Réplication et Réparation de l ADN

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Texte intégral

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Réplication et Réparation de l’ADN

Généralités

L’acide désoxyribonucléique ou ADN est une molécule présente dans toutes les cellules vivantes, qui renferme l’ensemble des informations nécessaires au développement et au fonctionnement d’un organisme.

L’ADN est une molécule allongée pouvant mesurer plusieurs cm de long.

L’ADN peut être soit linéaire, soit circulaire.

▪ Chez les PROCARYOTES (organismes unicellulaires sans noyau), tels que les bactéries, l’ADN est en général présent sous la forme d’un seul chromosome circulaire super enroulé.

Cet ADN peut se compacter encore plus en faisant des super hélices, ce qui va donner une structure hélicoïdale.

▪ Chez les EUCARYOTES, l’ADN est présent dans : - Le noyau cellulaire principalement, - Les mitochondries,

- Les chloroplastes.

Dans le noyau, l’ADN est linéaire et scindé en plusieurs ADN formant des chromosomes.

Il est plus ou moins compacté et associé à des protéines, comme les histones.

Il y a environ 160 paires de bases qui entourent les histones.

Dans la liaison hydrogène, il y a un groupe donneur qui est NH2 et un groupe récepteur qui est O.

On a aussi des liaisons phosphodiester et qui forme le lien entre les différentes bases de sucres pour former la chaîne de sucre qui est à la base de la construction de la molécule d’ADN.

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Le but de la réplication est de garder, après chaque réplication, l’intégrité de l’unité fonctionnelle des molécules qui forment l’ADN. Un gène est capable de créer un messager ARNm, qui lui est capable de, après traduction, donner une protéine fonctionnelle.

Un gène comprend le 1er site d’initiation de la transcription ou la région promotrice (il gère l’expression comme il peut l’éteindre) dont la boite TATA, une région codante, une région terminatrice (terminator). Selon la complexité du gène, je peux avoir d’autres éléments de régulation qui vont apporter de l’aide à l’expression (au promoteur). Je peux donc stimuler ou inhiber l’expression en agissant sur ces éléments de régulation. On peut retrouver aussi des enhancer qui vont augmenter d’avantage la stimulation du gène. Il y a aussi une région non codante en 3’ avec un codon stop. Le codon ATG est un codon de démarrage.

I. La Réplication de l’ADN

La réplication a lieu au cours de la phase S (comme synthèse) , dernière phase de l’interphase qui précède la phase G2/M (comme mitose).

Le mécanisme mis en œuvre pour la réplication de l’ADN sert également à réparer le matériel génétique qui a subi des dégâts/altérations.

Pour s’auto-répliquer, l’ADN a besoin d’une cellule.

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A. Réplication de l’ADN

La formulation de la structure de l’ADN, par Watson et Crick en 1953, s’accompagnait d’une proposition concernant son auto-duplication.

Les 2 brins de la double hélice restent unis par des liaisons hydrogènes entre les bases (2 pour A-T et 3 pour G-C).

Les deux auteurs (Watson et Crick) voyaient la réplication comme une séparation graduelle des brins de la double hélice.

Dès que les brins sont séparés, chacun peut donc servir de modèle pour diriger la synthèse de son complément et reconstituer la double hélice.

B. Mode de Réplication de l’ADN

Suivant l’hypothèse de Watson et Crick, chacun des duplex fils doit posséder un brin complet du duplex d’origine et un autre néoformé.

Plusieurs hypothèses :

Une réplication de ce type est semi conservative :

Puisque chaque cellule fille reçoit une moitié de la structure parentale.

Dans une réplication conservative :

Les 2 brins d’origine resteraient ensemble après avoir servis de modèle, de même que les deux brins néoformés.

Par conséquent, une cellule fille n’aurait que le duplex entièrement conservé et l’autre ne recevrait que de l’ADN néoformé.

Dans le 3ème cas, on peut avoir une réplication dispersive, les brins parentaux seraient alors fragmentés et les nouveaux brins seraient synthétisés sous la forme de cours segments.

Les fragments anciens et nouveaux seraient ensuite réunis en 1 brin complet.

Par conséquent, les cellules filles posséderaient des duplex dont les 2 brins d’ADN seraient un mélange d’ADN ancien et nouveau.

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La Réplication de l’ADN est-elle Conservative ou Semi-Conservative ?

La réplication est semi conservative chez les bactéries.

On utilise une mise en culture des bactéries en présence d’un milieu contenant du chlorure d’ammonium N15 comme unique source d’azote.

En conséquence, les bases azotées de l’ADN de ces cellules ne possèdent/contiennent que les isotopes lourds d’azote (N15).

Après mise en culture, on procède à l’extraction d’ADN des bactéries à différents stades de l’expérience.

Puis on les mélange à une solution concentrée de chlorure de Césium mise dans un tube de centrifugation et centrifugé à grande vitesse jusqu’à l’équilibre.

Pulse : incubation des molécules avec le N15 30s pendant 5-10 min Chase : purification des bactéries (on chasse le N15) et ajout de N14

Il paraît évident que puisque nos molécules ne sont pas composées des mêmes isotopes d’azote, l’un étant plus lourd que l’autre, leur densité seront différentes. On place donc nos molécules dans la solution concentrée de chlorure de césium pendant 15-30 min.

Les ions Césiums ont une masse atomique suffisante pour être affectés par la force centrifuge. Ils forment un gradient de densité pendant la centrifugation :

• La concentration de Césium la plus basse, donc faible densité, se retrouve au sommet du tube.

• La concentration la plus élevée (forte densité) en Césium, donc forte densité, se retrouve à la base du tube.

Pendant la centrifugation, les fragments d’ADN présents dans le tube, se placent à des niveaux de même densité que la leur.

Celle-ci dépend elle-même du rapport N15/N14 présent dans leurs nucléotides.

A l’issue de la centrifugation, le fragment d’ADN se trouve d’autant plus haut dans le tube que sa teneur en N14 est plus élevée.

Il y a donc 3 possibilités :

- Si l'hypothèse semi-conservative est vérifiée, les molécules N15 vont disparaître - Si l'hypothèse conservative est vérifiée, les molécules de N15 restent

- Si l'hypothèse dispersive est vérifiée, on a un mélange de N15 et de N14. -

Le tube isolé représente la position de l’ADN parental.

L’apparition d’une bande hybride et la disparition de la bande lourde, après une génération élimine la réplication conservative.

L’apparition ultérieure de 2 bandes, une légère et une hybride, élimine le schéma dispersif.

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Conclusion :

Au fur et à mesure qu’on avance dans le temps, on perd la molécule parentale (la référence de départ).

La réplication de l’ADN est semi-conservative.

En 1960, on a prouvé que la réplication est semi-conservative dans les cellules eucaryotes. En fait, on fait la même démarche décrite ci-dessus avec les cellules eucaryotes et on retrouve que la réplication de l’ADN des cellules eucaryotes est semi- conservative.

C. Fourche de Réplication et Réplication Bidirectionnelle

Les recherches scientifiques pour comprendre le déroulement de la réplication de l’ADN ont montré que plus de 30 protéines parmi lesquelles plusieurs sont dotées d’activités enzymatiques sont nécessaires pour la réplication du chromosome chez la bactérie E.Coli.

Parmi les protéines, on trouve les enzymes suivantes :

1) Les Topoisomérases

de la famille des gyrases

Parmi ces protéines, on trouve la famille des gyrases (chez E. Coli), ou plus généralement chez les eucaryotes, une topoisomérase, qui a 2 actions :

- Elle élimine les supers tours positifs créés par progression de la fourche,

- Elle crée également des supers tours négatifs, ce qui permet d’annuler une tension ultérieure au déroulement suivant.

Les gyrases et la topoisomérase II sont des nucléases qui vont couper la structure double brin pour relâcher le système.

Ils possèdent aussi une activité de ligation afin de recoller les deux brins qu’ils ont coupés.

Au moment où la fourche va s’ouvrir pour se préparer à la réplication, une tension va être créée en amont de cette fourche (super tour). Si on ne fait rien, tout le système va être bloqué.

Ils ont besoin d’énergie provenant de l’hydrolyse de l’ATP.

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Les Hélicases

au nombre de 2

Deux hélicases une sur chaque brin, sont des protéines de fixation à l’ADN monocaténaire.

Elles assurent la séparation progressive et régulière des 2 brins d’ADN en éliminant les liaisons H en présence d’ATP

(ATP dépendant). Les hélicases se déplacent grâce à l'hydrolyse de l'ATP.

Elles utilisent l’énergie libérée par l’hydrolyse de l’ATP en ADP, et assurent la formation d’un œil de réplication.

3) Les Déroulases

ou protéines SSB

Les déroulases ou protéines SSB (Single Strand DNA Binding, chez les procaryotes), protéines RPA (Replication Protein A, chez les eucaryotes) se fixent sur chaque monobrin, ce qui empêche les 2 monobrins de se retrouver.

Dès leur séparation, les monobrins sont stabilisés.

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4) Les Primases

qui sont une ARN Polymérase

Les primases sont des ARN polymérases synthétisant les amorces ARN de 4 à 12 nucléotides sur le brin retardé toutes les secondes, dans le sens 5’-3’ comme sur le brin avancé. Une fois que l’amorce ARN a été mis en place, l’ADN polymérase III va commencer à procéder à la réplication de façon complémentaire dans le sens 5’→ 3’.

Il y a une synthèse en 3’-5’ pour que l’élongation soit faite en 5’-3’.

Elles utilisent des rATP, rGTP, rCTP et rTTP, qui sont des Oxy-ribonucléotides (et non désoxy).

L’ADN polymérase reconnaît les structures doubles brin.

Chez la bactérie, la primase et l'hélicase s'associent temporairement pour former un primosome.

5) L’ADN Polymérase III

Les cellules vivantes possèdes diverses ADN polymérases qui assurent les multiples et distinctes opérations de synthèse nécessaires à la duplication d’un génome entier.

L’ADN polymérase III assure l’élongation à partir de l’amorce ARN dans le sens 5’ → 3’ de la chaîne, lors de la réplication et de la vérification de la fidélité.

Elle est processive car elle est capable de polymériser plusieurs milliers de nucléotides sans se détacher du brin matrice.

Elle possède une activité de correction exonucléasique dans le sens 3’→ 5’.

Il y a donc 2 activités.

La polymérase nécessite une matrice double brin pour commencer son action ce qui est rendu possible par la fixation de l’amorce sur l’ADN monobrin.

Chez E.Coli on connait 5 ADN-polymérases différentes dans l’ADN polymérase 3 qui forment avec d’autres protéines un complexe hautement processif.

6) L’ADN Polymérase I

L’ADN polymérase I, faiblement processive intervient dans l’élimination des amorces d’ARN grâce à l’activité exonucléasique 5’→3’ pour les remplacer par de l’ADN.

Elle intervient aussi dans le remplissage des espaces laissées par élimination des amorces grâce à une activité de synthèse/de polymérisation 5’→ 3’ et dans la réparation des lésions grâce à son activité exonucléasique 3' → 5’.

Elle possède donc 2 activités exonucléasiques ; une 5’ → 3’ et une 3’→ 5’ ainsi qu’une activité d’élongation 5’ → 3’.

C’est une enzyme qui prend son temps. Elle est peu processive.

La synthèse se fait toujours dans le sens donc l’activité de polymérisation se fait 5’→ 3’.

Les 2 ADN polymérases ont besoin d'un brin modèle et d'une amorce.

Ces 2 enzymes possèdent de plus une activité 3’exonucléase correctrice des erreurs de synthèse. Les 3 autres ADN polymérases de la bactérie participent à diverses opérations de réparation de l’ADN.

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Les cellules eucaryotes possèdent de nombreuses ADN polymérases, 3 sont essentielles pour dupliquer le génome : - L’ADN polymérase  (possède aussi une activité primase) : C’est une enzyme tétramérique. Elle met en place

la synthèse de l’amorce ARN. Elle possède 2 sous-unités pour la synthèse de l’ADN et 2 sous-unités pour la synthèse de l’amorce ARN. Ces dernières vont donc synthétiser la petite structure d’ARN à partir de ribonucléotides, une fois que c’est fait, les 2 autres sous-unités vont utiliser les désoxyribonucléotides pour continuer l’élongation de l’ADN. La processivité de ces enzymes est basse (ressemble à l’ADN polymérase I chez les procaryotes) afin de limiter les erreurs. Elles intègrent donc 1 à 5 nucléotides par minute ce qui est donc très lent. Ainsi, une fois que l’enzyme a ajouté 10 à 15 nucléotides, les enzymes  et  vont prendre la relève avec une haute processivité (jusqu’à 58 nucléotides par minute).

- Les ADN polymérases  et  : elles sont hautement processives et remplacent rapidement l’ADN polymérase

pour allonger efficacement le nouvel ADN de cette dernière à synthétiser. L’ADN polymérase  Elles possèdent une activité de correction exonucléasique 3’ → 5’. Ainsi dès qu’il y a une erreur elle revient sur ses pas afin de la corriger.

La probabilité de faire des erreurs souvent c’est au décollage. C’est la raison pour laquelle on demande toujours aux enzymes qui vont initier la synthèse, qui vont créer la structure de base, de prendre le temps nécessaire pour bien répertorier et intégrer le bon nucléotide à la bonne place. La probabilité d’erreur est plus importante à l’initiation de la synthèse qu’à l’extension.

Récemment, on a découvert que dans le cancer l’ADN polymérase  possède une mutation létale de son activité correctrice. Son site catalytique de l’activité de correction a subi une mutation défaillant ce qui lui a fait perdre son activité correctrice. La recherche de mutations au niveau de l’ADN polymérase  est donc automatiquement demandée par tous les oncologues.

Si on a présence de la mutation, les antigènes peptidiques au niveau de la cellule cancéreuse seront donc porteurs de la mutation, ainsi les patients seront susceptibles d’être traités par immunothérapie.

Les autres ADN polymérases eucaryotes participent comme pour les bactéries à la réparation de l’ADN.

FIN DU COURS DU 04/11/2020

7) L’ADN Ligase

L’ADN ligase permet la jonction des fragments d’Okazaki.

L’origine de réplication des chromosomes, chez la bactérie E.Coli, est une séquence spécifique appelée « OriC », à laquelle plusieurs protéines se fixent pour initier le processus de réplication.

A partir de l’origine, la réplication débute et se poursuit dans les deux directions, elle est bidirectionnelle.

Chez la bactérie, il y a qu’une seule séquence qui sert comme origine de la réplication contrairement aux cellules eucaryotes.

La fourche de réplication est créée par l’action des hélicases qui brisent les liaisons hydrogènes entre les 2 brins de la double hélice d’ADN, ce qui permet leur séparation.

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D. Déroulement du Duplex et Séparation des Brins

La séparation d’une double hélice entraîne un déroulement de la structure.

La séparation de 2 brins d’une molécule d’ADN circulaire ou d’une molécule d’ADN linéaire, qui n’est pas libre de tourner comme ce serait le cas pour un long chromosome eucaryote (car elle est liée à des protéines), induit une tension dans la molécule qui ne peut être supprimée par une rotation de la molécule entière.

La molécule d’ADN forme alors une super hélice positive.

L’ADN peut donc exister dans 3 états : - Un état relâché,

- Un état super enroulé positif, - Un état super enroulé négatif.

Ce dernier état super enroulé exerce des pressions et est nécessaire au cours de la réplication et de la transcription :

→ Les super tours négatifs exercent des pressions et favorisent la séparation des 2 brins d’ADN nécessaire au cours de la réplication comme la synthèse d’ADN et au cours de la transcription comme la synthèse d’ARN.

L’ADN super-enroulé (négatif ou positif) migre plus que la forme relâchée.

Ils possèdent des propriétés physico-chimiques différentes.

On prépare un gel d’Aggarose 1 g % mL. Vous arrivez avec votre solution d’ADN (souvent 20microL) et vous la posez dans un puit. Vous allez pratiquer une tension du positif vers le négatif. Vous allez faire migrer votre molécule d’ADN.

Pour séparer la molécule linéaire de la molécule surenroulée, vous faites migrer votre solution d’ADN. La molécule surenroulée va devenir une bille. Donc grande capacité de se faufiler entre les différentes mailles. Au contraire, une molécule linéaire, dès qu’elle va rencontrer un obstacle, elle va s’arrêter. Vous prenez votre gel à la fin de la migration.

Vu que c’est une molécule qui peut fluorescer, vous allez mettre un intercalent : BET. C’est un intercalent qui va s’intercaler au sein de la molécule d’ADN et qui en présence de l’UV va devenir fluoresçant. A ce moment là, le BET qui s’est incorporé au sein de la molécule d’ADN va absorber et renvoyer de l’énergie. On peut voir des petites molécules d’ADN qui ont pu migrer au fond du gel. 90 à 95 % des molécules sont sous forme linéaire et les petites molécules que l’on peut observer en bas du gel sont souvent de gel surenroulés qui migrent plus facilement. Si on fait migrer cette solution, on trouvera 90 à 95 % de votre molécule est sous forme surenroulée. Si on veut relâcher tout le monde, on prend une enzyme de restriction qui va couper toutes vos molécules et va les rendre toutes linéaires.

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La gyrase bactérienne induit des surenroulements négatifs en présence d’ATP, elle clive les doubles brins de l’ADN.

Les cellules possèdent des enzymes, des topoisomérases, capables de modifier le surenroulement d’un duplex d’ADN.

Ces enzymes sont très conservées et sont présentes chez toutes les espèces avec pour rôle principal celui de contrôler l’état topologique de la molécule d’ADN.

Pour cela, ces enzymes doivent pouvoir créer des super enroulements pour modifier le nombre d’enlacements de l’ADN, ce qui ne peut être rendu possible que si ces enzymes coupent l’ADN sur un ou deux brins.

Elles sont réparties en deux classes (chez les eucaryotes) topoisomérases I et II, On connaît 2 types de topoisomérases qui modifient la topologie de l’ADN.

En connaissant le rôle des topoisomérases 1 et 2 on peut développer des inhibiteurs contre elles pour le traitement du cancer.

En effet les topoisomérases 1 et 2 sont à l’origine d’une forte prolifération des cellules cancereuses. Dans le cas d’une topoisomérase 1 intrinsèque à la cellule, dès qu’on a un surenroulement positif, la cellule va normalement utiliser ses topoisomèrases pour couper la structure, tenir le système puis relâcher le système et souder la molécule d’ADN grâce

à son activité de soudure afin de continuer la réplication.

Pour traiter le cancer, on prescrit un inhibiteur de l’activité de soudure des topoisomérases. Ainsi les topoisomérases seront incapable de souder l’ADN, on aura donc une réplication qui ne sera pas finie ce qui fait que la cellule va se diriger vers la mort cellulaire. On peut traiter grâce à ces inhibiteurs des patients atteints de cancer colorectal avec le médicament IRINOTECAN®.

1) La Topoisomérase de type I

La topoisomérase de type I qui assure la coupure et la soudure d’1 seul des deux brins d’ADN.

Lorsque la coupure a eu lieu, le brin d’ADN sectionné peut alors tourner sur lui-même.

Cela va diminuer le super enroulement négatif ou positive et permet de revenir à une conformation plus relâchée.

Une fois qu’il va se retrouver à l’équilibre, on aura une activité de soudure (ligase). On va se retrouver avec une molécule d’ADN complètement relachée et la fourche peut avancer. Quelques fois, cela devient très très compliqué pour la topoisomérase dans la mesure où la structure double hélice est difficile déstructurer. C’est la où intervient la topoisomérase II qui coupent alors les deux brin.

La coupure et la régénération de la liaison initiale, après le déroulement de l’ADN, ne consomment pas d’ATP.

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2) La Topoisomérase de type II

La topoisomérase de type II provoque une rupture temporaire des 2 brins du duplexe de l’ADN,

- Elles sont capables de produire une super-hélice et de relâcher l’ADN après avoir supprimé des super enroulements positifs.

- Elles peuvent aussi faire ou défaire des nœuds dans la molécule d’ADN.

La topoisomérase II possède aussi une activité de ligase.

Les topoisomérases ont une activité endonucléase.

La topoisomérase II humaine est la cible de plusieurs médicaments tels que l’Etoposide et la Doxorubicine utilisés pour tuer les cellules cancéreuses à division rapide en divisions rapides en inhibant l’activité spécifique à la topoisomérase II.

Ces substances s’unissent à l’enzyme et empêchent la soudure de 2 brins d’ADN scindés donc empêcher l’activité

ligase des topoisomérases.

En effet, la topoisomérase de type II est nécessaire pour détacher les molécules d'ADN et permettre la séparation des chromosomes dupliqués à la mitose.

On trouve dans ce type de topoisomérase, la gyrase bactérienne (sorte de topoisomérase de type II) qui se déplace le long de l’ADN à l’avant de la fourche en éliminant super hélice

L’action des topoisomérases II nécessite l’énergie libérée par l’hydrolyse d’une molécule d’ATP.

E. Mécanisme de Réplication de l’ADN

La réplication peut être divisée en 3 étapes principales : l’initiation, l’élongation et la terminaison.

1) Initiation

L’initiation de la réplication a lieu à l’origine de la réplication.

Il n’y a qu’une seule origine de réplication dans les chromosomes bactériens, alors qu’il en existe plusieurs chez les eucaryotes.

Il existe des protéines capable reconnaître ces origines, et d’initier cette réplication.

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2) Élongation ou Synthèse d’ADN

C’est au cours de cette phase qu’il y a formation de la réplisome et synthèse d'ADN.

L’élongation de l’ADN progresse toujours dans le sens 5’ →3’, pour le brin en création.

Les 2 brins de la double hélice d’ADN sont enroulés dans des sens opposés, ils sont antiparallèles.

Il existe de ce fait, des mécanismes différents selon le brin d’ADN répliqué.

L’ADN polymérase ne peut allonger que dans le sens 5' → 3’ et il lui faut une matrice.

Pour résoudre ce problème, l’autre brin sera recopié de manière discontinue grâce au fragment d’Okasaki.

Le brin synthétisé de manière continue est le brin précoce ou avancé, l’autre synthétisé de manière discontinue est appelé le brin retardé.

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Réplication Semi-Discontinue :

Un brin étant synthétisé de manière continu et l’autre de manière discontinue,

→ On dit que la réplication est semi-discontinue.

Okasaki remarqua que si les bactéries recevaient de très courtes pulses de thymidine tritiée, et si les bactéries étaient immédiatement tuées, on pouvait retrouver la plus grande partie de la radioactivité dans de petits fragments d’ADN d’environ 1000 à 2000 nucléotides de long.

Par contre, si le pulse était suivi d’une courte chasse, la radioactivité se retrouverait dans une molécule d’ADN beaucoup plus grande.

Cela a montré qu’une partie de l’ADN était construite à partir de petits segments appelés plus tard fragments d’Okazaki qui s’unissent rapidement en morceaux plus grands.

L’enzyme responsable de la liaison des fragments d’Okazaki est l’ADN ligase.

L’initiation est le fait d’une ARN polymérase particulière, la primase qui fabrique une courte amorce d’ARN et non d’ADN.

Le brin avancé dont la synthèse débute dès l’origine de l’élongation, est initié par une molécule de primase.

Les courts ARN synthétisés par la primase sont les amorces nécessaires à la synthèse d’ADN par une ADN polymérase.

Les amorces d’ARN sont ensuite éliminées et la lacune qui en résulte dans le brin est comblée par de l’ADN grâce à l’ADN polymérase I puis soudé par l’ADN ligase.

La probabilité de voir se produire des erreurs est sans doute plus grande durant l'initiation qu'au cours de l'élongation.

En effet, les utilisations d'un petit segment d'ARN amovible évitent l'inclusion des bases inadéquates.

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F. Mécanisme Opérant au Niveau de la Fourche et Réplication

Le déroulement du duplex et la séparation des brins exigent la participation de 2 types différents de protéines qui se fixent à l’ADN :

- Une hélicase est une protéine qui déroule l’ADN.

- Des protéines peuvent se lier à l’ADN simple brin ou l'ADN monocaténaire pour éviter la reformation de la double hélice, ce sont :

→ Les protéines SSB des procaryotes,

→ Des protéines RPA des eucaryotes.

Les ADN hélicases déroulent le duplex au cours d’une réaction qui utilise l’énergie libérée par l’hydrolyse d’ATP pour se déplacer le long des brins d’ADN, et rompre ainsi les liaisons hydrogènes reliant les deux brins et exposer les ADN monocaténaires modèles.

Les 2 polymérases III peuvent alors se déplacer ensemble et font partie d’un même complexe de réplication.

G. Activité exonucléase des ADN polymérases

En plus de son activité de la polymérisation, l’ADN polymérase I est une exonucléase 3’→ 5’ et 5’→ 3’.

Elle utilise du coté 5’→3’ l’activité d’élimination de l’amorce en plus de la synthèse

Quand l’enzyme élimine des ribonucléotides de l’amorce, son activité de polymérase comble simultanément le vide qui en résulte avec les dNTP(désoxyribonucléotides).

L’activité exonucléase 3’→ 5’ est commune aux ADN polymérase I et III pour la correction sur épreuve.

Grâce à une ADN ligase, le dernier dNTP incorporé est uni par covalence à l’extrémité 5’ du fragment d’ADN synthétisé antérieurement.

H. Réplication dans les Cellules Eucaryotes

Dans les cellules eucaryotes, la réplication passe par le même mécanisme et utilise les mêmes protéines que chez les procaryotes.

Les cellules eucaryotes répliquent leurs génomes par des petites portions appelées réplicons.

Chaque réplicon possède sa propre origine à partir de laquelle les fourches de réplication progressent dans les 2 sens.

Il y a entre 30 et 50 000 origines de réplication active à chaque cycle cellulaire.

Toutes les origines de réplication ne sont pas actives en même temps.

Leur activation est définie à des périodes spécifiques durant la progression du cycle cellulaire.

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La sélection des sites, auxquelles la réplication peut être initiée, serait contrôlé par des facteurs épigénétiques locaux comme :

- La position des nucléosomes,

- Le type de modification des histones, - La méthylation de l’ADN,

- Le degré d’enroulement, - Le niveau de la transcription.

Comme dans les bactéries, la réplication de l'ADN des cellules eucaryotes est semi-discontinue, avec des fragments d'Okasaki de 1000 à 2000 nucléotides.

L’ADN polymérase de la réplication des eucaryotes est présente sous forme de dimère, ce qui suggère que les brins avancés et retardés sont synthétisés de façon coordonnée par 1 seul complexe de réplication ou réplisome.

La réplication s’accompagne d’une duplication des histones :

→ À chaque cycle de réplication de l’ADN, la masse d’histone double.

Les histones nouvellement synthétisées et les histones parentales sont situées à la fois sur les brins avancés et retardés.

I. Terminaison de la Réplication

Il est difficile de répliquer complètement les extrémités de l’ADN car les polymérases n’agissent que dans le sens 5’→ 3’.

Le brin retardé aurait une extrémité 5’ incomplète, après l’élimination de l’amorce d’ARN.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes sont appelées télomères.

Cela vient du mot grec « telos » qui signifie extrémité.

Les télomères comportent des répétitions de courtes séquences(sur 9 à 15 kb) Chez l’Homme, il s'agit du 5’-TTA GGG-3’(sa taille est généralement de 10 à 15 kb)

Cette séquence se trouve de cycle en cycle, incomplètement dupliqué à partir du brin retardé.

Un segment terminal du brin parental situé à l’extrémité 3’ du brin retardé reste à la fin de la réplication, sous la forme d’un simple brin.

À la réplication suivante, le chromosome correspondant sera plus court que son homologue.

De génération en génération, une perte progressive d’information génétique en résulte, dont les effets ne peuvent être que défavorables.

Pour compenser ce déficit, les cellules eucaryotes possèdent un mécanisme enzymatique basé sur un ADN polymérase spécial, nommé télomérase.

La télomérase appartient à une classe d’ADN polymérase nommé transcriptase inverse(que l’on retrouve chez les rétrovirus).

Elle possède une protéine qui est donc la reverse transcriptase ainsi qu’une séquence d’ARN dans un même complexe.

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Elle synthétise l’ADN en copiant une matrice d’ARN.

L’ARN peut par complémentarité des bases s’hybrider avec les télomères.

Sous leur forme simple brin, les télomères recrutent la télomérasedont le composant ARNassure à la fois la fonction d’amorce, et de matrice modèle, pour démarrer une synthèse complémentaire d’ADN simple brin du coté 3’.

Le nouvel ADN peut alors servir de matrice pour la synthèse, par les autres ADN polymérases III et I du brin télomérique complémentaire.

Les gènes présents aux extrémités du chromosome seront protégés contre un défaut de duplication.

II. Réparation de l’ADN

Il est important que l’information génétique reste inchangée quand elle passe d’une cellule à une autre et d’un individu à un autre.

Dans la cellule, l’ADN est une des molécules les plus susceptibles de subir des lésions liées à l’environnement, comme les radiations ionisantes des substances chimiques communes et des radiations UV.

Exposées aux radiations UV, les pyrimidines contiguës sur un brin d’ADN ont tendance à interagir entre elles pour former un complexe covalent, un dimère.

Si ces lésions ne sont pas réparées, elles entraînent une altération permanente, ou mutation de l’ADN.

Si la mutation survient dans une cellule destinée à devenir un gamète (cellules germinales),l’altération génétique peut être transmise à la génération suivante.

Les mutations ont aussi des conséquences pour les cellules somatiques, ne faisant pas partie de la lignée germinale (comme nous l’avons vu pour le cancer du poumon ou le mélanome)

Les cellules possèdent différents systèmes de réparation qui semblent capables de corriger pratiquement tous les types de dommages pouvant atteindre la molécule d’ADN.

Les cellules procaryotes comme les eucaryotes possèdent une gamme de protéines qui patrouillent le long de l’ADN, à la recherche de modifications chimiques subtiles et de distorsions du duplex d’ADN.

La plupart des systèmes de réparation exigent l’excision du système d’ADN endommagé et son élimination sélective.

A. Détection des Dommages de l’ADN

La cellule dispose de plusieurs protéines, parmi lesquelles on trouveles glycosylases : PARP, XPC MRN ATM

Ces protéines vont être capable de détecter spécifiquement les différentes interactions susceptibles de se produire sur l’ADN.

Chaque système de réparation possède ces protéines

Ces différentes protéines vont reconnaître et se fixer à des structures anormales présentent au sein de l’ADN, telles que :

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▪ Des dimères de bases azotés,

▪ Des bases azotées modifiées,

▪ Des bases excisées

▪ ADN et protéines pontés

▪ ADN simple brin

▪ Distorsion de la double hélice

B. Altération de la Structure de l’ADN

Les altérations les plus simples portent sur la modification d’une base seulement,

→ Ce sont les transitions et les transversions.

Dans les transitions, on trouve les mutations de : - A G (purine/purine),

- T C (pyrimidine/pyrimidine).

La transversion correspond aux mutations de : - A C (purine/pyrimidine),

- T G (pyrimidine/purine).

On les nomme mutations ponctuelles.

A ce type d’altérations se rattachent les insertions et les délétions d’1 seul nucléotide.

Les autres modifications portant sur des fragments d’ADN de tailles plus importantes sont généralement des événements de recombinaisons de la transposition.

C. Réparation par Excision d’un Nucléotide (REN)

Elle utilise un seul mécanisme de coupure et de réparation qui élimine différentes lésions.

On peut distinguer 2 types de réparation :

Une voie couplée à la transcription dans laquelle les brins modèles des gènes activement transcrits sont préférentiellement réparés.

La lésion peut être signalée par le blocage de l’ARN polymérase II qui participe au repérage du dommage et recrute les protéines nécessaires à la réparation.

L'ARN polymérase va alors cliver la zone d'erreur.

Cette voie de réparation préférentielle donne l'assurance que les gènes les plus importants pour la cellule, ceux que la cellule transcrit activement, jouissent de la plus grande priorité sur la liste de réparation.

Une voie générale plus lente et moins efficace qui corrige les brins dans le reste du génome.

La découverte du rôle du facteur de transcription TF II H a créé en lien crucial entre la transcription et la réparation de l’ADN, par les différentes sous unités de TF II H :

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Il s’en trouve 2, XPB et XPD, qui possèdent une activité hélicase :

→ Ces enzymes séparent les 2 brins du duplex pour préparer l’élimination de la lésion.

D. Réparation par Excision de Base (REB)

Le système de réparation fonctionne pour éliminer les nucléotides altérés produits par les substances chimiques.

La REB est déclenché par une ADN glycosylase : - Elle reconnaît une altération

- Et élimine la base en scindant la liaison glycosidique qui l’unit au désoxyribose.

Les différents types d'ADN glycosylases plus ou moins spécifiques d’un type particulier de base altérée, ont été identifiés :

- Le passage d’un C vers U correspond de l’élimination hydrolytique du groupement amine de la cytosine, - 8-oxoguanine provient d’une altération par oxydation des radicaux d’oxygène libre,

- Méthyl adénine produit par le transfert d’un groupement méthyl.

Provoque une distorsion dans la géométrie de la double hélice et peut être identifier par un enzyme de réparation.

Chez la bactérie E.Coli les deux brins se distinguent par la présence ou l’absence de groupement méthyle . Le brin parental est méthylé alors que le néoformé ne l’est pas immédiatement.

Réparation des erreurs :

Une paire de base mal assortie provoque une distorsion dans la géométrie de la double hélice qui peut être identifiée par une enzyme de réparation.

Chez E.coli par exemple mon enzyme c’est elle qui est l’élément de la partie du nucléotide. Chez E.Coli les deux brins se distinguent par la présence ou l’absence de groupement méthyl. Le brin parental possède des groupements méthyls lié à cette adénosine, tandis que le brin néoformé reste non-méthylé pendant un certain temps après la réplication.

Le système de réparation parcourt l’ADN avant cette méthylation, continuera à être identifié par l’enzyme qui élimine et répara.

Réparation des ruptures des deux brins :

Les rayons X et gamma et les particules libérées par les atomes radioactifs sont désignées comme radiations ionisantes parce qu’ils produisent des ions en traversant la matière.

Chaque minute, des millions de rayons gamma traversant le support quand les radiations de ce type rentrent en collision avec la molécule d’ADN et brisent souvent les deux brins de la double hélice.

Dans les cellules de mammifère, la voie la plus fréquente est l’union des extrémités non homologues. Un complexe de protéine réuni les extrémités rompues de duplex d’ADN et catalyse une série de réactions qui unissent les extrémités rompues.

Lorsqu’il y a déficience entre les différents enzymes, le processus de réparation n’aura pas lieu ce qui signifie une forte probabilité de maladies et en l’occurrence le cancer.

Les risques liés au soleil sont particulièrement bien illustrés par une déficience génétique récessive rare dans le syndrome de xerodermapigmentosum (XP)

Les victimes du XP possèdent un système de réparation défectueux incapable d’éliminer les segments d’ADN

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endommagés par les rayons UV

Il en résulte que les individus avec XP sont très sensibles à la lumière solaire : même une exposition très courte indirecte au soleil peut induire l’apparition de tâche pigmentées sur les parties exposées de l’organisme et augmente fortement le risque de cancer de la peau.

Réparation par recombinaison :

Lorsque la détérioration concerne les deux brins lors d’une cassure complexe de l’ADN, la réparation ne peut pas se faire en utilisant l’un des brins matrice modèle.

Dans ce cas, un ADN homologue est utilisé comme une matrice modèle de secours à la condition qu’il soit effectivement présent dans la cellule.

Réponses aux questions 2017 :

• Considérez-vous que la gyrase bactérienne est une topoisomérase spécifique aux eucaryotes ? Oui, elle a besoin de l’ATP et son homologue chez les eucaryotes est la topoisomérase II.

DONC : gyrase (procaryotes) = topoisomérase II (eucaryote)

• Toutes les cellules procaryotes : une seule origine

•Le surenloument positif lorsqu’il devient très très compliqué c’est la topoisomérase II qui va intervenir

Généralement, pour un surenroulement négatif c’est la topoisomérase I qui intervient : elle va couper un brin et il va tourner jusqu’à retrouver son état relâché avant de se (re) souder. 


Le brin retardé va se retourner, changer d’orientation pour reprendre la direction du brin avancé. Ainsi le dimère pourra continuer à transcrire. L’ADN polymérase ne peut pas se déplacer dans deux sens car c’est un dimère (donc que dans le sens 5’ → 3’) 


• Les fragments d’Okazaki sont synthétisés par l’ADN polymérase III (profite des amorces de la primase). 


• Pour le brin : il n’y a qu’un seul brin avancé (une seule amorce)

• On a une réplication bidirectionnelle de l’ADN : on a un complexe qui se déplace dans un sens et un autre qui se déplace dans le sens opposé

Les fragments d’Okazaki synthétisés par l’ADN polymérase III qui a profité des amorces de la primase. 


• Le chlorure de césium est utilisé comme un gradient ‼

ENZYMOLOGIE : Inhibiteurs compétitifs :

- Pas de liaison covalentes

- Entrent en compétition avec le substrat - Réversibles

Inhibiteurs non compétitifs :

- Irréversible à concentration enzymatique fixe - En cas d’ajout d’enzyme : redevient réversible

La TRH : hormone hypothalamique

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- On n’aurajamais :Glu-His-Pro-CO-NH2 - On aura : Glu-His-Pro-NH2.

Le p est pour marquer la cyclisation : permet la protection du peptide (important +++)

Les coenzymes sont des cofacteurs indispensables à toutes les enzymes ? Non

Les enzymes peuvent-être des composés minéraux ? Non, ce sont des composés organiques Toutes les enzymes sont fonctionnelles à 37°c

QCM n°21 de 2016 : A. Vrai

B. Faux : on parle de spécificité plus large C. Vrai

D. Vrai

E. Faux : on a parlé du p (cyclisation)

« Bonne chance » ☺

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Références

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