La Lettre du Cancérologue • Vol. XXVI - n° 10 - novembre 2017 | 495
MISE AU POINT
J.Y. Pierga
ADN tumoral circulant, cellules tumorales
circulantes : quoi de neuf ?
Recent advances in circulating tumor DNA and circulating tumor cell research
L. Cabel*, J.Y. Pierga*, F.C. Bidard*
* Institut Curie, Saint-Cloud et Paris.
L
es biomarqueurs tumoraux circulants incluent l’ensemble des biomarqueurs tumoraux détec- tables dans le sang : protéines, ARN, ADN tumoral circulant (ADNtc), exosomes et micro- vésicules, cellules tumorales circulantes (CTC) isolées ou en amas. Les développements récents ont permis de détecter et de quantifier les CTC puis, plus récemment, l’ADNtc, avec la promesse de nombreuses applications cliniques. Revenons sur les développements récents obtenus en clinique avec ces 2 biomarqueurs.Innovations technologiques
Détection des CTC
Après plusieurs années de développement intense, on note une baisse sensible du nombre de publi- cations sur les nouvelles techniques de détection.
On retrouve la distinction classique entre capture utilisant les antigènes de surface des cellules (par exemple, l’EpCam [Epithelial Cell adhesion mole- cule]) et capture utilisant les propriétés physico- chimiques des CTC (par exemple, leur taille ou leur charge électrique), sans que la supériorité d’une approche sur l’autre ait été démontrée. Compte tenu du faible nombre de CTC retrouvées par les techniques habituelles, les approches développées actuellement visent à augmenter l’efficience de la capture des CTC en maximisant l’interaction cellules-système de capture par l’utilisation de puces microfluidiques, augmenter significative- ment le volume de sang analysé en faisant appel, notamment, à des techniques de cytaphérèse, et se dispenser de l’étape de sélection en compensant par une étape de détection complètement auto- matisée (1, 2).
Détection de l’ADNtc
Les conditions préanalytiques font maintenant l’objet de recommandations par divers groupes (3).
Les techniques de PCR numérique en gouttelette (ddPCR), adaptées aux mutations ponctuelles, et celles de séquençage de nouvelle génération (NGS), adaptées à l’analyse de séquences plus larges, sont devenues les standards les plus diffusés pour la recherche en routine des variants rares que repré- sentent les allèles mutés d’ADNtc dilué dans l’ADN normal du plasma. Les principales améliorations du NGS proposées ces dernières années commencent à être utilisées sur de larges cohortes : il s’agit soit d’utiliser des identifiants moléculaires (code- barres) uniques (4), soit de prendre en compte dans l’analyse bio-informatique le bruit de fond
“local” du séquençage (5). Ces types d’approches permettent de multiplier par 10 la sensibilité du NGS classique et devraient devenir prochainement un standard.
On peut par ailleurs souligner que les nucléosomes protègent l’ADN du clivage lors de la mort cellu- laire et qu’à partir de l’étude de la longueur des fragments d’ADN circulant, il semble possible de retrouver les séquences sur lesquelles des protéines étaient fixées (6, 7). La fixation de facteurs de transcription déplaçant les nucléosomes autour desquels l’ADN est normalement enroulé, cet ADN se retrouve plus exposé au clivage : on observe ainsi parmi les fragments séquencés une dimi- nution relative (en taille) des fragments d’ADNtc correspondant aux sites de fixation des facteurs de transcription (séquences enhancer). Cette approche fait appel à une analyse complexe des données de séquençage mais porte la promesse d’accéder, en
“biopsie liquide”, à l’analyse des facteurs de trans- cription actifs.
Résumé
Validité clinique
Biopsie liquide
Les applications des biopsies liquides, qui ont pour objectif de caractériser le génotype ou le phénotype tumoral par analyse des biomarqueurs tumoraux circulants, ont connu un développement majeur grâce à l’analyse de l’ADNtc. La seule indication clinique approuvée par les agences de régulation reste la recherche de mutations de l’EGFR dans le cancer bronchique non à petites cellules (mutations activatrices et de résistance secondaire) [8, 9], mais de nombreux traitements ciblés se développent en utilisant l’ADNtc comme biomarqueur compagnon, ce qui élargira à terme l’utilisation “théranostique”
de l’ADNtc. Les derniers grands essais de médecine personnalisée – par exemple, en France, SAFIR02 ou SHIVA02 – autorisent de plus l’ADNtc comme substitut de la biopsie tumorale. Comme indiqué ci-dessus, les techniques modernes de détection de l’ADNtc ont une sensibilité de l’ordre de 70 à 80 % et une spécificité supérieure à 95 % pour la détection de mutations ponctuelles (variation de nucléotide) chez des patients présentant une maladie métastatique en évolution (10), la proba- bilité de détection étant principalement fonction de la masse tumorale et de la prolifération (et donc fortement corrélée au volume fixant retrouvé en imagerie métabolique par TEP scan).
Les limites de l’ADNtc sont par ailleurs mieux cernées. Il est difficile de détecter l’ADNtc lorsque la tumeur est contrôlée par un traitement, en cas de faible masse tumorale ou de métastases cérébrales exclusives (du fait de la barrière hémato méningée).
Au-delà des simples mutations ponctuelles, il est difficile de détecter des variations du nombre de copies d’un gène : les gains et amplifications peuvent être détectés d’autant plus facilement que le nombre de copies est élevé, mais chercher la perte de 1 ou des 2 copies est plus problématique (cela revenant, schématiquement, à chercher le brin de paille manquant dans une botte de foin). Enfin, ni la composition clonale, ni le contexte épistatique – qui comprend les autres anomalies génétiques présentes dans les mêmes cellules tumorales et qui
“entourent” la mutation ciblée – ne peuvent être
définies précisément avec les analyses d’ADNtc.
Par exemple, un article récent rapportant l’efficacité de l’AZD5363 dans les cancers du sein avec mutation d’AKT a conclu que ce traitement était plus effi- cace quand la mutation s’accompagnait d’une perte d’hétérozygotie à copie neutre (11) : cette analyse, relativement simple sur une biopsie tumorale (avec une cellularité correcte), semble difficilement réali- sable sur de l’ADNtc.
Du fait du développement de l’ADNtc, l’intérêt porté aux CTC comme source d’ADN tumoral a forte- ment diminué. Il n’en reste pas moins que, chez les patients pour lesquels elles sont détectables, les CTC permettent, au niveau génomique, une analyse fine des variations du nombre de copies d’un gène et des interactions épistatiques. Un autre intérêt des CTC est de permettre l’analyse, au-delà du simple ADN, du matériel biologique potentiellement intéressant, tels l’ARN et les protéines. Dans le cancer de la pros- tate, l’étude des CTC a permis d’établir la preuve de concept que la présence de l’ARN AR-V7 (12), issu d’un épissage alternatif du récepteur des androgènes, est prédictive de l’efficacité des hormonothérapies ciblant ce dernier. Le développement clinique de ces tests est en cours, avec des tentatives de détecter directement l’ARN AR-V7 dans le plasma (13). Le principal obstacle au développement de ce type de test prédictif de l’absence de réponse est qu’il n’existe, très logique- ment, qu’un soutien modéré de la part des industriels commercialisant les traitements correspondants.
Valeur pronostique
La valeur pronostique des CTC a été établie il y a plusieurs années dans de nombreux types de cancers métastatiques. Chez des patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique RH+, l’essai fran- çais STIC CTC portait sur le choix du traitement de première ligne (hormonothérapie ou chimio- thérapie) et a randomisé près de 800 malades entre choix du clinicien et décision basée sur le taux (élevé ou faible) de CTC. L’utilisation des CTC a permis de changer le type de traitement initiale- ment prévu par les cliniciens chez environ un tiers des patientes (14). Les résultats d’efficacité seront connus en 2018.
Alors que les cellules tumorales circulantes confirment qu’elles ont un impact pronostique majeur, notamment sur la survenue de métastases, l’ADN tumoral circulant a connu un essor majeur au cours des dernières années. Au delà des applications en routine de biopsie liquide, d’autres utilisations reposant sur le suivi quantitatif longitudinal de l’ADN tumoral circulant sont à l’étude.
Mots-clés
Cellules tumorales circulantes
ADN tumoral circulant Biopsie liquide Biomarqueur circulant
Summary
While circulating tumor cells confirmed their major prognostic impact, especially on metastatic relapse, circu- lating tumor DNA attracted a lot of attention in recent years. Beyond the routine use of circulating tumor DNA as a liquid biopsy tool, other appli- cations based on serial quanti- tative detection are now being investigated.
Keywords
Circulating tumor cells Circulating tumor DNA Liquid biopsy Circulating biomarker
La Lettre du Cancérologue • Vol. XXVI - n° 10 - novembre 2017 | 497
MISE AU POINT
Figure. Impact du compte de cellules tumorales circulantes sur la survie globale dans le cancer du sein (15).
0 1175 9,8 1
1 199 10,6 1,09 (0,65-1,69)
2 59 23,7 2,63 (1,42-4,54)
3-4 47 29,8 3,84 (2,08-6,66)
≥ 5 93 46,2 6,25 (4,34-9,09)
Cellules tumorales
circulantes Patients
(n) Événements
(%) HR
100
p < 0,0001 80
60 40 20
0 12 24 36
Mois
Survie globale (%)
48 60 72
0
≥ 5 CTC 3-4 CTC
2 CTC 1 CTC
0 CTC
Concernant le cancer du sein localisé, une méta- analyse mondiale portant sur le cancer du sein traité par chimio- thérapie néo-adjuvante a été rapportée au congrès de San Antonio en 2016 ; elle démontre que la détection des CTC est un facteur pronostique indépendant des facteurs déjà connus (notamment de la prolifération) pour les survies sans rechute locorégionale, sans méta- stases et globale (fi gure) [15] . En situation de cancer du sein localisé, les CTC correspondent à une “fenêtre d’étude” du processus métastatique qui reste à explorer.
De nouvelles données allant dans ce sens devraient être communiquées par les équipes américaines au prochain congrès de San Antonio. Concernant le cancer de la prostate métastatique, une analyse poolée de plusieurs essais randomisés de phase III rapportée au congrès de Chicago par G. Heller et al. (16) a montré, sur plus de 5 000 patients, que les variations des CTC en cours de traitement sont plus fortement associées à la survie globale que ne le sont les variations du PSA.
La publication écrite des résultats n’étant pas encore disponible, il est diffi cile d’apprécier si ces résultats peuvent faire évoluer les recommandations de la FDA sur les critères à utiliser pour les études cliniques.
Au stade localisé, la détection d’ADNtc est parfois rapportée comme pronostique, mais cet impact pronostique est généralement le résultat d’une asso- ciation forte entre la quantité d’ADNtc et d’autres facteurs pronostiques (taille tumorale et proliféra- tion, essentiellement). Lorsque la tumeur primitive est en place, la détection d’ADNtc n’apporte aucune information sur la présence d’une dissémination à distance, car il est impossible de déterminer l’ori- gine (tumeur primitive ou micrométastases) des fragments d’ADN détectés. La valeur pronostique de l’ADNtc au stade métastatique ne fait par ailleurs
plus débat, mais n’a pas immédiatement d’applica- tion en tant que mesure unique.
Les principaux résultats obtenus avec l’ADNtc concernent sa valeur pronostique dynamique, c’est- à-dire la corrélation entre variations précoces au cours du traitement et effi cacité du traitement. On peut citer, parmi les nombreuses cohortes impor- tantes publiées récemment, l’étude par séquençage d’un panel de gènes de l’équipe de l’hôpital européen Georges-Pompidou (Paris) [17] , qui retrouve que la disparition précoce de l’ADNtc sous la limite de détection est un facteur associé à l’effi cacité de la chimiothérapie dans les cancers bronchiques méta- statiques. De manière intéressante, ces variations précoces sont également observées sous immuno- thérapie, d’après plusieurs études de “preuve de concept” (18) . Dans ce contexte où l’évaluation radiologique est diffi cile, l’ADNtc permettrait ainsi de distinguer facilement et plus tôt vraie progression, pseudo-progression et hyperprogression.
Dépistage et maladie résiduelle
Ces 2 applications reposent sur la détection d’une très faible masse tumorale, que ce soit chez des sujets sains (dépistage) ou après traitement loco régional d’un cancer (maladie résiduelle). En situation de dépistage, l’organe d’origine et les anomalies molé- culaires tumorales qui permettraient de détecter la présence de tumeur ne sont pas connus ; la masse tumorale – qui infl uence grandement la détection d’ADNtc – d’une tumeur primitive en place est cependant relativement plus importante que celle d’une maladie résiduelle.
ADN tumoral circulant, cellules tumorales circulantes : quoi de neuf ?
◆Dépistage
L’utilisation des CTC comme outil de dépistage du cancer fait régulièrement l’objet de campagnes médiatiques en France, mais force est de constater que les données scientifiques disponibles à ce jour en dépistage, essentiellement par la technique ISET (Isola- tion by Size of Epithelial Tumor cells) et pour le cancer bronchique (19), ne correspondent pas au niveau de preuve requis pour une utilisation en routine clinique.
Des études sont actuellement en cours dans le cancer bronchique en France (NCT02500693, NCT02849041), mais leurs résultats ne devraient pas être disponibles avant plusieurs années. Hormis cette exception hexa- gonale, la sensibilité et la spécificité des techniques de détection des CTC sont actuellement considérées comme trop limitées pour le dépistage.
Concernant une éventuelle utilisation future de l’ADNtc comme outil de dépistage du cancer, les techno logies de routine actuelles (NGS, PCR numé- rique) ne permettent pas de détecter des mutations présentes à moins de 0,1 % de fraction allélique dans le sang. Si la sensibilité de ces techniques (probabi- lité de retrouver une mutation donnée dans le sang sachant que le cancer est muté) va de 70 à 80 % chez les patients atteints d’un cancer métastatique en progression, elle est bien moindre dans le contexte du dépistage d’une petite tumeur. Certaines sociétés de biotechnologie visant à utiliser l’ADNtc pour le dépistage de cancer obtiennent cependant des investissements financiers majeurs. La plus connue, américaine, s’appelle GRAIL ; elle a rapporté, lors du dernier congrès américain d’oncologie clinique, les premiers résultats, plutôt décevants, obtenus avec une techno logie moderne (NGS avec identifiant molécu- laire unique) : la sensibilité de leur approche dans une cohorte de patients atteints de cancers métastatiques ne dépasse en effet pas 80 % (20). Il semble donc que des progrès technologiques soient nécessaires pour que l’ADNtc devienne un outil effectif de dépistage dans la population générale.
◆Maladie résiduelle
La détection sensible et reproductible de la présence d’une maladie résiduelle après chirurgie constitue
le “graal” en oncologie. Les techniques de détection de CTC permettent de repérer les patients à risque de rechute, mais l’absence de CTC ne permet pas de conclure à l’absence de maladie résiduelle. Dans ce contexte, les résultats obtenus avec l’ADNtc étaient vivement attendus. Plusieurs études ont montré que de l’ADNtc est détectable dans les suites immédiates de l’opération et que les patients chez qui il est détecté présentent alors un taux de rechute métastatique proche de 100 % (21-23).
L’étude des courbes de survie montre cependant que ces rechutes surviennent quelques mois après le traitement du cancer primitif, ce qui est parti- culièrement inhabituel dans le cas des cancers du sein (21) ou des cancers coliques de stade II (23).
Les rechutes plus tardives, de cinétique “normale”
(c’est-à-dire après quelques années), surviennent chez des patients n’ayant pas d’ADNtc détecté après l’opération. Il semble donc que les patients ayant de l’ADNtc détecté aient déjà des micrométastases en évolution, et que la sensibilité des techniques actuelles de détection de l’ADNtc ne permette pas de détecter la maladie résiduelle.
Conclusion
À ce jour, les CTC n’ont pas d’utilité démontrée en clinique de routine. Il convient d’être très prudent dans l’utilisation et l’interprétation de tests commercialisés sans fondement scientifique robuste. L’ADNtc fait l’objet d’une autorisation dans le cancer bronchique non à petites cellules métastatique dans 2 situations : d’une part, pour la détermination du statut EGFR si une biopsie tumorale n’est pas possible ; d’autre part, pour la recherche de mutations de résistance (principa- lement T790M) dans les cancers présentant une mutation d’EGFR et devenant résistants aux inhi- biteurs de première et de deuxième génération.
Plusieurs essais visant à démontrer l’utilité clinique du suivi longitudinal de l’ADNtc ont commencé récemment ; leurs résultats seront connus d’ici
quelques années. ■
L. Cabel, J.Y. Pierga et F.C. Bidard déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts.
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Références bibliographiques (suite p. 498)
