U N I V E R S I T É D E L I È G E F A C U L T É D E M É D E C I N E
Effets métaboliques de radioprotecteurs soufrés chez ranimai
Potentiel d'oxydo-réduction, glycogénolyse et gluconéogenèse
Thèse de doctorat en sciences biomédicales expérimentales
présentée par Claire DUYCKAERTS
Année Académique 1971-1972
Qu'il me soit permis, au terme de oe travail* d'adresser mes plue vifs remerciements à :
Monsieur le Professeur C. Liébecq â <jui je dois l'essentiel de na for- mation scientifique. Je lui suis très reconnaissante de m'avoir constamment guidé» et orientée par de nombreux et judicieux conseils et de m'avoir encou- ragée tout au long de ce travail. Qu'il veuille bien trouver ici l'expres-
sion de ma plue profonde gratitude,
Sir H.A. Krebs qui a eu l'amabilité de m'accueillir done son laboratoi- re. Je lui adresse mes tris sincères remerciements pour ses précieux con- seils. Je tiens également à remercier ses collaborateurs D.H. Williamson et R. Heme qui m'ont initiée à de nouvelles techniques et m'ont permis* grâce
à de nombreuses discussions, d'aborder l'étude du métabolisme hépatique.
Monsieur le Professeur E. Betz, Doyen de la Faculté de Médecine, ainsi qu'au Docteur M,L. Beavmariage grâce auxquels les irradiations ont pu être effectuées. Je les en remercie vivement,
btonaieur le Professeur J. Lecomte qui m'a apporté l'aide précieuse de eon expérience pour l'interprétation et la rédaction de la partie physiologi- que de ce travail,
Monsieur E. Dethigr pour sa très précieuse collaboration technique. Je tiene à lui témoigner ma très vive reconnaissance ainsi qu 'd tous ceux et celles qui m'ont aidée au moment de la préparation ds cntte thèse.
Enfin, j« remercie vivement le Fonds de la Recherche Scientifique Médicale peur l'appui financier qu'il m'a accordé.
SOMMAIRE
Liste des abréviations et symboles I
Produits utilisés III
Enzymes IV 1. Introduction 1
2. Potentiel d'oxyde réduction dans le sang de rats et de souris inject6B
de radioprotocteurs 19 Table des matières 20
Introduction 22 Matériel et méthodes 32
Résultats hl Discussion et conclusions kè
3» Rôle des catecholamines dans l'hypoxie, l'hyperlactacidémie et l'hyper-
glycémie provoquées par 1 'injection de cystamine 52
Table des matières 53
Introduction 5l«
Matériel et méthodes 62
Résultats 63 Discussion et conclusions . 65
k. Influence de la cystamine sur le métabolisme hépatique et musculaire ... 68 Table des matières ,.,,,... 69
Introduction ?î Matériel et méthodes 83
. Résultats *..*.. 93 ;
Discussion et conclusions ,...„...,.>,»... 102 ., 5. Rôle de l'hypoxie dans l'effet protecteur de la cystamine ...,,,,,.« 111.
Introduction . , 1 1 2 Matériel et méthodes ...•...•..•»•••••»•»» 1^3 :
Résultats et discussion ....•.•.••••.•••••.•»•..«».•••••.•••••••••.•••>•* ^ 4 6, Conclusions générales ...,.,, 116
?. Bibliographie 123
- I "
LISTE DE5 ABREVIATIONS ET SYMBOLES
A adrénaline ; 1-(3,l+-âihydroxyphényl)-2-mêtbylaBsinoéthanol ADP adenosine 5'-diphosphate
Ado, 3':5'> P adenylate cyclique
AET S-(2-aminoêthyl)isothiourêe AMP adenosine 5'-monophosphate
ATP adenosine 5'-triphosphate CoA coenzyme A
CSH cystêanine ou 2-mercaptoéthylaaine (HiU-CHg-CHg-SH) CSSC cystaminé (NHg-CHg-Cr^-S-S-CHg-CHg-HHg)
Cys cysteine
DCI dichloroisoprotérênol ; 1-(3,fc-dichlorophênyl)-2-isopropylami- noéthanol
£. potentiel d'oxydo-reduction
E potentiel d'oxydo-réduction à 50 % de réduction in
E „ potentiel d'oxydo-réduction â 50 % de réduction et à pH 7 mT
EDTA acide éthylènediatainetétraacétique F constante de Faraday = 96 500 coulombs PAD flavins-adenine dinucléotide
GED guaaidinoéthyle disulfure
GSH, GSSG glutathion réduit, glutathion oxydé
H 29/50 l-(-V-méthylphén;-2.)-2-isopropylaBiinoéthanol H 35/25 l-(U'-mêthylphênyl)-2-i3opi\>pylaminopTqpsnol
I isoproterenol ; 1-(3,^-dihydroxyphényl)-2-isopiropylaminoéthanol ICI l*-(2-hydroxy-3-isopropylaainopropoxy)acëtanilide K constante d ' é q u i l i b r e
K constante de Michaélis
MEG mercaptoëthylguanidine
MJ 1999 1-(it-mésylamiuophënyl)-2-isopropylaainoêthanol R noradrenaline ; ?-(3,1t-dihydroxyphényl)-2-aiBinoéthanol RAD nicotinamide-adenine dinucléotide
MADH, NAD nicotinamide-adenine dinucléotide réduit, oxydé NADP nicotinamide-adênine dinucléotide phosphate
-II-
NADPH, NADP nicotinamide-adenine dinuclfrotide phosphate réduit, oxyde R roentgen
F constante de<s gas p a r f a i t s = 9,31!» 3 * œol~ x degré T température absolue
T r i s tris(hydroxynœthyl)eninoaiéth6ce
- I I I -
PRODUITS UTILISES
ADP AMP ATP
esse
Cys
DC I
o-Dianisidine Ergotamine Florisil Hydrazine Isoproterenol MJ 1999
NAD(P) P Nembutal Horite
Phenoxybenz amine Propanolol Rêserpine Serumalbumine
Substrats e t enzyaes Valinomycine
Boehringer Mamhei*
Pluka
hoeta-uigev !-iz>i
di chlorhydrate de cystasine ; labaz, Lot n° 1591 chlorhydrate de cysteine ; Merck
l-Oj^-àichloropfcénylî^-isopropylaminoethanol ; Eli Lilly 3,3'-dimethcxybenzidine ; Schuchardt
t a r t r a t e d'ergotaai.ne ; Merck
s i l i c a t e de Bagnés.iîss ; Koch-Light hydrate d'hydrazine ; BD3
Isuprel ; Laboratoires Vinthrop
1-(U-mésylafflinophényl)-2-isopropylaoinoéthanol ; Mead Johnson Co.
Boehringer Marnihevs
pentobarhital sodique ; Abbott
charbon activé ; Pfamiiehl Chemical Co.
Dibenzyline * ; i?-C2-chioroéthyl)~ff-(l-Biêthyl-2-phlnoxy- êthyl )benzy lésine ; Srrith, Kline é French Labs
•a
Inderal ; l-(isopropylaisino)-3~(1-naphtyloxy)-2-prop»- nol . ; Iirperial Chemical Industries
•a
Serpasil ; 3»^5-^risetfaoxybenzoyl methyl réserpate Ï Ciba
de boeuf, fraction V ; Sutritional Biochemical Co.
Boehringer Mannheim Calbioàhem
Bous remercions la firme Meee qui nous a procuré gracieusement le DCI, le MJ 1999 et la phénoxybenzamine ainsi qne la fime Pharma Union qvi noua a four- ni le propanolol. La cystanine nous a été fournie gracieuseaent par le Docteur F. Binon, directeur des laboratoires de recherches de la S.A. Labaz.
- I V -
ENZWES
A l d o l a s e EC i . 1 . 2 . 7 C i t r a t e - l y a s e EC *4.1.3.6 C i t r a t e s y n t h a s e EC ^ . 1 . 3 - T
Snolase . EC 1 J . 2 . 1 . 1!
Fructose~1,6-bisphospho.tase EC 3 . 1 . 3 - 1 1
Glucose oxydase EC 1.1.3-1»
G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t a s e EC 3 - 1 . 3 . 9 Glucose-6-phosphate déshydrogénase EC 1 . 1 . 1 . U9 Glutamate déshydrogénase EC 1.*».1.3 G l u t a m a t e - o x a l o a c ê t a t e t r a n s a m i n a s e EC 2 . 6 . 1 . 1 G l y c e r o l k i n a s e EC 2 . 7 . 1 . 3 0 G l y c e r o l - 1 - p h o s p h a t e déshydrogénase EC 1 . 1 . 1 . 8 Hexokinase EC 2 . 7 . 1 . 1 3-Bydroxybutyrate déshydrogénase EC 1 . 1 . 1 . 3 0 L a c t a t e déshydrogénase EC 1 . 1 . 1 . 2 7 Malate déshydrogénase EC 1.1.1.37 2 - O x o g l u t a r a t e déshydrogénase EC 1.2.U.2 Peroxydase EC 1.11.1.7 Phospho^nolpyruvate carboxykinase EC U . 1 . I . 3 2 Pkosphofructokinase EC 2 . 7 . 1 - 1 1 Fhosphoglucose isomérase EC 5 . 3 - 1 - 9 P h o s p h o g l y c e r a t e nrutase BC 2 . 7 - 5 . 3 Phosphorylase EC 2 . ^ . 1.1 Phosphorylase k i n a s e ôC 2 . 7 . 1 , 3 8 Fhoaphorylase p h o s p h a t a s e EC 3-1*3*17
P r o t é i n e k i n a s e EC2.7«««37 P y r u v a t e c a r b o x y l a s e EC 6.1». 1.1
P y r u v a t e déshydrogénase EC 1.2.**. 1 Pyruvate k i n a s e EC 2,7*1.1*0 S y n t h e t a s e du glycogène EC 2 J u l . 11 T r i o s e p h o s p b a t e i s o r a ê r a s e EC 5 . 3 * 1 . 1
C h a p i t r e 1
INTRODUCTION
- 2 -
TABLE DES mTIÊRES
1.1 Effet protecteur des t h i o l s e t disulfures chez l e r a t et l a souris . . . . h
1.2 Mécanismes radioprotecteurs des t h i o l s et disulfures 5 1.2.1 Protection par mécanismes ra/iiochissiques 5
1.2.1.1 Piégeage des radicaux l i b r e s e t de l ' é l e c t r o n aqueux . . 5
1.2.1.2 Réparation instantanée par t r a n s f e r t d'hydrogène 6 1.2.1.3 A l t é r a t i o n de l a r a d i o s e n s i b i l i t é intrinsèque 7
1.2.2 Protection par mécanismes biochimiques 8 1.2.2.1 Libération d'agents protecteurs endogènes 10
1.2.2.2 Augmentation de l a r a d i o r e s i s t a n t c e l l u l a i r e . . . 11
1.2.2.3 Augmentation des réparations 12
1.2.3 Protection par hypoxie 13 1.2.3-1 Consommation d'oxygène par l e protecteur lk
1.2.3.2 Anoxie par action pbannacologique 1U 1.2.3.2.1 Effets pharnacologiques t'.ea r a d i o p r o t e c t e u r s
soufrés U 1.2.3«2.2 Effets des protecteurs soufrés sur la pres-
sion partielle d'oxygène 16
î.3 Buts du travail 17
- 3 -
Les premiere e s s a i s de radioprotection remontent à 19^9» année de l a découverte de l ' e f f e t radioprotecteur du cyanure (Hervé et Bacq, 19^9) et de la cysteine (Patt et al.t 19^9). Depuis l o r s , l a recherche systématique de radio- protecteurs a fourni une l i s t e importante de substances de composition chimique très variée : cyanures e t n i t r i l e s , t h i o l s e t disulfures, dithiocarbamates, ami- nes, substances anoxiantes, e t c .
Toutes ces substances ne sont douées d'activité protectrice vis-à-via des radiations ionisantes qu'à l a condition d'être administrées à l'animal, ou ajoutées au système in vitro, avant l'irradiation ; l'administration après l ' i r - radiation est sans e f f e t . Ce sont des agents prophylactiques et non thérapeuti- ques ; i l s agissent donc sur l e s premières étapes de l a chaîne de réactions a l - lant de l'absorption de l'énergie de l a radiation ionisante à l'apparition de lésions observables.
La séquence des différentes modifications produites par l e s radiations ionisantes est résumée dans la Fig. 1.1. L'absorption de l'énergie provoque des modifications au niveau moléculaire, s o i t de façon directe ( l a molécule a t t e i n t e absorbant elle-même l ' é n e r g i e ) , s o i t de façon indirecte ( l e s radicaux libres for- més par radiolyse de l'eau réagissant avec l e s constituante cellulaires)» lies protecteurs chimiques peuvent intervenir à ce niveau -, i l s doivent être présents durant l'irradiation puisque l e s changements moléculaires apparaissent quelques microsecondes après l ' i r r a d i a t i o n . Les e f f e t s physiologiques sont immédiats et réversibles. Les e f f e t s biochimiques provoquent des l i s i o n s anatomiques» â'nbord submicroscopiques, puis v i s i b l e s ; les lésions biochimiques sont d'autant plus rapides e t manifestes que l e métabolisme est élevé. La mort de l'organisme e s t généralement due à l a perte d'une ou plusieurs fonctions importantes. Les nuta- tions (somatiques ou génétiques) peuvent être considérées comme une espèce de l é - sion biochimique qui se manifeste seulement chez l e s descendants {Bacq «fc Aleve»- der, 1961>.
Parmi l e s radioprotecteurs chimiques, l e s t h i o l s e t disulfures «ont lea plus e f f i c a c e s . La cysteine* injectée ou ingérée avant l ' i r r a d i a t i o n , protège l e s p e t i t s rongeurs ; l e g l u t a t h i o n e l ' é t a t réduit, tripeptide contenant un» mo- lécule de cysteine, est également protecteur ("voir Biacq* 1965)v Sn 195', t%*q et al..ont découvert l e s propriétés radioprotectrices de l a cysteine décarhoxyl^a en cystéamine (2-mercaptoéthylamine) et de son disulfure, l a cystamine. Le fac- teur de réduction de dose, DRF (facteur par lequel i l faut multiplier l a dose de radiation pour obtenir la même mortalité que chez l e s contrôles) est de 1,26 chez
-k-
l e rat injecté de 100 mg de diehlorhydrate de cystéamine par kg. Injectée à* l a méoe molarité, l a cystamine e s t plus efficace et moins toxique que l a cystéamine.
La structure nécessaire pour l ' a c t i v i t é radioprotectrice consiste en une chaîne aliphatique â 2 ou 3 atomes de carbone, ayant à une extrémité un groupement t h i o l e t à l'autre extrémité, une fonction fortement basique. La découverte de l ' e f f e t protecteur de l'AET (2-aminoêthylisothiourée) confirme bien l'importance de ces deux fonctions. T.'ftET, m solution aqueuse (et naturellement lors de l ' i n j e c t i o n à l'animal) est transformé par intratransguanylation en mercaptoétnylguanidine (MEG) qui e s t en fait l a molécule protectrice ; son disulfure, l e guanidinoéthyle dinulTure ou GED a une a c t i v i t é protectrice très semblable (voir Bacq, 1965 ; Bacq et Alexander, 1961).
1.1 EFFET PROTECTEUR DJES THIOLS ET DISULFURES CHEZ LE RAT ET LA SOURIS
L'efficacité protectrice des t h i o l s e t disulfureo dépend de l ' i n t e r v a l - l e de temps séparant leur injection e t l ' i r r a d i a t i o n . Chez l e r a t , on observe une bonne ra&ioprotection 10 minutes après l ' i n j e c t i o n de cystamine ou de cystéa- mine, une radioprotection légèrement réduite après 30 minutes et une radioprotec- tion à nouveau importante après k5 minutes ; l a cystamine e s t plus active que l a cystéardne (Fig. 1.2). Après administration de cysteine, l a protection e s t f a i - ble e t reste inchangée de l a 10e S l a 90e minute (Fig. 1.3) (Betz et a l . , 1967).
Chez l a souris, on observe également un délai entre l ' i n j e c t i o n du ra- dioprotecteur et l'augmentation de la résistance au rayonnement X. Bacq et Beau- mariage (1965) ont mis en évidence deux pics de radicpr&tection, 2 et 10 minutes après l ' i n j e c t i o n de cystamine ; par contre, chez l a souri» injectée de cyattiaai- ne. la protection est maximale lorsque l e délai entre l ' i n j e c t i o n e t l ' i r r a d i a - tion e s t de 10 minutes (Fig. ^.k).
L'existence de ce délai montre que l a radioprotectioh n'apparaît qu'avec une certaine latence e t me développe progressivement. De nombreuses expériences ont été entreprises pour tenter de comprendre l e mécanisme ou l e s mécanismes par lesquels ces substances confèrent â l'animal une certaine resistance aux radia- tions ionisantes. Plusieurs hypothèses ont été proposées.
- 5 -
- < )
1.2 MECABISMES RADTOPBOTECTEURS DES THIOLS ET PISULTURES
Les mécanismes de radioprotection peuvent être subdivisés en 3 groupes : a) l e s mécanismes radiotbimiques pax lesquels l e s composés protecteurs ad- ministres exercent leur action «c intervenant directement dans l e s événements r&-
&i ©chimiques, c'est-a-dire en diminuant l e s doomages causés aux moléculss c i b l e s v i t a l e s ,
b) l e s mécanismes biochimiques : l e radioprotecteur provoque une diminution de l a s e n s i b i l i t é aux radiations en altérant l e métabolisme c e l l u l a i r e ,
c) une hypoxie t i s s u l a i r e diminuant l e s effets des radiations.
1 . 2 . 1 PROTECTION PAR MECANISMES RADIOCBJHTQUES
L'atteinte par l e s radiations des molécules sensibles peut être causée, s o i t directement par absorption de l'énergie de l a radiation, s o i t indirectement par action des radicaux libres fornée par radiolyse de l'eau ou par action des radicaux organiques.
Lee agents protecteurs peuvent agir à t r o i s niveaux. En premier lieu»
i l s peuvent intercepter l e s radicaux libres par l e mécanisme bien connu de p i è - ge age de ces radiaux. En second l i e u , ei le dégât i n i t i a l consiste en une perte d'un atome d'hydrogène, une réparation instantanée peut avoir l i e u par transfert d'hydrogène, entre l e protecteur e t la molécule a t t e i n t e . Enfin, une interaction - de l'agent protecteur avec l a molécule cible peut altérer l a radioaeusibilitê de c e l l e - c i .
1.2.1.1 PCégmage dee radicaux libres et de l'électron acpmux
Puisque l'eau intervient poux702dans l a composition t i s s u l a i r a ^ •*;-dl-f^
composition par l e s rayonnements a une grande importance. Les produits dé ï a ri/rS diolyse de 1*eau sont l e s radicaux libres H" et OH* et l ' é l e c t r o n aqueux. Les ; radiaux l i b r e s peuvent être déterminés (quantitativement e t parfois Qualitative-
• e u t ) par apectrograpbie de résonance paraaagnétique. Etant donné la disparition rapide de cesradicàuxâ cause de leur grande réactivité (demi-vif de l'ordre de
10 sec dans l e s c e l l u l e s ) , c e t t e technique est seulement applicable aux micro- organisées, spores, virus, phages qui peuvent être déshydratés et r e f r o i d i s .
-6-
Ce mécanisme de piégeage des radicaux libres pourrait diminuer les ef- fets indirecte des radiations ; les radicaux libres formés et l'électron aqueux très réactionnels seraient piégés par le protecteur avant qu'ils puissent attein- dre la molécule cible et altérer oa constitution.
Smaller (1963) a montré que l'inhibition de la formation de radicaux libres par irradiation de cellules de levure est proportionnelle à la concentra- tion de cystéamine. D'autre part, la sensibilité à'Eeaheriohia coli B, irradié eu onaérobiose, diminue cri proportion âe In vitesse d'interaction du protecteur avec les radicaux OH * ; 1 ' interaction du protecteur avec les électrons aqueux ne modifie pas la sensibilité et les radicaux H' sont produits en moins grande quan- tité ; cee résultats indiquent l'importance des radicaux OH* pour les dégâts bio- logiques, la protection dépendant exclusivement du piégeage de ceux-ci (Sanner et Pihl, 1969).
Cependant, il faut noter que la concentration en protecteur, nécessaire pour obtenir une protection appréciable par ce mécanisme (DRF de 1,3), est de l'ordre de 30 mM pour la cystéamine ; or, les composés soufrés sont protecteurs à des concentrations inférieures à 3 mM, en supposant une distribution égale dans la phase aqueuse (Pihl et Sanner, 1970).
1.2.1.2 Réparation instantanée par transfert d'hydrogène
Une des premières étapes de l'altération des molécules organiques par les radiations ionisantes (effet direct ou indirect) est la perte d'un atome d'hy- drogène, aboutissant à la formation d'un radical organique (R"). Ce radical est très réactionnel et peut se dimériser (Equ. I.l) ou être peroxyde (Equ. 1.2), la lésion étant dans ce cas irréparable.
R' + R' •* R-R (1.1)
R* + 02 H. RO^ (1.2)
B* + P9H •*• m + PS" _ (1.3) Si le protecteur (PSH) est présent au moment de l'irradiation, il peut réparer la
molécule par transfert d'un hydrogène (Equ. 1.3).
La réparation de radicaux organiques simples et polymériques, par trans- fart d'hydrogène, a pu être mise en évidence ; la réaction est en général rapide et dépend de la structure moléculaire du radical. L'oxygène inhibe la réparation
-î-
pftr compétition pour le radical libre (Mann, 1970).
Ce mécanisme de réparation joue un rôle significatif chez les bactéries gelées, pour réduire l'effet indirect (Banner et Pital, 1969). De même, Bacq et Alexander (196Ua) ont prouvé l'existence de l'équation 1.3 dans le sperzae de sau- mon irradié au Co en présence de cystéamine et à -195 °C. Latarjet et ses col- laborateurs (1963) ont étudié la protection par la cystamine de la thymine irra- diée en solution aqueuse et ont conclu qu'il faut une concentration équimolairo du protecteur et de thymine pour protéger la moitié des molécules de cette base,
Ces deux mécanismes de protection, piégeage des radicaux libres et ré- paration par transfert d'hydrogène, ne peuvent avoir une signification biologique dans les cellules de mammifères que si la distribution du radioprotecteur n'est pas uniforme, surtout s*il y & une accumulation du protecteur au niveau des sites sensibles. En réalité» on observe une accumulation préférentielle dans cer- tains tissus, où la concentration peut être cinq fois celle des autres tissus
(voir Bacq, 1965) ; il est donc possible que ces deux mécanismes interviennent comme mécanismes radioprotecteurs dans les cellules de mammifères.
1.2.1.3 Altération de la radioetneibilité intrinsèque
Les composés sulfurés du groupe de la cystéamine peuvent se combiner au DHA in vitro (Jellum, 1966 ; Kallmann et al.» 1967) ; on peut se demander s'il n'en résulte pas une modification de la sensibilité aux radiations. Cependant, la protection du DHA nécessite la fixation d'un grand nombre de molécules de ra- dioprotecteur et on n'observe aucune corrélation, au point de vue de la structure chimique, entre les composés qui protègent le DHA in vitro et ceux qui protègent les animaux in vivo.
Eldjarn et Pihl (1958 ; I960) ont proposé, comme mécanisme radioprotec- teur, la formation de disulfides mixtes entre les protecteurs soufrés et les fonc- tions -8B ou S-S des protéines, protégeant ainsi un site sensible de l'action di- recte des radiations ionisantes et de l'action des radicaux libres (action indi- recte). Le degré de protection dépend du rôle du groupement -SB protégé. Il y a un certain nombre de faits expérimentaux en faveur de cette hypothèse ; dans le cas de la papains et du coenzyme A, par exemple, l'inactivation de l'ensyme par irradiation résulte presqu'exclusivement de la destruction des groupements -SH et par conséquent» la formation de disulfures mixtes lea protège efficacement (Pihl et Ssnner, 1963a et b ) . Il faut noter cependant un certain nombre d'objections à* l'hypothèse d'Eldjarn et Pihl. Il n'y a pas de corrélation dans le temps entre
-8-
la protection et la formation do diculfures mixtes } au «ornent où presque tout le radioprotecteur ae trouve lié aux protéines, quelques minutes après l'injection»
le rat n'est pas encore protégé (BcU et al., 1962). De plua, un certain nonbre de donnëeB indiquent que les groupements -9H et S-S ne sont pas nécessairement les sites radiosensibles de la molécule (par exemple, Quintiliani et Boccacci,
1963 ; Dickens et Shapiro, 1961),
Jusqu'à présent, personne n'a pu identifier un groupement -SH comme ci- ble plausible et démontrer sa protection par formation d'un dioulfure mixte.
Comme candidats possibles, on peut considérer les groupes-SH des histones, des protéines du fuseau mitotique, des enzymes de réparation et des membranes (Pib.1 et Banner, 19T0).
1.2.2 PROJECTION PAR MECANISMES BIOCHIMIQUES
Les thiols et disulfurcs protecteurs produisent de nombreuses modifica- tions biochimiques dont, leB principales sont reprises ci-dessous :
a) une diminution de la consonmation d'oxygène et de l'élimination de C0_
s'observe après injection de cystamine, cystéamine, cysteine ou AET chez le rat (Novak, 1966 ; Lelièvre, 1965b ; Betz et al., 1967 ; Betz et Lelièvre, 1970) et chei la souris (Novak et al., 1967 "> Locker et Pany, 196U). La diminution du quotient respiratoire chez la souris indique un ralentissement du métabolisne des hydrates de carbone. L'augmentation du quotient respiratoire observée chez le rat (Betz et Lelièvre, 1970) eBt peut-être en relation avec une anoxie tisaulaire et une acidose qui libérerait une certaine quantité de CO^. Récemment, Troquet et ût. (l97M ont montré que l'injection de cystamine provoque, chez le rat, une di- minution de l'élimination de CO suivie d'une augmentation prolongée.
b) La glycogénolyse hépatique et musculaire est stimulée par la cystamine et la cystéamine (Bacq et Fischer, 1953 ; Boxai et al., 1959 ; Hietbrinx mt al,, I 9 6 0 . L'AST stimule la glycogénolyse hépatique et produit une hypoglycémie par stimulation de la sécrétion d'insuline (Zins «t al., 195Bb).
c) La cystamine (et non la cystéamine) inhibe l'activité glycolytique d'ho-
•ogénats d'organes de rats (Lelièvre, i960). Cet effet résulte sans doute de l'inhibition d'enzymes clefs de la glycolyse ; en effet, la cystamine inhibe in vitro l'hexokinaae (Kesbakxen et Eldjarn, 19Ô3 ; Lelièvre, 1959), la phosphogly-
-9-
céraldéhyde déshydrogénaae (Leliêvre, 1959 i Pihl et Lange, 1962) et la phoapho- fructokinase (Froede et al., 1968). Le MEO inhibe la glycolyae aérobique de coupes de foie mais l'inhibition eat due a son produit d'oxydation, le GED (Zins et al.,
1959).
d) Au niveau mitochondrial* les disulfures provoquent :
- une diminution de la consommation d'oxygène : l'administration de cystamine in vitro, inhibe la consommation d'Og d'homogéna+a de différents tissus incubes en présence de pyruvate (Ciccarone et Bacq, 1966) ou en présence de pyruvate et fumarate (Leliêvre, i960 -, Liébecq et Sluse) ainsi que celle de
mitochondries isolées, incubées en présence de pyruvate et de fumarate (Leliêvre, 1965a), ou en présence de pyruvate, de 2-oxoglutarate, ou de mclate (Liébecq et Slufle). Par contre, lorsque la cystamine est injectée a l'animal, on obser- va une augmentation de la consommation d'CU d'homogénats de foie, de 2 à U5 mi- nutes après l'injection du radioprotecteur (Betz et Leliêvre, 1970). L'AET ré- duit la consommation de pyruvate d'homogénats de foie ou de rein, lorsqu'il est ajouté au milieu d'incubation ou injecté à l'animal (Zins et al,, 1956a) et in- hibe la consommation d'Og d'homogénats de foie incubés en présence des intermé- diaires du cycle des acides tricarboxyliques (Scaife, 1966) j
- une inhibition de plusieurs ensymes : les disulfures (cystamine et GED) inhibent la 2-oxoglutarate déshydrogénase et la pyruvate déshydrogénase par formation d«
disulfures mixtes entre le protecteur d'une part et l'acide lipoSque, la lipoyl- déshydrogénase et le coenzyme A d'autre part (Skrede et al., 1965 ; Bets et Ls- liêvre, 1970). La MEG et le GED, à concentrations élevées, inhibent la déshy- drogénase sueeinique et la déshydrogénase malique (£ins et al., 1958a) ;
- un découplage des phosphorylations oxydatives (Leliêvre, 1963 ; Leliêvre, 1965a ; Skrede, 1966) i ce découplage résulte peut-être de la modification de perméabi- lité de la membrane mitochondriale ou d'un blocage des groupements -SH d'un sup- port protéique spécifique intervenant dans la formation d'un intermédiaire ri- che en énergie (Skrede, 1968). L'AET (sous forme de KBG) ne semble pas decou- pler les phosphorylations oxydatives (Scaife, 1966).
e) Les disulfures inhibent la synthèse protéique (Lambert, 195M et la syn- thèse des acides nucléiques (Billen et La Salle, 1962 ; Bornantsev et al., 1970 ; Filippovich et al., 1970).
Bacq et Alexander (l°61*b) ont groupé tous ces effets biochimiques sous le vocable de " choc biochimique " ; ce " choc biochimique " serait la cause réel- le de la protection. Ils font remarquer la corrélation existant entre l'évolu-
- 1 0 - --''•• -.-; -
tion de la radioprotection, celle des troubles biochimiques et celles des lésions mitochondriales visibles au microscope électronique (Firket et Lelièvre, 1966).
Cependant, cette hypothèse du " choc biochimique " ne nous explique pas ccœsont les changements cellulaires augmentent la radiorésistance. On peut envisaser plu- sieurs mécanismes parmi lesquels une libération par les radioprotecteurs d'agents protecteurs endogènes, une augmentation de la radiorésistance intrinsèque des cel-
lules, une augmentatiou de l'efficacité des mécanismes de réparation.
1.2.2.1 LibéiPation d'agents •proteateuxB endogènes
Révész et Modig (1965) et Grayevsky et al. (1966) ont proposé l'hypothè- se suivant laquelle la protection serait due à la libération, sous l'action des radioprotecteurs, de composés protecteurs endogènes sulfhydrylés. En effet, les thiols et disulfures augmentent la concentration cellulaire en -SH non protéiques de» cellules d'ascites (Révész et Bergstrand, 1963) e t d e s souris (SSrbo, 1962) : là radiosensibilité estjyproportionnelle au contenu en -SH non protéiques endogè- nes (Révész et Bergstrand, 1963 \ Révész et al.t 1963)» La grande radiorésistan- ce de Niaroooocue vadioduran» est peut-être attribuable & une concentration impor- tante en thiols endogènes qui protègent la cellule comme un tout ou protègent ses systèmes de réparation (Freedman et al.t 1969). Les expériences réalisées par Grayevsky et al. (1966) montrent une corrélation entre la radiorésistance de la souris et la concentration en thiols dans la rate ; la concentration en thiols, augmentée après l'injection de cystamine ou de cystéamine mais aussi après anoxie, joue un rôle dans la protection car les cellules tumorales d'ascites deviennent plus résistantes si on les met en contact, avant l'irradiation, avec un honogénat d* rate riche en thiols.
Révész et Modig (1965 ; 1967) ont suggéré que la protection résulterait d« 1s, libération de glutathion réduit. On observe en effet chez les cellules d'aacites une hausse de la concentration en gl:itathion intracellulaire (G8H) après l'administration de protecteurs à fonction thiol (RSH). Le glutathion 116 aux
: protéines est libéré dans une réaction d'échange thiol-disulfure (Modig, 1968).
Prot-S-SG + RSH * Prot-S-SG • GSH (1.UJ '
Cependant, l'augmentation de concentration en glutathion est faible comparée I l'augmentation totale an -SH non protéiques (environ un tiers). Les autres -SH libérés n'ont pas été identifiés.
-11-
Le rôle du glutathione dans la protection est discutable, il est possi- ble que la libération de glutathion soit le reflet de la formation de disulfures mixtes entre les protéines et le radioprotecteur et non la vraie cause de la pro- tection observée.
1.2.2.2 Augmentation de la JKuHoreaiatanoe cellulaire
La radiosensibilité des cellules dépend de leur âge au moment de l'ir- radiation. Le cycle cellulaire se Bubdivise et quatre phases : une phsse préByn- thétique ouG., une phase de synthèse du DHA ou phase S, une phase postsynthéti- que ou 02 et une phase de mitose M. La radiosensibilité relative de chaque pha- se du cycle varie d'un matériel à l'autre et selon la dose d'irradiation. Let cellules de hamster chinois sont plus sensibles pendant la nitose et la phase G., un peu soins sensibles en G_ et le soins sensible à la fin de la période 8 (Kruuv et Sinclair, 1968). Des modifications semblables sont observées avec des cellu- les de massif ères. (Sinclair, 1966a). Observant une protection par la cyetéaaio*
et non la cystasine aux différents stades du cycle cellulaire et une protection plus importante pendant les phases les plus ra&iosensibles, Sinclair (1968b) s suggéré que la sensibilité» variable suivant l'âge de la cellule, réeulterait de fluctoations dans la concentration cellulaire en -SH non protéiques. On observe en effet des fluctuations de la concentration en -SH non protéiques parallèles « la radiorésistance mai? celles-ci ne peuvent en être la cause C A T , d'une part, les cellules ne deviennent pas plus sensibles quand la concentration en -SH non protéiques est réduite S 20 % par un oxydant spécifique et, d'autre part, leg cel- lules à croissance en plateau et à croissance exponentielle, malgré une différen- ce importante de concentration en -SH non protéiques, ont la sëse sensibilité sus rayons X (Harris et al., 1969 ; Barris, 1970).
On peut envisager au soins deux autres possibilités pour expliquer cet- te variation de résistance au cours du cycle cellulaire (Pihl et Sanner, 1970) :
a) l'assemblage de l'appareil nitotique impliquant des interactions thiol- disulfure entre différentes protéines, ces réactions altéreraient la configura- tion et la radiosensibilité de ces protéines ;
b) une variation dans les liaisons entre DMA et histones influencerait la sensibilité du M A .
-12-
1.2.2.3 Augmentation den réparations
Les protecteurs sulfhydrylés cnt ta>e action antimitotique (Bassleer e t Chèvremont, i960) e t inhibent 1& synthèse du BSA (Goutier et al., 1967). Dana
l e foie en régénération où l ' a c t i v i t é aitotique eat synchrone, on observe par or- dre chronologique : (a) une augmentation d'activité de l a HHA polymerase (après
10 h) ; (b) une hausse de la synthèse des HHA miclëaires (tmuri.aaa après 12 h) ; (c) l'apparition e t l'augmentation d'activité des kinases de l a thymidine e t de l a DNA polymerase (maxiaum entre 2«i et 26 h) ; (d) une augrsentstion de l a synthê- se du DHA (maximum à l a 2k heure) ; (e) 1 • augmentation rapide de l'index m i t o t i - que (maximum après 28 h)-
L'injection d'AET, une heure avant l*bépatectomie p a r t i e l l e , produit, comme l ' i r r a d i a t i o n , un retard dans l'apparition des enzymes (Baugnet-Mahieu et al., 1967), un retard de l a synthèse du BSA et de l ' a c t i v i t é aitotique (Goutier et al.j 1966 ; Vandergoten e t Goutier, T966). L'injection d'AE? après l ' i r r a d i a - t i o n produit l e mes* choc métabolique malgré La disparition du pouvoir protecteur.
Le choc métabolique ne semble donc pas constituer l e mécanisme de radioprotection mais être l e symptôme d'une ou plusieurs lésions biochimiques importantes pour l a protection et qui doivent être présentes au moaent de l ' i r r a d i a t i o n .
Comme l ' i n t é g r i t é du DHA est indispensable 2 l a formation des enzymes intervenant dans l a synthèse du DHA, Brovn (1967) a proposé que l e pouvoir protec- teur des composés sulfbydrylés résulterait d'une l i a i s o n avec l e s chaînes de DSA, protégeant ainsi l e s portions non recouvertes d'histones ; cela expliquerait l ' e f -
f e t antimitotique du protecteur ainsi que sa propriété de maintenir l a répression du DHA après hépatectomie p a r t i e l l e .
Les expériences l e Goutier e t Baugnet-Mahieu (1970) r e j e t t e n t l'hypothè- se de Brown. Donnée 2k heures «vaut use hépatectomie p a r t i e l l e , une dose de 1000 R inhibe autant l ' a c t i v i t é des kinases chez l e s rats protégés que chez lea rati non protégés ; s i l e protecteur avait pour action principale de réduire l a l é s i o n i n i t i a l e du DBA, on devrait observer use différence entre ces deux groupe». Par contre, a i l e délai séparant l'irradiation de l'hépatectomie partielle'.'est'de'"lié';':-'5;
ou 96 heures, l'AET empêche l'inhibition par l'irradiation de l a àynthèfe des en- '••'•
zymes nécessaires à l a synthèse du DSA. Bacq et Goutier ont donc émis l'hypothè- se suivante : l e protecteur assurerait l a protection du système de réparation du DHA (par formation de disulfures mixtes ou de l i a i s o n s ester puisqu'il s ' a g i t probablement de protéines enzymstiques) *, l e retard dans l a synthèse du DRA dû
au protecteur permettrait à l a c e l l u l e de réparer son MA avant q u ' i l ne puisse se répliquer e t q u ' i l ne reproduise l a l é s i o n . L'inefficacité de l'AET, quelques microsecondes après l'irradiation,suggère un mécanisme radiochitaique pour l a pro~
tection des enzymes du système de réparation. Ce serait essentiellement 1'inten- s i t é de l a réparation qui déterminerait l a radiorésistance de l a c e l l u l e .
I l faut noter que ce mécanisas de protection ne peut jouer un rôle i n - portant que dans l e s t i s s u s à index oitotique élevé cosse l a moelle osseuso, l e s c e l l u l e s des cryptes i n t e s t i n a l e s , qui sont effectivement des t i s s u s t r è s radio- sensibles .
L'existence, chez l e s bactéries, d'un ensemble d'enzymes susceptibles de réparer une l é s i o n provoquée par l'exposition au reyc=e»ent u l t r a v i o l e t ou par fixation d'un agent alkylant est bien connue. On ne s a i t pas s i l e systerw de réparation des c e l l u l e s de mamri.fères e s t l e même que celui des b a c t é r i e s . La système de réparation des bactéries comprend l e s enzymes suivants (Szybolski,
1967) : (a) use endonucléase ou enzyme d ' i n c i s i o n , ouvrant l a l i a i s o n e s t e r phos- phorique au niveau du nucleotide altéré ; (b) une exonucléase ou enzyme d'excision détachant l a fraction lésée de l a chaîne de DSA ; (c) une polymerase qui permet l a synthèse d'un nouveau fragment ; (d) une ligase qui accroche l e nouveau frag- ment synthétisé à l'endroit où l ' e x c i s i o n s ' e s t arrêtée.
La réparation peut être parfaite puisque l e s bases sur l e filament i n - tact induisent l a présence des bases sur l'autre filament.
1 . 2 . 3 PROTECTION PAR RYPOXIB
La présence d'oxygène moléculaire (a sa pression p a r t i e l l e normale dans l ' a i r , c'est-a-dire à peu près 150 ES de mercure) augmente d'un facteur 2 ft 3 l e plupart des e f f e t s des irradiations X e t y sur l e s systèmes vivants e t BUT bflou- coup de systèmes non vivants (Bacq et Alexander, 196Ua). I l est donc p o s s i b l i que l a protection observée après l ' i n j e c t i o n de radioprotecteurs r é s u l t e , en par- ••;.:
t i e du moins, d'une anoxie ou d'une hypoxie.
On peut envisager plusieurs mécanismes pour l'obtention d'une hypoxie après l ' i n j e c t i o n de radioprotecteurs.
- l f c -
1.2.3.1 ConeomaHon d'oxygène par L? protecteur
Les radioprotecteurs à fonction thiol» t e l s que cysteine, cystéamine, glutathion réduit ou acrcaptoéthylguacidiae, peuvent être facilement oxydés en ûisulfures (dans l e s solutions neutres ou légèrement alcalines). Cette oxydation s'accompagne d'une diminution de l'oxygfce dissous et peut provoquer dans des systèmes aodèles {polymères par exeisple) ou dans des suspensions de c e l l u l e s i s o - l é e s , vme anoxie suffisante pour protéger contre l e s rayons X (Gray, 1956).
Par contre, s i on considère le cas d'szdsaax injectés 4e cystéamine ou de MEG, l a quantité d'O nécessaire pour oxyder l e s groupes -SH est négligeable par rapport à l a quantité d'Op consoanee par l'animal ( i l faut 0,2 ail d'0_ pour oxy- der 3 mg de cystéamine, dose radioprotectrice pour uns souris de 20 g ; l a consom- mation d'O. d'une t e l l e sourie au repos est de 20 s i par heure) (Bacq, 196$). De plu8t l a cystéamine e s t l o i n d'être conplèteneat oxydée in vivo ; e l l e e s t excré- tée en grande partie sous forae de t h i o l (Kundy et al., 1961 ) . La consonmation d'O. par l'oxydation des protecteurs il fonction t h i o l ne peut donc provoquer une anoxie chez l'animal.
1.2.3.2 Anoxie par action pkarmacologiqus
La tension d'oxygène peut ê t r e disànuée dans certains t i s s u s par une hypotension prolongée ralentissant l a circulation ou par une vasoconstriction prolongée. Les e f f e t s pharaacologiques des radioprotecteurs soufrés sont varia- bles suivant l'espèce animale, suivant l e proteetffar u t i l i s é e t s i voie d'adminis- tration.
1.2.3.2.1 Effete phcamaeoîoçiques des radioprotmeteure soufrée. Chez l e r a t , l'odainistration intrapéritoaéale de cystasdse, à doses variant de 5 a 20 mg pour 100 g, entraîne une vasodilatation e t une chute de l a pression arté- r i e l l e proportionne?J.e à l a dose injectée. La vitesse d'installation de cette hypotension est d'autant plus rapide que l a dose injectée est élevée. La chute de l a pression a r t é r i e l l e générale déclenche l a aise eu place de réflexes hoaio- stasiques tendant a relever l e niveau tensionnel ; on observe, en e f f e t , 30 admî- t e s après l ' i n j e c t i o n de cyst «aine, use disdnutioa significative de l a teneur des surrénales en catecholamines. Le passage des catéebolaaines dans l a circulation générale traduit l a a i s e en place d'un des aécanisaes régulateurs augurant l a sur-, v i e de l ' a n i s a l ( l a surrénalectosde aggrave,en e f f e t . l a t o x i c i t é du produit que corrige l ' i n j e c t i o n d'adrénaline). Les propriétés histamino-libératric«»s de l a
cystamne sont faibles et l a quentité d* histaminé nûse en circulation n ' a t t e i n t pas des concentrations suffisantes pour codifier l e s e f f e t s vasoooteurs propres de l a cystcrdne (Leconte et al., 196k).
La cystéanine e s e i o e , chez le r a t , des e f f e t s vasonoteurs an&lo£,uca i ceux ûe l a cysterïne. Si on cceç>are l e s e f f e t s tensicasels de doses équicolrircs de cystScjsdne et de cystssdne, l'une et l'autre substances entraînent q u a l i t a t i v e - ror.t ÎC3 ner.'îs réactions ; quastitativeaent, l a cystsaône s'avère 2 à 3 f o i s plus
active (Leconte et al,, 196kJ.
L'injection intraperitonéale de Bercaptoéthylguanidine (provenant d'une transformation rapide de l'AET en solution aqueuse neutre), à l a dose de 50 rg pour 100 g, provoque une légère hausse de l a pression a r t é r i e l l e de 1 à 2 en de mercure. Cette élévation débute dans l e s t r o i s sinutes qui suivent l ' i n j e c t i o n et se maintient pendent une desi-heure au s o i n s . A partir de 100 Bg pour 100 g, on observe une légère hypotension transitoire due en partie à l a libération d ' h i s - tcsùno. A l a dese do 150 03/100 g» l e rat entre progress*veaent en coHapsti? car-', df.o-vasculairo. L'hypertension n'est pas d'origine ortno-sysrpathique car e l l e n'est po3 supprimée par l e s a&rénolytiques, ni par blocage ganglionnaire, ni par l a currésalectcïîie. L'injection de M2G, costrairesest à c e l l e de cystamine ou de cystésaine, s e provoque pas de diminution de l a teneur en catécholanine» des c 5 - ditHo-surrénales (=.o r a t , nais au contraire l'augoente légèrement. I l faut noter que 1?. 1EG réduit l e s e f f e t s a des catecholamines ; on observe donc une inversion des e f f e t s vasculaires de l'edrésûline (Lee este e t Bacq, 1968).
Chez l a souris, l e s radieprotecteurs soufrés produisent une hypertension (Pi Stefano et al., 19^2). Chez l e chien et l e poulet, l e s réactions tensionnol- l e s sont semblables à c e l l e s observées chez 15 rat (3eauBftrisge et al.t I966).
On s'observe pas de relation entre l e s e f f e t s vasonoteurs généraux des radioprotecteurs et leur a c t i v i t é redioprotectriee. Cependant, s i en censiderti l ' a c t i o n des radioprotecteurs sur l a perfusion t i s s u l a i r e au niveau de l a aicro—
circulation, on peut adaettre qu'eu règle générale c e t t e perfusion e s t diminuée sou3 l ' a c t i o n des radioprotecteurs soufrés, s o i t parce ojs» l a pression artérielle';^
cubit une chute importante (cystsaioe et cystésadne}, a o i t parce que l a r é s i s t c a - ce périphérique e s t accrue direct e t nt (AIT) on par l e b i a i s des réactions mSdul- ;•.•
lo-surrcnslienaes (cystaxine e t eystésadiie)* H s'ensuit que certains t i s s u s £9- raient souais à une anoxie e t s une aei&oae, g o t i q u e s o i t l e niveau de pression a r t é r i e l l e générale * La preuve directe d'xzte anoxie a* peut être apportée qua
-16-
par dee mesures de l a pression d'oxygène t i s s u l a i r e .
1.2.3.2.2 Çf/*t <2ee protecteurs soufrée evr la presoxan partielle d'Og.
La tension d'oxygène du sang r e c u e i l l i à l a veine fémorale chat le rat ou cher, l e chien est diminuée après l ' i n j e c t i o n de cysteine ou de cystamine ; la désatura- tion du sang veineux est parallèle à l a protection ; l a cyctéasine est sans e f f e t (Salarno e t F r i e d e l l , 195U ; Salerno e t a l . , 1955). Bacq e t al. (1955) observent une diminution de l a tension d'oxygène du sang de la veine cav*? inférieure du rat,
«près injection de cyBtamine. Selon Heiffer e t al. (1962), 10 minutes après l ' i n - jection intraperitonëale de cystamine, l a saturation en 0„ du sang veineux de l a reine cave inférieure du rat diminue et, 60 minutes après 1*infection, toiribo à 27 i ; par contre, l e pourcentage de saturation en 0_ du sang a r t é r i e l n'est pas modifié. L'injection de cystéamine, dans l e s mènes conditions, n'altère pas l a
t^sau? en oxygène du sang a r t é r i e l , ni du sang veineux.
L'effet des protecteurs soufrés sur l a pression d'oxygène tiBSuloire a été mesuré avec des électrodes à oxygène -, l a pression d*0_ mesurée e s t en f a i t c e l l e du liquide i n t e r s t i t i e l en contact avec l e s c e l l u l e s . Les e f f e t s de l a cys- tamine, de l a cystéanine, de l a cysteine et de l'AET sur l a tension d'Og de dif- férents t i s s u s plus ou moins radiosensibles sont très variables cosse on peut l e voir dans l e Tableau 1. Etant donné l'importance du délai séparant l ' i r r a d i a t i o n de l ' i n j e c t i o n du radioprotecteur, Lelièvre e t al. (1969) ont mesuré l e s varie- tions de l a pression p a r t i e l l e d ' 0 . dans l a r a t e , en fonction du temps, après l ' i n j e c t i o n de radioprotecteurs. 113 observent une baisse rapide de l a pression
&*0g qui atteint une valeur minimale, 10 minutes après lfi n j e c t i o n de cystamine ; 1'hypoxic persiste pendant 1*5 minutes. La cystéamin? a um effet similaire xsais moins marqué tandis que l a cysteine n'a pratiquement pas d ' e f f e t .
I l y a un certain nombre d'arguments contre l'hypathtlse de 1'hypoxic t i t u l a i r e comme mécanisme radioprotecteur :
a) l e s protecteurs soufrés protègent l e s bactéries ou l e s c e l l u l e s i s o l é e s qui n'ont pas de système vasculaire : l e s thymocyte* de rat sont protégés in vi- tro var 1* cysteine, l a L-diméthylcystéine, l'isocyetéine et l'ABt (Grant e t Vos,
19Ô2), par l a cystéanine (Betx e t Boos, 1957 ; V*n Bekkw et de Groot, 1956), Un certain nombre de systèmes non vivants sont protégés par l e s protecteurs eotf rréa (Cbarlesby e t Kbop, 196& ; Alexander e t al., 1955).
b) Dans un système protégé par anoxie, i l serait logique d'obtenir une d t a i -
nution ou une abolition de l a protection lorsqu'on augment* l a pression d'Og.
Cher l e r a t , l'augmentation de l a pression i'CU (jusqu'à 5 atmosphères) n'affecte pas ou réduit t r è s légèrement l a protection offerte par la. cystêaœine, l a cysta- mine, l a cysteine e t l'AET (Van den Brenk e t Moore, 1959 ; Van den Brenk et Jaaie- son, 1962}. Les résultats sont identiques chez la souris (Grayevsky et àl,t 1963).
c) L'absence d'oxygène devrait abolir l ' e f f e t protecteur -, en f a i t , on obser- ve une persistance de l ' a c t i v i t é radiopvotectrice des thiols et disulfures pour des systèmes vivants i n vitro en anoxie (Vergroesen et àl.t 19^2 ; Vergroesen et al., 1963 ; Wood, 1959 ; Kohn e t Gunther, I960). De p l u s , l'bypoxie augmenta l a protection offerte à l a souris par l a cystêamine, l a eystamine e t l'AET (Bothe et al., 1963).
Ces expériences excluent l'hypothèse de l'bypoxie t i s s u l a i r e comme seul mécanisme de radioprotection mais i l est possible qu'il existe plusieurs mécnnia- mes par lesquels l e s t h i o l s et disulfures confèrent une protection e t que l ' b y - poxie t i s s u l a i r e s o i t un de ceux-ci.
I l faut noter que 1*affinité de l a cytochrome oxydase pour l'oxygène e s t t r è s élevée (X * 0,5 S 2 uKm s ce qui correspond à une pression p a r t i e l l e d'oxygène de 0,25 à 1 «m de mercure) ; i l faut que l a pression p a r t i e l l e d'oxygè- ne descende e t prenne l a valeur du K pour réduire de 50 % l ' a c t i v i t é cataly- tique. lies mesures de pression partielle d'Op, chez les animaux injectés de ra- dioprotecteurs soufrés, sont t r è s variables e t i l n'est pas certain que l e s réduc- tions observées soient suffisantes pour entraîner une diadnution de l a respiration.
1.3 BUTS DU TRAVAIL
Le rôle de l'oxygène dans l e phénomène de l a protection chimique contre l e s radiations ionisantes u é t é longuement étudié. Dana le cas des radioprotec- teurs soufrés, l e s résultats aont contradictoires lorsqu'on mesure l e s pressions p a r t i e l l e s d'oxygène à l'aide d'une électrode i oxygène ; une participation de l'anoxie à leur effet radioprotecteur ne peut être définitivement écartée, chei I s rat tout au s o i n s .
Si l a diminution de l a pression partielle d'oxygène est suffioanment im- portante pour entraîner une rédaction de l ' a c t i v i t é de l a chaîne respiratoire, on observera une chute du potentiel d'oxydo-réduction cellulaire e t en particulier
du système HADH-RAD i l e NADÎ1 formé dans len c e l l u l e s ne sera pas -oxydé norai&le—
ment ce qui entraînera une hausse du rapport tHADHj/tHAD 3, Due -variation im- portante de l a teneur en oxygène des t i s s u e entraînera des perturbations métabo- liques et pourra donc être mise en évidence par l a mesure du p o t e n t i e l d'oxydo- réduction du système HADH-NAD . La détermination de ce potentiel à d i f f é r e n t s i n t e r v a l l e s de temps après l ' i n j e c t i o n du radioprotecteur permettra de voir s ' i l e x i s t e une corrélation entre l e potentiel d'oxydo-réduction et l e degré de protec- t i o n .
Coraca l e montrent nos r é s u l t a t s , l ' i n j e c t i o n de cyatamine provoque une chute du p o t e n t i e l d'oxydo-réduction traduisant, semble-t-il,une hypoxie t i a s u l a i - r e . Puisque l'hypotension causée par l a cystamine provoque l a l i b é r a t i o n d'adré- naline et de noradrenaline, on peut se demander s i l'hypoxie observée n'est pas produite par l e s catecholamine» l i b é r é e s .
D'autre part, l'étude de l'influence de la cystamine sur l e métabolisme hépatique et musculaire suggère une interprétation concernant l ' o r i g i n e de l ' h y - pe.rlactacidémie e t de l'hyperglycémie causées par l ' i n j e c t i o n de cystamine.
Enfin, des expériences fl'irradiation ont été entreprises afin de voir s i l'hypoxie causée par l a cystamine contribue à l a radioprotection observée.
Chapitre 2
POTENTIEL D'OXYDO-REDUCTION DANS LE SANG DE RATS ET DE SOURIS
INJECTES DE RADIOPROTECTEURS
- 2 0 -
TABLE O E S MATIERES
INTRODUCTION
2.1 Mesure directe du potentiel d'oxydo-réduction . t~
2.2 Mesure opectro fluorimétrique d u potentiel d'oxydo-réduction £:'j
2.3 Mesure du potentiel d'oxydo-réduction d u système NADH-NAD 21
2.3.1 Mesure d u rapport [NADH libre]/[MAD libre] 23 2.3.1-1 Mesure d u rapport tNADH]/[NAD ] cytoplasmique 2?4
2.3.1.2 Mesure d u rapport [NADH] / [ M D ] mitochondrial ?<?
2.3.2 Valeurs d u rapport [NADH]/[HAD ] cytoplasmique et mitochondrial 27 2.3.3 Potentiel d'oxydo-réduetion du système NADH-NAD cytoplasmic*»
et mitochondrial *,,.. Z\i 2.3.h Mesure d u potentiel d'oxydo-réduction d u système KADU-NAD à p a r -
tir des concentrations sanguines en metabolites ».., ?Q 2.3.5 Influence d e l'ischémie sur le rapport [NADH]/[HAD 3 cytoplasai-
que et mitochondrial ... — \Q
2.3.6 Influence de3 radioprotecteurs sur le potentiel d'oxydo-réduction
du système NADH-NAD cytoplasmique et mitochondrial 31 MATERIEL E T METHODES
2.U Radioprotecteurs 32
2.5 Injections 32 2.6 Préparation des échantillons , , „, 33
2.7 Techniques de dosages . . . .k, . 33
2 . 7 . 1 Dosage du pyruvate • .•*». 33 c* f*& jjos&ge, ou., xacxaxe . « . . . * . . « • . . . « * . • • • • » » . • . . « • » . . . « » « . . » » « % t i « % t 3H 2 . 7 . 3 Dosage de l ' a c é t o a c é t a t e , . . . 31^
2 - 7 , k Dosage du 3-nydrpxybutyrate 3I*
2 . 7 . 5 Dosage du g l u c o s e 3I*
2.7.6 Dosage de l ' a c t i v i t é de l a déshydrogénase lactique 35 2.8 Determination du rapport [HADH)/tHAD ] cytoplasmique 35 2.9 Détermination du potentiel d'oxydo-réduction du système NADH-KAD cyto-
plasmique 36
' - 2 1 -
2.10 Determination du rapport tflADH]/lNAD ] mitochondrial 37 2.11 r6t-,prntf nation du p o t e n t i e l d'oxydo-réduction du uyotème NADH-RAD mito-
chondrial 38 2.12 MeDure de l a température i n t e r n e 38
2.13 Mesure de l ' a c t i v i t é de l a chaîne r e s p i r a t o i r e 39 2.13.1 r é p a r a t i o n des mitochondries de fois de r a t 39 2.13.2 ContrSle de 1 • i n t é g r i t é des mitochondries 39 2.13.3 Mesure de l a v i t e s s e d'oxydation du HADH Uo
2.1U Analyse 8tatistiq.ua ko RESULTATS
2.15 Mise au point des conditions d'expérience k\
2.15.1 Influence de l'anasthéaie chez le rat U1 2.15.2 Influence de l'héparine chez le rat M 2.15»3 Influence du mode de prélèvement du sang de rat ... k\
2.16 Influence do l'injection de cystaaine chez le rat U2 2.17 Influence de l'injection de cyBtéamine che» le rat 1*3 2.18 Influence de l'injection de cysteine ches le rat ,?,,..,,»...-,.... 1*3.
2.19 Influence de l'injection de cystamine chez la souris k$'{
2.20 Influence de l'injection de cystéamine chez la souris ... Mi'."
2.21 Influence de la cystanine sur l'activité de la déshydrogénase lactique M 2.22 Influence de là cystsmîne sur l'activité de la chaîne respiratoire i*. Ul»
DISCUSSION ET r.OHCUJSTONS
2.23 Température interne dea aniaaux injectfeB de radioprotecteura ... 1*6 2.2H Influence àeo radioprotecteurs sur l'état d'oxydo-réduction .. —,,... kS
2.25 Influence de la libération d'acide lactique sur le pH sanguin 1*8 2.25.1 Pouvoir taffipon ..,,.-,,.*,, 1*9
2.25<2 Ventilation pulmonaire 50 2.26 Influence des radioprotecteura our la glycéade ... 50
- 2 2 -
INTRODUCTION
2 . 1 MESURE DIRECT'c. DU POTENTIEL D'OXÏDO-REDWTION
Le p o t e n t i e l d'oxydo-rCduction, mesuré à l ' a i d e d ' é l e c t r o d e s , s u b i t une diminution s i g n i f i c a t i v e après l ' a d m i n i s t r a t i o n de radioprotecteurs s o u f r é s t e l s que l a cystftmino , In c y s t e i n e et l'ALT (Sumarukov e t Krudryashov, PÔ3 ; Kinopo- lyanikov et al.t 1966). La. diminution dépend du degré d'hypoxie ( D o b r o v o l ' s x i i ,
1967)- Ces mesures d i r e c t * » noua permettent de déterminer st-ulement l e s v a r i a - t i o n s du î o t e n t i e l d'oxydo-réduction ; l o s valeurs absolues n'ont pas de s i g n i f i - c a t i o n physiologique car l a pression p a r t i e l l e d'oxygène d'un t i a a u e s t e r t r t m e - raent hétérogène. La p r e s s i o n p a r t i e l l e d'oxygène dijainue au fur e t à Maure que l ' o n passe de 1 ' e x t r é s d t é a r t é r i e l l e d'un c a p i l l a i r e (où e l l e « s t de 8 0 aa\ de Bg) vers aon extrémité veineuse (où e l l e e s t v o i s i n e de ItO M de Eg). Dans l e » t i s - s u s , l a p r e s s i o n d'oxygène diminue l e long des c a p i l l a i r e s ( l o r s q u ' o n p a s s e de 1 ' ertr&aité a r t é r i e l l e vers l ' e x t r é m i t é veineuse) e t diminue aussi l o r s q u ' o n s ' é - l o i g n e des c a p i l l a i r e s (Lubbers, 1968).
Les mesures d i r e c t e s e f f e c t u é e s nous renseignent sur l e s v a r i a t i o n » du p o t e n t i e l d'oxydo-réduction du l i q u i d e e x t r a c e l l u l a i r e avec lequel l e s é l e c t r o d e s
sont en c o n t a c t .
2 . 2 MESURE SPECTEOFZWRIMETRIQUE DU POTENTIEL V0X1D0-HEDVCTT.011
L ' é t a t de réduction de» n u c l e o t i d e s pyridiniques i n t r a c e l l u l a i r e . » p«ut ê t r e Besuré par 1» méthode spectre f l u o r i a é t r i q u e de Chance *t al. (1964)» P u i s - que s e u l e l a f o r » r é d u i t e de ce» n u c l e o t i d e s (HASH e t HADPH) f l u o r e s c et on o b s e r - ve une augmentation de l a fluorascance lorsque l a p r e s s i o n d'oxytfèn* ia%ra««lltt- l a i r e tomba • une valaur d i 0 ) 1 a i d » aarcurc. Cette a é t h o d e , a p p l i c a b l e in vivo, n«* d i s t i n g u a pas ÏADPH t t IATJB e t ne f a i t pas l a d i s t i n c t i o n e n t r a c o a p a r t i - aent cytoplasmique e t mitochondrial ; l a c o n t r i b u t i o n du cytoplasa* l i,jaugs*mta"v t i o n de f l u o r e s c e n c e , en a n o x i e , e s t au s o i n » de kO-% (Buchar, 1970). De p l u s , i l e«t b i e n connu qua l e a dehydrogenases ont una grand* a f f i n i t é pour l a s n u c l e o t i - de 0 r é d u i t s et que l a formation du complexe ensyaa-IAD(P}H produit una augmenta-
- 2 3 -
tion de l a fluorescer.ee et un déplacement du maximum démission vers l e s longueurs d'onde pluo c o u r t e s . La longueur d'onde du maximum d'êmisyion de3 nucleotide- du foie indique que l e s changements de fluorescence observés r e f l è t e n t en gTande par- t i e l ' é t a t de réduction des nucleotides réduits l i c 3 aux protéines enzymntiquen e t en équilibre avec les nucleotides l i b r e 3 (Scholz et al., 19^9)-
De t e l l e a mesures ont été effectuées, in vivo, sur l a muqueuse g a s t r o - i n t e s t i n a l e de r a t , avant et après l ' a d m i n i s t r a t i o n de radioprotecteurs. La cys- tamine (90 mg/kg), l a cyetéamine (165 mg/kg) et l'AET (300 mg/kg) n ' e n t r a î n e n t pas de réduction importante 'Jeu coen::yir,es pyridiniqucs (Jamioson et Vnn don I-renk ,
1966) maiB ces mesures n'ont pas été effectuées à divers i n t e r v a l l e s de temps après l ' i n j e c t i o n .
2 , 3 . MESURE DU POTENTIEL D'OXYDO-REDUCTION DU SYSTEME NADH-NAD*'
Le p o t e n t i e l d'oxydo-réduetion du système NADH-NAD e s t un i n d i c a t e u r sensible de l ' é t a t d'oxydo-réduetion c e l l u l a i r e . I l peut ê t r e c a r a c t é r i s é par l a valeur du rapport ÏNADH li"bre]/[NAD l i b r e ] . Seules, l e s concentrations en NAD H e t ÎÎAD libreG sont c e l l e s q u i , avec les substrats oxydés et r é d u i t s , déterminent l ' é q u i l i b r e thermodynamique des réactions d'oxydo-réduetion puisque l a p o s i t i o n d ' é q u i l i b r e dépend seulement des produits de départ e t des produits de l a r é a c - t i o n et q u ' e l l e est indépendante des produits intermédiaires.Les coenzymes l i é s déterminent l a v i t e s s e à laquelle l ' é q u i l i b r e est a t t e i n t .
Une diminution importante de l a fourniture e~i oxygène se t r a d u i r a par une réduction de ce système modifiant l e s proportions r e l a t i v e s de3 nucleotides ; i l en r é s u l t e r a une hausse du rapport [RADH libre]/tFIAD l i b r e ] .
Plusieurs f a i t s expérimentaux ont miB en évidence l'imperméabilité de l a membrane oitochondriale aux dinuclêotides (voir Borst, 1963). L'existence de c e t t e barviëre de perméabilité pour HADH et HAD permet l e maintien de potentiel»
d'oxydo-réduetion différent» dans l e compartiaent Mitochondrial et l e coa^artiaent cytoplaamique.
2 . 3 . 1 «aeura du rapport [NADB librel/UAD* libx*]
•+ '
La -râleur du rapport [HADH,libre]/[NAD l i b r e ] d'extraita t i s s u l a i r e s ne peut être obtenue par mesure directe des concentrations tisaulairea en HADH et
