Résumé
Le cancer reste un problème important et malgré des avancées importantes réalisées dans les traitements conventionnels comme la chirurgie, la chimio- et la radiothérapie, le nombre de rémissions reste décevant pour certains types de cancer. Différentes nouvelles stratégies sont cependant en cours de développement. Dans cette thèse, deux approches de thérapie
anticancéreuse non conventionnelle sont abordées : la thérapie génique via l’utilisation des vecteurs viraux et la vaccination anti-tumorale à l’aide d’hybrides entre cellules dendritiques (DC) et tumorales (TC).
Nous avons développé une nouvelle méthode de titration de vecteurs viraux par la méthode « ELISPOT » qui est basée sur l’expression réelle du transgène par les cellules cibles. Cette méthode a été mise au point avec le parvovirus recombinant MVM-IL2, mais elle est également adaptable à d’autres vecteurs exprimant d’autres transgènes secrétés pour lesquels des anticorps sont disponibles. La méthode de titration par ELISPOT permet une quantification plus rapide et plus exacte des unités de transduction présentes dans les stocks de vecteurs viraux comparé à la titration par hybridation in situ (annexe I). Le vecteur MVM- IL2 a montré un effet anti-tumoral contre un mélanome dans un modèle de souris
immunocompétente (annexe IV). Des travaux antérieurs concernent l’inactivation
photodynamique de vecteurs adénoviraux et une étude in vivo qui a mis en évidence un effet synergique d’une thérapie génique visant à inhiber l’angiogenèse et de la radiothérapie (annexes V et VI).
Il a été proposé d’utiliser des hybrides entre DC/TC pour la vaccination anti-tumorale pour optimaliser la présentation des antigènes tumoraux. De tels hybrides sont classiquement obtenus par fusion au polyéthylène glycol (PEG) ou par électrofusion. Ces méthodes
requièrent cependant des compétences et/ou des équipements spécifiques et provoquent une importante mort cellulaire. Une autre approche a été décrite récemment, qui fait usage de l’expression de glycoprotéines membranaires fusogènes (FMG) virales comme l a FMG du VSV (vesicular stomatitis virus) (annexe III) ou de GaLV (Gibbon ape Leukemia Virus).
Nous avons essentiellement étudié la fusion par cette dernière. La transduction des cellules s’est révélée être l’étape limitante pour une génération efficace d’hybrides. Par contre, une expression constitutive de GaLV-FMG par des cellules humaines conduit à la formation de syncytia non-viables. Pour ces raisons nous avons développé une nouvelle stratégie pour générer des hybrides entre DC et TC qui fait intervenir une lignée fusogène non-humaine exprimant constitutivement la GaLV-FMG. Cette méthode nous a permis de générer des hybrides tri-parentaux avec un rendement reproductible. La génération de tri-hybrides par l’intermédiaire d’une lignée fusogène est une alternative intéressante aux méthodes existantes de par sa simplicité et sa flexibilité dans le choix des partenaires de la fusion; des DC et TC autologues ou allogéniques. De plus, ce système de fusion offre la possibilité d’intégrer dans la lignée fusogène des transgenes codant des facteurs immuno-modulateurs permettant d’augmenter l’efficacité de l’induction de la réponse immune (annexe II).
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Summary
Cancer is a worldwide health problem and despite advances in traditional treatments i.e.
surgery, chemotherapy and radiotherapy, the cure rate remains disappointing for some cancers. Different novel therapeutic strategies are being developed. In this thesis two non- traditional cancer therapy approaches are studied: gene therapy using viral vectors and anti- tumour vaccination with dendritic cell - tumour cell (DC/TC) hybrids.
We have developed a novel ELISPOT titration method for viral vectors that is based on the actual expression of the transgene in target cells. This method was developed with
recombinant parvovirus MVM-IL2, but it should be adaptable for other vectors carrying expression cassettes for secreted transgene products for which antibodies are available. The ELISPOT titration method allows for faster and better quantification of transducing units present in vector stocks as opposed to titration by in situ hybridisation (annexe I). The MVM- IL2 vector has shown an anti-tumour effect against melanoma in an immunocompetent mouse model (annexe IV). Previous work concerns photodynamic inactivation of adenoviral vectors for biosafety and an in vivo study in which a synergistic effect of antiangiogenesis gene therapy combined with radiotherapy could be shown (annexes V and VI).
DC/TC hybrids have been proposed as cancer vaccines for their simultaneous expression of antigen presentation machinery and tumour associated antigens. Hybrids are classically generated by polyethylene glycol (PEG) or electrofusion. These methods however require special skills and equipment and cause rather high cell lethality. Fusion via the
expression of viral fusogenic membrane glycoproteins (FMG), such as the vesicular stomatitis virus-G (VSV-G) (annexe III) or the Gibbon ape Leukemia Virus (GaLV) FMG, have
recently been described. We have mainly focussed on the latter. Transduction of cells with GaLV-FMG proved to be a limiting step for an efficient generation of hybrids. On the other hand, constitutive expression of GaLV-FMG leads to lethal syncytia formation in human cells. Therefore we developed a novel fusion strategy for the generation of DC/TC cell hybrids that involves the use of a non-human fusogenic cell line that constitutively expresses the GaLV-FMG. With this method we were able to generate reproducible yields of DC/TC tri- parental hybrids. The formation of tri-parental hybrids via the fusogenic cell line is an
interesting alternative to existing DC/TC fusion methods because of its simplicity and its flexibility in the choice of fusion partners, i.e. autologous or allogeneic DCs and tumour cells.
Moreover, the tri-parent hybrid system offers the possibility to further enhance the immune response by the addition of transgenes that code for immuno-modulating factors to the fusogenic cell line (annexe II).
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