrôlant chaque flux [30] (Figure 5B). L’installation de dispositif du système microfluidique est complexe. En revanche, les paramètres de formulation avec ce système sont facilement modulables avec la possibilité de maîtriser la morphologie interne des particules préparées.

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Figure 5. Procédé d’encapsulation par microfluidique (Nisisako et al. 2005, Nie et al. 2005).

II-2.7.Méthodes basées sur la fermeture des pores de particules et sur de gels thermosensibles

Une nouvelle technique consistant à fermer les pores des microparticules a été développée afin d’encapsuler des protéines [31]. Tout d’abord, des microparticules poreuses ont été préparées en solubilisant deux polymères; le PLGA et le PEO-PPO-PEO (poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide)) dans du dichlorométhane. Cette solution est ensuite émulsionnée dans une solution d’alcool polyvinylique (PVA) afin de former des microparticules poreuses par évaporation du solvant. Ces microparticules sont lyophilisées puis immergées dans une solution contenant une protéine telle que la rhGH (recombinant human growth hormone). Enfin, les microparticules chargées en protéines sont lyophilisées puis dispersées dans une solution de l’acétonitrile afin de fermer les pores [31]. Une autre méthode utilisant un gel thermoréversible du PEO-PPO-PEO a été employée afin d’encapsuler des protéines telles que la BSA (bovine serum albumin) dans des microparticules [32]. Une solution du PEO-PPO-PEO d’une concentration supérieure à 20% se transforme en gel quand il atteint une température de 10ºC. Pour préparer des microparticules à l’aide de cette méthode, la protéine est solubilisée dans une solution de 25% du PEO-PPO-PEO à 4ºC. Cette solution est chauffée à 37ºC pour former le gel. Ensuite, une solution de poly lactic acid (PLA) dans de l’acétone est dispersée dans ce gel à 37ºC à l’aide d’un homogénéisateur puis refroidie à 4ºC afin de transformer le gel en solution. L’acétone diffuse vers la phase aqueuse et l’extraction complète se produit en ajoutant une grande quantité d’eau afin de solidifier les microparticules. La protéine est piégée dans des microparticules ce qui permet un rendement d’encapsulation élevé avec une libération contrôlée durant 70 jours [32].

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II-2.8.Méthodes basées sur la technologie des fluides supercritiques

Les fluides supercritiques (FSC) sont des fluides pressurisés possédant des propriétés intermédiaires entre celles d’un gaz et celles d’un liquide, que l’on peut ajuster en faisant varier les conditions de pression et de température (Figure 6). Ils ont une viscosité proche de celle d’un gaz ce qui favorise le transfert de matière. Leur masse volumique est proche de celle d’un liquide ce qui leur confère un certain pouvoir solvant. Le CO2 se place en tête des

fluides supercritiques utilisés dans les procédés de formulation grâce à plusieurs avantages. Il possède une pression critique (Pc = 73 bar) facilement accessible et une température critique

(Tc= 31,3°C) proche de la température ambiante ce qui permet de développer des procédés

pour les principes actifs thermosensibles tels que des protéines. Le CO2 est également inerte

chimiquement, non inflammable, non toxique et non cancérigène ou mutagène. D’autre part, dans les conditions ambiantes de pression et de température, le CO2 se vaporise

instantanément, ce qui facilite son recyclage. De plus, l’utilisation de CO2 supercritique

(CO2SC) dans le domaine de l’encapsulation permet de s’affranchir de la toxicité des solvants

organiques généralement mis en œuvre dans les procédés classiques. Cela permet de développer des produits en conformité avec la législation concernant les solvants résiduels qui devient de plus en plus stricte selon "International Conference on Harmonization" (ICH) [33].

Figure 6. Diagramme de phase d’un corps pur.

De nombreux procédés d’encapsulation à l’aide du CO2SC ont été développés [34, 35]. Ils

sont classés selon le rôle du CO2SC dans le procédé comme solvant, anti-solvant ou soluté.

Dans les paragraphes suivants nous allons présenter les procédés permettant la formulation de particules polymériques.

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II-2.8.1. Les procédés solvants : RESS (Rapid Expansion of a Supercritical Solution)

Le principe consiste en l’atomisation de solutions préparées en conditions supercritiques (Figure 7). Le principe actif et le polymère sont dissouts dans le fluide supercritique et la solution résultante est nébulisée dans un milieu ayant une pression inférieure au point critique. La dépressurisation brutale de la solution supercritique entraine la précipitation des solutés sous formes de particules fines avec une distribution granulométrique étroite. L’avantage de ce procédé est la possibilité de générer des particules en l’absence de tout solvant organique avec une taille contrôlable [36]. En revanche, ce procédé est limité par la solubilité du principe actif et du polymère dans le CO2, ce qui explique pourquoi le procédé RESS est

réalisé à une température assez haute [37]. Pour pallier à cette limite, l’utilisation de co-solvants permet d’augmenter la solubilité du polymère dans le CO2 [38]. Plusieurs procédés

RESS pour la formulation des particules polymériques ont été développés à l’aide d’un co-solvant dans l’objectif d’encapsuler des molécules actives telles que des protéines [39]. Cependant, ces études n’ont pas rapporté de données sur l’activité protéique après encapsulation ou sur la libération à partir de ces systèmes polymériques [40].

Figure 7. Schéma du procédé RESS (Fages et al. 2005).

II-2.8.2. Les procédés anti-solvants

Le CO2 a été utilisé comme anti-solvant pour des solutés peu solubles dans les FSC. Parmi les

procédés utilisés pour cela, nous pouvons citer la technique GAS (Gas Anti-solvent), SAS (Supercritical Anti-solvent), PCA (Precipitation by Compressed Anti-solvent), ASES (Aerosol Solvent Extraction System) ou encore SFEE (Supercritical Fluid Extraction of Emulsions). Ces procédés diffèrent par le moyen de mise en contact de la solution et du fluide pressurisé. A l’exception du procédé GAS, tous les autres procédés impliquent la dispersion de la solution dans le fluide pressurisé.

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II-2.8.2.1.Le procédé GAS (Gas Anti-solvent)

Une solution organique est préparée en solubilisant le principe actif et le polymère dans un solvant avant que le FSC ne soit introduit dans cette solution. Le pouvoir solvant de la solution diminue en augmentant la pression par l’effet anti solvant du FSC ce qui va induire une sursaturation et provoquer la précipitation du polymère pour former les particules (Figure 8). Dans une étude préliminaire en présence d’un co-solvant, l’insuline a été encapsulée dans des nanoparticules de PLA/PEG (polylactic acid/poly ethylene glycol) à l’aide de ce procédé [41].

Figure 8. Schéma du procédé GAS (Mishima 2008).

II-2.8.2.2.Le procédé SAS (Supercritical Anti-solvent)

Un solvant organique est utilisé dans ce procédé pour solubiliser des composés peu solubles dans les FSC. Le principe actif et le polymère sont dissouts dans le solvant. La solution obtenue est dispersée dans la phase continue de FSC. La diffusion du solvant organique vers la phase continue et celle du FSC dans le solvant entraine une sursaturation et donc une précipitation du polymère encapsulant le principe actif. Par exemple, l’insuline a été encapsulée à l’aide d’un co-solvant dans des microparticules de PLA en utilisant ce procédé [42] (Figure 9).

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Figure 9. Schéma du procédé SAS/PCA/ASES (Fages et al. 2005).

II-2.8.2.3.Le procédé PCA (Precipitation by Compressed Anti-solvent)

Contrairement au procédé SAS, le PCA consiste à disperser le solvant organique, contenant le polymère et le principe actif, dans le CO2 qui a été préalablement pressurisé. Les particules se

forment ainsi grâce à la sursaturation immédiate (Figure 9). La taille des particules est homogène et elles sont plus petites que celles obtenues par le SAS. Une étude précédente a démontré la possibilité d’encapsuler une protéine (le lysozyme) dispersée dans la phase organique dans des particules de PLGA et PLA à l’aide de ce procédé [43].

II-2.8.2.4.Le procédé ASES (Aerosol Solvent Extraction System)

Le principe est d’injecter la phase organique, contenant le polymère et le principe actif, sous forme de gouttelettes d’une manière uniforme dans la phase anti-solvant (CO2SC) en utilisant

une buse. Ceci entraine une sursaturation locale et une précipitation brutale du polymère tout en encapsulant le principe actif (Figure 9). Ce procédé a été appliqué à l’encapsulation de protéines telles que le lysozyme et l’albumine dans des nanoparticules et microparticules de PLA [44, 45].

II-2.8.2.5.Le procédé SFEE (Supercritical Fluid Extraction of Emulsions)

Le principe de SFEE est le même que celui de SAS, la seule différence est que le CO2 dans ce

procédé est utilisé comme anti-solvant pour extraire les solvants organiques. Le SFEE permet d’obtenir des nano et microparticules en suspension dans une phase aqueuse ce qui nécessite une étape supplémentaire de lyophilisation. Ce procédé a été utilisé pour l’encapsulation de protéines [46-48].

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II-2.8.3. Les procédés où le CO2 est utilisé comme soluté : PGSS (Particles from Gas

Saturated Solution)

La solubilité du CO2 pressurisé dans une grande quantité de liquide est mise à profit dans le

procédé PGSS. Le CO2 pressurisé est tout d’abord dissout dans un premier autoclave dans un

liquide qui peut être une solution, une suspension ou un polymère fondu. Ce mélange saturé en gaz est ensuite envoyé dans une chambre d’expansion au travers d’une buse (Figure 10). Les particules se forment en raison de la détente et sont ainsi récupérées dans l’autoclave d’expansion. Ce procédé a été développé pour des polymères qui sont généralement très peu solubles dans le CO2 mais dans lesquels de grandes quantités de CO2 peuvent être dissoutes,

ce qui abaisse la température de transition vitreuse et de fusion et augmente ainsi le gonflement et la plastification du polymère. Des protéines telles que l’insuline et le lysozyme ont été encapsulées avec succès dans des particules de PLA et de PLGA par PGSS [49, 50].

Figure 10. Schéma du procédé PGSS (Fages et al. 2005).

En conclusion, plusieurs méthodes d’encapsulation des protéines ont été employées. Bien que chaque méthode possède ses avantages et ses inconvénients, il en ressort que l’utilisation des solvants volatils et toxiques est rarement évitée. C’est pourquoi, il est primordial de développer des méthodes d’encapsulation dites « vertes », en s’affranchissant de ces solvants. Dans cette optique, nous travaillerons tout au long de cette thèse avec la méthode de séparation de phase ainsi que la méthode d’émulsification/extraction en milieu CO2 pressurisé

(modified-PGSS) afin d’encapsuler le facteur de croissance TGF-β1 dans des nanoparticules et microparticules de PLGA en utilisant des solvants non volatils et non toxiques.

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II-3.

Les solvants organiques utilisés pour préparer des systèmes polymériques

particulaires

Un des objectifs de ce travail de thèse est de préparer des systèmes polymériques particulaires à l’aide du polymère de la famille de l’acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA) par des procédés dits verts en utilisant des solvants non toxiques. Ces procédés répondent aux contraintes imposées par les autorités réglementaires afin de préserver l’environnement et d’améliorer la sécurité du produit fini. Nous présenterons une étude bibliographique sur la toxicité des solvants organiques couramment utilisés dans des procédés classiques de formulation. De plus, des données sur des solvants d’intérêt non toxiques seront présentées.

II-3.1.Solvants organiques toxiques

De nombreux solvants organiques capables de solubiliser les polymères ont été décrits dans la littérature, parmi lesquels nous pouvons citer les solvants volatils qui possèdent une toxicité potentielle pour l’homme et l’environnement. Ces solvants sont les plus souvent utilisés dans les procédés de formulation tels que le dichlorométhane [51, 52], l’acétone [53, 54], l’acétonitrile, l’acétate d’éthyle [55, 56] et le tétrahydrofurane [4].

Le dichlorométhane, composé halogéné volatil, est classée par le CIRC (Centre International de Recherches sur le Cancer) comme un cancérigène. Il provoque des risques d’intoxication aiguë ou chronique par inhalation [57]. L’acétone est un composé peu toxique, inflammable et volatil. Il peut entrainer une intoxication aiguë locale, neurologique, digestive et rénale par inhalation ou ingestion. Un contact cutané peut provoquer des irritations voire même de légers œdèmes [58]. L’acétonitrile est un produit toxique, volatil et facilement inflammable. Il peut pénétrer par voie cutanée, orale ou par inhalation dans l’organisme qui le métabolise en acide cyanhydrique et thiocyanate [59]. L’acétate d’éthyle est un produit peu toxique à faible concentration. Il induit un effet irritant sur les muqueuses nasales, pharyngolaryngées et oculaires après inhalation et des dermatoses irritatives après application cutanée [60]. Le tétrahydrofurane est un composé toxique, volatil et narcotique. Il a un effet irritant local et un effet dépresseur sur le système nerveux central quel que soit la voie d’exposition [61]. La Pharmacopée Européenne définit les solvants pour lesquels la quantité de résidu peut être dangereuse pour une application pharmaceutique. Ces solvants sont classés dans la 2ème classe (solvants à limiter) ou dans la 3ème classe (solvants peu toxiques) (Tableau 2).

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Tableau 2. Classification des solvants organiques d’après la Pharmacopée Européenne (2005).

Solvant Classe PDE*(mg/jour) Limite de concentration (ppm)

Dichlorométhane 2 6 600

Acétonitrile 2 4,1 410

Acétone 3 50 5000

Acétate d’éthyle 3 50 5000

Tétrahydrofurane 3 50 5000

* PDE : permitted daily exposure

II-3.2.Solvants organiques non toxiques

Afin d’éviter les solvants toxiques dans les procédés de formulation, d’autres solvants sont intéressants à étudier tels que le glycofurol (GF), le dimethyl isosorbide (DMI), le dimethyl sulfoxide (DMSO) et la N-methyl 2-pyrrolidone (NMP). Ce sont des solvants non volatils miscibles à l’eau mais qui sont à l’heure actuelle encore peu étudiés pour la formulation des particules de PLGA. Leur toxicité n’a donc pas encore été standardisée dans la Pharmacopée Européenne. Cependant, quelques études de toxicité ont été menées dans la littérature sur ces solvants. Parmi ces études, nous pouvons notamment évoquer une étude portant sur l’activité hémolytique et l’angiotoxicité au cours de laquelle plusieurs solvants organiques sont injectés dans l’aorte sous-rénale de moutons mâles adultes. Les paramètres hémodynamiques ont été ensuite estimés en mesurant la pression artérielle et veineuse ainsi que la fréquence cardiaque. D’après cette étude, le DMSO et la NMP présentaient un impact hypotenseur respectivement modéré et notable contrairement au GF et au DMI qui ne présentaient aucune toxicité [62]. Dans une autre étude, des solvants organiques ont été mélangés avec du sang humain à différents ratios afin d’observer par la suite leur influence sur l’activité hémolytique. Le résultat a démontré que pour un mélange 10:90 (solvant : sang), le DMI ne provoquait pas d’hémolyse et le GF possédait un effet hémolytique modéré tandis que le DMSO et la NMP sont apparu comme étant des solvants significativement hémolytiques [63]. D’autres études comparatives ont confirmé que le GF et le DMI sont les solvants les moins toxiques parmi tous les solvants organiques testés [64, 65]. Un récapitulatif des données menées sur ces solvants est présenté dans le Tableau 3. A partir de ces données de toxicité, le DMI et le GF semblaient être les solvants injectables les plus intéressants pour la formulation des systèmes polymériques particulaires. Ainsi, nous avons effectué une étude bibliographique sur les propriétés physicochimiques de ces deux solvants.

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Tableau 3. Données comparatives sur la toxicité des solvants non-standardisée dans la Pharmacopée

Européenne. Solvants injectables DL50* (ml/kg) [64] Activité hémolytique **[63] Toxicité cardiovasculaire [62] Réduction de la pression artérielle [62] Angiotoxicité/Temps de vasospasme (min) [65] DMSO 6,9 (iv./m) 12,6 (ip./m) 15 (po./m)

Très forte Modérée Modérée 19,1

NMP 4,4 (ip./m) Modérée Notable Notable 5

GF 3,5 (iv./m) Modérée Négligeable Absent 10,5

DMI 8,54 (iv./r) Faible Négligeable Absent 5,9

*DL50 : dose létale médian ; iv : voie intraveineuse, ip : voie intrapéritonéale, po : voie orale, m et r : chez la souris et chez le rat. **L’étude est effectuée par voie intraveineuse et intra-artériel

II-3.2.1. Glycofurol

Le glycofurol (GF) est un liquide limpide, incolore et presque inodore. C’est un solvant organique non volatil, soluble dans l’eau, et à usage parentéral par voie intraveineuse ou intramusculaire jusqu’à une concentration de 50% (v/v) [66]. Il est utilisé dans de nombreuses formulations pharmaceutiques en tant que co-solvant [67, 68], mais également en tant qu’adjuvant de vaccination [69], et solvant pour les implants polymériques injectables [70-72]. Il a été montré que la co-administration du glycofurol améliore l’absorption de certains peptides tels que l’insuline et le peptide T [73]. En outre, il a récemment été décrit comme solvant du PLGA dans la formulation de microparticules et nanoparticules [74-77].

II-3.2.2. Dimethyl isosorbide (isosorbide dimethyl ether)

Le dimethyl isosorbide (DMI) est un liquide limpide, incolore, non inflammable, non volatil et très soluble dans l’eau (1.103 g.L-1 à 25°C). Il est utilisé en tant que solvant de nombreuses substances actives et huiles cosmétiques [78], mais également comme co-solvant pour augmenter la solubilité des composants ayant une faible solubilité dans l’eau tels que les stéroïdes [79]. Puisque le DMI n’est pas irritant pour la peau, les yeux et les oreilles, il est utilisé en formulation cosmétique afin d’améliorer la pénétration de certains ingrédients cosmétiques [80, 81]. En outre, il est décrit pour les applications pharmaceutiques [82], et en tant que solvant pour solubiliser des biomatériaux emboliques [62, 65, 83]. Ce solvant est injectable par voie intraveineuse ou intra-artérielle et il est utilisé pour des formulations contenant des composants peu solubles dans l’eau [63]. Un récapitulatif des propriétés physicochimiques du glycofurol et du dimethyl isosorbide est présenté dans l’annexe 1.

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En conclusion de cette recherche bibliographique, il nous semble que le DMI et le GF sont les solvants organiques les moins toxiques d’après les études de la littérature et les données de toxicité. Pour cela, nous utiliserons ces solvants dans ce travail de thèse afin de dissoudre le polymère (PLGA) dans les procédés de formulation des systèmes particulaires en vue de l’encapsulation du facteur de croissance (TGF-β1).

II-4.

Instabilité des protéines dans des systèmes polymériques particulaires

Les nano et microparticules de PLGA ont largement été utilisées en tant que systèmes polymériques particulaires à libération contrôlée dans le but d’administrer des protéines. Cependant, les protéines sont des molécules fragiles et peuvent subir une dénaturation physique (Figure 11) ou une dégradation chimique (Figure 12) durant la formulation, la libération et le stockage de ces systèmes [84, 85]. Ainsi, la conservation de la stabilité des protéines dans des nano et microparticules de PLGA reste un défi majeur. Dans cette partie bibliographique, les facteurs influençant la stabilité des protéines au sein de ces systèmes sont présentés.

Figure 11. Dénaturation physique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires (Taluja et al.

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Figure 12. Dégradation chimique de protéines dans des systèmes polymériques particulaires (Taluja et al. 2007).

II-4.1.Instabilité des protéines durant la formulation

La présence de l’interface eau/huile dans la méthode d’émulsion huile/eau (H/E) ou eau/huile/eau (E/H/E) entraîne la déstabilisation de la protéine. Etant dissoute dans la phase aqueuse, la protéine est plus flexible mais aussi plus réactive et pourrait s’adsorber et s’agréger à l’interface eau/huile du fait de sa nature amphiphile [86, 87]. La protéine pourrait également être dénaturée à cause de la force de cisaillement exercée lors de la préparation de l’émulsion initiale eau/huile (E/H) [88]. La sonication utilisée lors de certains procédés d’émulsification pourrait provoquer la dénaturation de la protéine du fait de l’extrême température pouvant survenir localement [89]. De plus, les interactions hydrophobes entre le polymère (PLGA) et la protéine durant la formulation posent un problème de stabilité car la protéine est capable de s’adsorber sur le polymère et pourrait se dénaturer [90, 91]. En outre, le pH, la force ionique et la polarité du solvant jouent un rôle important sur l’adsorption de la protéine. Un pH proche du point isoélectrique (Pi) favorise ce phénomène à cause de la

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neutralité de la protéine [92]. L’augmentation de la force ionique et l’utilisation des solvants plus polaires induisent également plus d’adsorption [92]. Dans une étude, l’acétate d’éthyle, étant moins polaire que le dichlorométhane, provoque moins d’interactions avec le polymère ce qui fait de lui un solvant plus intéressant pour les procédés de formulation en terme de stabilité des protéines [93, 94].

II-4.2.Instabilité des protéines durant le stockage

L’instabilité des protéines dans des nano et microparticules de PLGA durant le stockage est mineure en comparaison avec l’instabilité survenant lors de la formulation ou de la libération. Cependant, l’humidité résiduelle dans ces systèmes pendant le stockage est critique du fait qu’elle favorise l’hydrolyse de PLGA entraînant des acides lactique et glycolique, ce qui abaisse le pH et ainsi déstabilise la protéine. Cela a été confirmé par une étude de stabilité accélérée réalisée sur des microparticules de PLGA chargées en insuline pendant 1 mois à 40˚C et à 75% d’humidité relative [95]. De plus, l’humidité résiduelle dans ces systèmes particulaires induit l’agrégation de la protéine par dimérisation covalente durant le stockage entraînant une libération incomplète. Une étude a démontré que la libération de la BSA augmente trois fois plus quand l’humidité résiduelle est réduite de 9.8% à 1.2% [96].

II-4.3.Instabilité des protéines durant la libération

La libération de la protéine à partir de systèmes polymériques de PLGA dans des conditions physiologiques est souvent caractérisée par une libération précoce (burst effect) suivie par une libération lente et incomplète (Figure 13). De nombreux mécanismes tels que l’agrégation covalente ou non covalente, l’hydrolyse et l’adsorption non-spécifique sont responsables de l’instabilité de la protéine dans les particules de PLGA durant la libération. En effet, l’humidité captée par le polymère pendant l’incubation dans le milieu de libération augmente la mobilité et la flexibilité de la protéine ce qui facilite son agrégation dans la matrice polymérique et entraîne une libération incomplète [97]. L’humidité résiduelle dépend de la nature du polymère (ratio des acides lactique/glycolique, masse molaire…) et des excipients ajoutés dans la matrice polymérique (PEG, surfactants, sels...). En outre, l’instabilité de la protéine pourrait résulter de l’acidification dans ces systèmes polymériques due aux produits de dégradation de PLGA (acides lactique et glycolique) pendant l’incubation. Cela contribuerait à l’agrégation et à la dégradation chimique par acylation ou désamination entraînant une libération incomplète de la protéine [54, 98,99]. Cependant, l’acidification au sein des particules dégradées dépend de nombreux paramètres tels que le type de polymère, la

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durée d’incubation, la taille et la porosité des particules de PLGA, les excipients ajoutés…. D’autre part, l’adsorption de protéines sur le polymère due aux interactions hydrophobes joue aussi un rôle important vis-à-vis de la libération incomplète [100, 101]. De plus, la présence des groupements carboxyliques au niveau des extrémités des chaînes de polymère (uncapped PLGA) augmente les interactions électrostatiques avec certaines protéines et ainsi diminue le taux de libération [91, 102].

Figure 13. Profil de libération de protéine à partir de microparticules de PLGA (50:50) et mécanismes de

libération incomplète (Giteau et al. 2008).

En conclusion, de nombreux facteurs sont impliqués dans l’instabilité des protéines au sein des systèmes particulaires polymériques. Un des défis majeur à l’heure actuelle est donc d’obtenir un système optimal permettant une libération contrôlée tout en préservant la stabilité de la protéine. Un récapitulatif des causes liées à l’instabilité des protéines dans ces systèmes est présenté dans le Tableau 4.

Tableau 4. Causes d’instabilité des protéines dans des systèmes particulaires de PLGA. Etape Causes possibles de dégradation protéique

Formulation Adsorption à l’interface eau/huile, cisaillement, solvants organiques, interactions avec le PLGA

Stockage Humidité résiduelle

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II-5.

Stratégies d’amélioration de la stabilité des protéines dans des systèmes

polymériques particulaires

Le premier défi à relever pour l’administration de protéines à l’aide de nano et microparticules de PLGA est celui de la stabilité afin que ces biomolécules soient libérées à partir de ces systèmes sous leur forme native avec une activité optimale. Il est donc indispensable de conserver intacte la structure de la protéine à la fois pendant la formulation et le stockage mais également lors de la libération. Diverses stratégies ont été envisagées afin d’optimiser la stabilité des protéines dans ces systèmes polymériques. Nous présenterons dans cette partie bibliographique une vue globale de ces stratégies.

II-5.1.Stratégies d’amélioration de la stabilité pendant la formulation II-5.1.1. Pegylation des protéines

La modification chimique de la protéine par pegylation (ajout d’une liaison covalente permettant la conjugaison du PEG (polyéthylène glycol)) représente une stratégie prometteuse, car elle pourrait favoriser la stabilité physique de la protéine pendant la formulation et empêcher les interactions protéine-PLGA et protéine-interface. Plusieurs protéines liées au PEG ont été utilisées dans des systèmes polymériques. Par exemple, le lysozyme a été lié au méthoxy polyéthylène glycol (mPEG) ce qui préserve son activité et améliore sa stabilité contre le solvant organique et contre la force de cisaillement mais aussi diminue son adsorption au sein des particules de PLGA [103]. Dans une étude préliminaire, il a été démontré que l’interferon-α (INF-α) lié au PEG présentait moins d’agrégation que la protéine native en utilisant du dichlorométhane comme solvant [104]. Cette stratégie permet également de solubiliser la protéine liée au PEG dans le solvant organique avec le polymère et facilite ainsi l’encapsulation par la méthode d’émulsion simple (huile/eau) tout en préservant la stabilité avec un bon rendement d’encapsulation [105].

II-5.1.2. Complexation des protéines avec des polyélyctrolytes (ion-pairing)

Les protéines sont des molécules chargées ce qui facilite leur réaction avec des polyélectrolytes de charges opposées. Cette stratégie permettrait de rendre la protéine plus résistante aux facteurs d’instabilité pendant la formulation et minimiserait son adsorption à l’interface eau/huile ainsi que les interactions hydrophobes avec le polymère. Une étude préliminaire a pu démontrer que la complexation de l’insuline avec l’acide polyméthacrylique (PMAA) augmentait la stabilité de la protéine pendant la formulation et ainsi le rendement

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d’encapsulation [106]. Dans une autre étude, la BSA a été complexée avec le PEG-polyhistidine de charge positive afin de favoriser la stabilité de la protéine pendant l’encapsulation. Le groupement poly(L-hisitidine) peut se lier à la surface de la BSA par des interactions ioniques et le groupement PEG induit l’interférence stérique [107]. De plus, il a été démontré que la complexation ionique du lysozyme de charge positive avec le sulfate de chondroïtine de charge négative améliore le rendement d’encapsulation par la méthode d’émulsion eau/huile/eau en diminuant l’agrégation de la protéine pendant la formulation [108]. Cette stratégie aide également à modifier la solubilité de la protéine qui devient plus soluble dans la phase organique que dans la phase aqueuse. Cela permet l’encapsulation de la protéine par la méthode d’émulsion simple (huile/eau) où la protéine et le polymère sont solubilisés dans le solvant organique tout en préservant la stabilité de certaines protéines avec un rendement d’encapsulation élevé [109-111].

II-5.1.3. Encapsulation de la protéine à l’état solide

Il est bien connu que les protéines à l’état solide sont plus stables qu’à l’état dissout dans une solution aqueuse. A l’état solide, la mobilité structurale de la protéine est limitée ce qui augmente la stabilité et préserve l’activité. Pour cela, des méthodes d’encapsulation, telles que l’émulsion solide/huile/eau (S/H/E) [11] et solide/huile/huile (S/H/H) [17], ont été développées pour stabiliser les protéines et éviter l’adsorption sur l’interface eau/huile. Cependant, l’ajout d’excipients protecteurs tels que les cyclodextrines est nécessaire afin de maintenir l’activité de certaines protéines telles que la chymotrypsine [112].

II-5.1.4. Ajout d’additifs pendant la formulation

D’après la littérature, il s’avère que cette stratégie est une des plus souvent utilisée. De nombreux additifs sont ajoutés pendant la formulation afin de stabiliser certaines protéines. Parmi ces additifs nous pouvons citer les sucres, les protéines, les tensioactifs, les polymères, les acides aminés et les alcools.

II-5.1.4.1.Les sucres

Souvent, des sucres sont ajoutés dans la phase aqueuse interne lors de l’encapsulation par la méthode d’émulsion eau/huile/eau afin de protéger la protéine grâce à l’hydratation préférentielle. Le tréhalose et le mannitol diminuent les agrégations des protéines telles que l’interferon-γ (INF-γ) et la rhGH après l’émulsification et ultrasonication [13]. En revanche, ces sucres n’ont que peu ou pas d’effet sur l’IGF-1 (insulin like-growth factor 1) [113]. Dans

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une autre étude, il a été démontré que le lactose et le lactulose favorisent la stabilité structurale et l’activité du lysozyme tandis que le tréhalose, le mannitol et le sucrose n’ont aucun effet sur cette protéine [114, 115]. Les cyclodextrines ont également été utilisées pour stabiliser certaines protéines pendant la formulation, ces oligosaccharides cycliques ont une zone hydrophile à la périphérie de leur structure et une cavité hydrophobe. Les interactions entre les acides aminées aromatiques de certaines protéines et la cavité hydrophobe des cyclodextrines sont probablement responsables de la stabilisation structurale de la protéine. Dans une étude, des cyclodextrines ont été rajouté dans la phase aqueuse interne par la méthode d’émulsion eau/huile/eau ce qui a minimisé les agrégations de l’EPO (érythropoïétine) pendant la formulation [88]. En revanche, les cyclodextrines n’ont démontré aucun effet sur la stabilité de l’IGF-1 [113].

II-5.1.4.2.Les tensioactifs

Les tensioactifs sont des molécules amphiphiles et ont tendance à diminuer la tension superficielle de la solution de protéines et ainsi empêchent par mécanisme souvent compétitif, l’adsorption et l’agrégation sur les surfaces hydrophobes. L’utilisation des tensioactifs non-ioniques est préférable à celle des tensioactifs non-ioniques qui eux pourraient se lier aux différents groupements protéiques provoquant ainsi la dénaturation des protéines. Dans une étude d’encapsulation de l’insuline par la méthode d’émulsion eau/huile/eau, des tensioactifs présentant des balances hydrophile-lipophile (HLB) différentes ont été co-encapsulés. Parmi ces tensioactifs, seul le polysorbate 20 a été capable de favoriser la stabilité de la protéine dans les particules de PLGA [116]. Au cours d’une autre étude, le polysorbate 20 et le polysorbate 80 n’ont pas été capables de stabiliser le lysozyme [87]. Le poloxamer 407, quant à lui, a été utilisé avec succès pour encapsuler l’uréase dans des particules de PLGA; la protéine a été protégée pendant la formulation par la structure gélifiée des chaînes hydrophiles du poloxamer [94]. De plus, il a été démontré que la phosphatidyle choline a été capable de stabiliser l’interleukin-1-α pendant l’encapsulation [117].

II-5.1.4.3.Les protéines

Les additifs protéiques tels que les albumines et la gélatine ont été utilisés dans plusieurs études de formulation afin de favoriser la stabilisation des protéines. Ces additifs occupent l’interface eau/huile et protègent ainsi les protéines du contact avec les solvants organiques et les surfaces hydrophobes. Par exemple, la présence de la BSA dans la phase interne de la méthode d’émulsion eau/huile/eau permet de préserver 80% de l’intégrité de l’IGF-1 [113].