Influence des sels sur le système oxydant peroxydase + peroxyde d'hydrogène

Thesis

Reference

Influence des sels sur le système oxydant peroxydase + peroxyde d'hydrogène

GOUTNER, Benjamin-Jacques

Abstract Pas de résumé disponible.

GOUTNER, Benjamin-Jacques. Influence des sels sur le système oxydant peroxydase + peroxyde d'hydrogène . Thèse de doctorat : Univ. Genève, 1915, no. Sc. 570

DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:101320

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http://archive-ouverte.unige.ch/unige:101320

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1 / 1

UNIVERSITÉ Og CENÈVB. -

^{F.rcurrÉ nrs Scn:nces}

Laboratoire de Chimie organique

-

Professeur: M; A. Prcrnr

Influence ilBs sels sur lB $ystÈtne

oxJilant leroxyilase * ^peroxyilB

il'hyùrogène

THESE

pnÉsmnrÉn

I r,l

f,tlcultÉ ^ons Sctrcr.tcns Dn L'UMvnRstrÉ on GlnnÈvn

poun _{oBTllNrR. LD cRÀDE}

rn

Docrntn Ès Scrnucns ^pHvsrQUEs

par

Beniamin-Jacques

G{9UTNER

(do Russie)

---1oÈ<9r

oeNÈve

IMPRIMERIE CHAULMONTET, RUr ^{DES ROIS}

1915

Thèse N'670

UNMRSITÉ DE GtrNÈVtr. -

^F,rcurrÉ ne,s ScreNcns Laboratoire de Chimie organique

-

Professeur : M. A. Ptcrnr'

Influence ùes sels sur le systÈme

oxydant peroxyilase --l- peroxyilB il'hyilroUÈnB

THESE

pnÉsntrÉu

I r,l

FAcur,rÉ

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I'UNrvnnsrrÉ

nn

GnnÈys poun oBT&NrR LE GRADE nn DocrouR Ès Scrrr*cns ^pHysrQUEs

I

par

Beniamin -Jacques G9UTNER

. (de Russie)

+o><9r

ceNÈve

IMPRIMERIE.CHAULMONTET, RUE DES ROIS 1915

Thèse N.57O

d

La

Faculté des Sciences, sur

le

préavis de M. le Profes- seur Amé Piçtet, autorise lfimpression de

la

thèse présentée par M. Benjamin-Jacques Goutner, intitulée : Influence des sels

sur le système oxydant perucJldase

,f

peroxyde d'hydrogène, sans exprimer d'opinion sur les propositions qui y sont énon-

cées.

'

_{Cenève, le 15 décembre 1915.}

.

Le Doyen

H. ^FenR.

A

Madame Véra Goufner-Orloff

Le présent travail a été effectué à l'Universlté

de

Cenève dans le laboratoire

de

chimie organique de

M.le

professeur

A.

Prcrer, sous la direction de M. A.

Blcn.

Je tiens ^à exprimer

iii

à Monsieur Bach toute ma recon- naissance pour.les précieux conseils

qu'il a

bien

voulu

me donner pendant lç cours de mes.recherches.

Je me ^petmets d'exprimer aussi

à M. le

professeur A.

Pictet mês sincères remerciements pour le bienveillant intérêt qu'il m'a toujours témoigné.

INTRODUCTION

La vie

animale se caractérise par des processus d'oxy- dation très intenses. La nutrition,

dit

Dticlaux ^1, s'accompagne dans tous les cas de la combustion

de

certaines substances,

qui sont

stables

à la

température ordinaire,

et qqi

sont détruites par la cellule vivante.

Les aliments organiques, graisses, hydrates

de

carbone, matières albuminoïdes y sont oxydés complètement dans un espace de temps relativement court.

M. A. Bach, dans son travail sur le ^u Rôle des peroxydases dans les phénomènes d'oxydation lente, ^2, fait remarquer que les substances organiques

qui

servent d'aliments

à

I'orga- nisme,

et dont

I'oxydation produit de l'énergie, ne sont, en dehors de lui,que trèsfaiblementattaquées par I'oxygène libre, à

la

température ôrdinaire. Même ^placées,

in

vitrô, dans les

conditions de température de réaction et d'oxygénation qui

se trouvent

réalisées

dans

l'organisme, elles

ne sont

^pas oxydées; pour les oxyder, il faut avoir recours à I'oxygène à' l'état naissant

ou

actif. D'autre part, I'oxygène,

qui

circule dans

le

système, se dégage de sa combinaison avec I'héma- globine à l'état moléculaire ou ^passif, et ne possède ^pas plus d'énergie oxydante que I'oxygène de I'air.

'

Il est donc évident que pour effectuer ^les oxydations éner' giques

qui

constituent la base

de la

^plupart des fonctions vitales, I'organisme

doit avôir à

sa dispositidn

une

source abondante d'oxygène actif. En d'autres termes,

il

doit possé- éler le moyen de rendre actif I'oxygène qu'il emprunte ^à I'at- mosphère.

1 Duclaux, Mitobiologie, II P. 566.

2 Bach, Moniteur scientifique, Qnesneville, juillet 1897, p.79.

-6-

On a émis plusieurs hypothèses

pour

expliquer le méca- nisme de cette transformation de I'oxygène passif en oxygène actif.

En 1819 Taddey avait remarqué que la farine de froment bleuit la résine de ^gaïac au contact de I'air, Iorsqu'on ajoute de I'eau à ce mélange.

En

1820 Planchel recherche

la

cause de ce bleuissement de

la

teinture

de

gaiac. Les expériences auxquelles

il

se livra, démontrèrent

que I'air et la

lumière sont incapables à eux seuls de le produire.

Ilreconnut par contre que les racines fraîches de certaines plantes bleuissent liémulsion de gaïac. Ayant constaté que la chaleur détruit I'activité des substances

qui

provoquent la coloration bleue, Planche en avait conclu qu'elles étaient vola- tiles.

Il supposait que le principe actif était un composé de cya- nogène qui existe normalement dans les plantes et qui, sous I'influence de

la

chaleur,

forme de

nouvelles combinaisons ne possédant plus de propriétés colorantes

D'autres faits du même ordre furent observés daus la suite, mais

ce ne fut

que Schônbein

I qui

chercha à donner une explication véritablement scientifique

de

ces phénomènes d'oxydation

Schônbein venait de découvrir l'ozone, dont il avait cons- taté les propriétés oxydantes t1ès prononcées. Ayant remar- qué

Ie

bleuissement énergique de I'émulsion de gaiac sous l'influence de I'ozone,

il

conclut que dans tous les autres cas, le bleuissement était dû à I'ozone, dont la formation était cor- rolaire de toute oxydation lente. Schônbein attribua au suc frais de certains végétaux

qui

bleuissent Ia teinture de gaiac, une action catalytique particulière, à Iafaveur de laquelle I'oxy- gène passif acquerrait les propriétés de I'ozone. Celui-ôi, qui

1 Planche 1,, Pharmac., 1820, t. VI, p.6.

1 Schônbein,./oarnalfiir prakt. Chen., t. c. v., p. 198 (1868).

7

rêsulterait de la décomposiiion

de la

molécule d'oxygène ^en pârties' égales d'ozone et d'antazone, formerait avec la résine de gaiac un composé de couleur bleue, désigné par

le

nom d'ozonide. Schônbein ne manqua pas de constater que I'action de ces sucs'était très fugace et disparaissait lorsqu'ils étaient exposés au soleil ou soumis ^à l'ébullition

En

1872 Struvel, et plus tard Clermont et Chantard, firent quelques expériences relatives à

Ia

transforrnation du pyra- gallol en purpurogalline sous f influence de

la

gomme ara- bique et de quelques liquides tels qùe

la

salive, le sang, etc.

Mais

I'idée

de I'intervention

d'un

ferment oxydant dans ce

phénomène ne se

fit

^{pas encore jour.}

En

1883 Hikorkuro _Joshida découvrit que Ie noircisse- ment à I'air de la laque japonaise était provoqué par un fer- ment soluble

qu'il

réussit

à

séparer et auquel

il

attribua un

pouvoir

oxydant en se basant sur quelques expérienc€S'âv€c le suc de I'arbre à laque.

En

1892 Jacquet ¹ montra que les tissus du poumon, du

rein, du

muscle

de

cheval, oxydent

I'alcool

benzylique et I'aldéhyde saliôylique,

même

quand

ils ont été

congelés, réduits en bouillie ou traités par I'eau phéniquée

à2

^olo,tan-

dis qu'ils cessent d'agir après avoir été ihauffés à l'ébullition.

En 1893 Bertrand reçut du Tonkin un échantillon de latex pur de I'arbre à laque et institua des recherches

qui lui

per- mirent d'établir d'une manière certaine I'existence

d'un

fer- ment oxydant;

II

isola le ferment et détermina les conditions de son'action.

Pour isoler le ferment, on mélange le latex avec 5 à 6 fois son vôlume d'alcool à 95 ^0/0, le ferment, insoluble ^dans I'alcool fort, se précipite.

On jette sur une toile fine ^et on'délaye Ie précipité resté sur le filire à plusienrs reprises dans I'alcool en filtrant chaque fois.

1 JWémoires de la soci{té de Bio\ogie,9e série, t. x. L L; p. 56 ^(1892).

- 8'-

Le précipité est repris par I'eau. distillée froide,

il

s'y,dis- sout à I'exception

$'un

^{faible résidu}

noir qu'on

sépare par filtration. On reprécipite la liqueur par un grand excès d'alcool, on filtre et on dessèche le précipité dans,le

vide.

^.

C'çst

geJte substance

qu'on

appelle

la

laccase.

Voici

la composition que Bqrtrand attribue au

produit

quril.a étudié sous.le nom de,laccasse : ^r

Humidité (dosée _à

f tZO";

^{pour 100}

^z

^7,40

Gomme (arabane et

galactane)

84,95

.

^{Laccase (N}

:

0,40 pour

100)

2,SO

Cendres 5,17

^.

Pour établir avec certitude le potrvoir oxydant de

la

lac-

case, Bertrand a choisi des corps facilement oxydables: l,hy- droquinone

et le

pyrogallol.

A la fin de

I'expérience, on qxtrait _{les gaz} pour procéder à leur analyée. euand on emploie llhydroquinone, on

yoit

_{la solution}

_se

_colorer

_en

rose pour.

foncer de plus en plus, puis apparaître des lamelles cristal- lines.

On

conState que I'oxygène

a dispafu du

ballon. Le liquide exhale une odeur de quinone; quant au précipité, il.

est constitué par de la quinhydrone. La laccase.a donc pro- voqué l'oxydation de I'hydroquinone. Si on la fait bouillir au préalable,

la solution

d'hydroquinone peut être agitée pen- dant.plugieurs jours à I'air sans absorber des quantités nota-

bles

dloxygènq..

jj

Avec

le

pyrogallol,

on

obtient

un

précipité

de

purpuro- galline. En même temps on reconnait que I'oxygène a disparu et qu'il a été remplacé, en grande partie,

par du g.r c"ib"-,

ruque, _s It

y

^a

donc

là, dit Bertrand,

un

échange gazeux qui ressemble

en

quelque sorte

à

une respiration artificielle, èt peut-être ieprésente.t-il

un

phénomène très.

voisin

de ceux qui se passent dans Ia,regpiration-des végétau1. ^>

; ...'.

.!..i l

1 Annales de chinie et de phy.qiqu.e, ite série, t, 12, p,, 128 (l8g?).

o

-9-

Ayant prouvé lrexistence

de

l.a laccase dans

un

grand nombre de végétaux, Bertrand donna aux ferments

de

^cette catégorie Ie nom d'oxydases.

En

outre de I'hydroquinone et du pyrogallol, la laccage est capable d'oxyder I'acide gallique, le tannin, les amines aromatiques et I'acide iodhydrique.

Bertrand ¹ rechercha :quel était I'agent actif de I'oxydase.

Dans ce but,

il

calcina le ferment oxydant de I'arbre à laque.

L'analyse des cendres y décela une Quantité relativement considérable de manganèse, soit 2,5 pour 100

du

poids total

des cendres

Restait à savoir si c'était

là

une simple coïncidence

ou

^si I'activité du ferment était iiée à la ^présence du manganèse.

Pour résoudre cette question, Beitrand isola Ia laccase de la luzerne, qui est très pauvre en manganèse, et il essaya son pouvoir oxydant sur une solution d'hydroquinone.

Ce

pouvoir oxydant s'étant trouvé être très faible, Ber- trand ¹ ajouta à la laccase des sels de manganèse, ce

qui

eut

pour résultat

d'augmenter cônsidérablement I'absorbtion .d'oxygène, comme le démontrent les chiffres suivants:

Oxygène absorbé:

1) sel de manganèse

seul

^0,2 cma

2) laccase

seule

^{0,3 cm3}

3) laccase additionnée de sel de

Mn

6,3 cm3

Le

pouvoir oxydant est donc en rapport direct avec la teneur en manganèse

du

mélange oxydant. Bertrand l fitres- ,sortir que le manganèse ne

lui

paraissait pouvoir être rem- r:lacé dans I'oxydase,par aucun autre métal, même par Ie fei.

Bertrand ² chercha encore à se rendre compte

si

certains :sels

de

manganèse

ne

^{possèdent pas.,}

par

eux-mêmes, la

propriété .

de

transporter I'oxygène

iur

cartains composés organiques. L'expérience démontra que clétait

le

cas. Tous

I

Bertrand, Académie des sciences, t.724, p.1034 (1897).

2 Bertrand, Académie des sciences, t. 124, p.1355 (1897).

_10_

les sels manganeux

ont

montré.la façu{té de fixer I'oxygéne Iibre sur l'hydroquinone.

u Si.l'on veut admettre, dit lf auteur, que les sels de manga- nèse en solution aqueuse sont partiellement hydrolysé, c'est- à-dire transformé par fixation d'eau

en un

mélange d'acide libre et de protoxyde de manganèse:

R"Mn+H'O-R"H2fMnO

On

se rendra très

bien

compte du rôle des sels manga- neux dans les expériences précédentes.

,

On ^sait que le protôxyde de manganèse s'oxyde au con- tact de I'air.

Au

cours de cette oxydation, la molécule d'oxy- gêne libre Oz, €St, d'après Bertrand, nécessairement scindée

en

deux atomes, atomes

non

saturés,

et par

conséquent actifs, c'est-à-dire capable d'eiercer une action oxydante éner- gique: I'un de ces atomes se porte sur une molécule de pro- toxyde de manganèse pour donner du bioxyde:

MnOf

Oz

:

MnOz

f ^O

^tandis

^que

I'autre peut se

fixer

indifféremment

sirr

une nou'velle molécule de protoxyde

ou sur un

autre corps oxydable.

A son tour le

bioxyde

de

manganèse

est

attaqué par I'acide R"Hr,

ii

y

a

de nouveau mise

en

liberté d'un atome, d'oxygène et régénération du composé primitif :

RlH,+MnOz:R"Mn+O+HrO

On voit que, d'après Ia théorie de M. Bertrand, Ie manga- nèse serait donc le véritable principe actif de I'oxydase, celui qui fonctionne

à la fois

comme activateur et cômme con- voyeur de I'oxygène.

Mais

des

faits furent

découverts qui ietèrent quelques doutes sur la validité ^de cette interprétàtion.

Sarthou

r,

Slowtzow 2

et

lssaiew 3 préparèrent des

oxy-

t Journal ^de pharmacie et de chimie, XI, 482.

'

^{Zeit, f.} physiol. Chenie, XXI, 227 (1900).

3 Zeit, f. physiol. Chemie,45, 331 (1905).

- ^1t -

dases exemptes

de

manganèsè,

mais

contenant du,

fer ef

dont I'action était identique à celle des oxydases de Bertrand qui contenaient du manganèse. De plus Issaiew çonsiata ^que

les

sels de manganQse n'exerçaient aucune influence sur son oxydase à base de fer.

ll fut établi

aussi

par

Rosenfeldr,

de

Stôcklein ²

et

par Bach et Tcherniak ³ que la peroxydase, dont les relations très étroites avec les oxydases sont indéniables, ne contient ni fer

ni

manganèse.

Enfin

^{Bach a réussit}

à

purifier des oxydases retirées de champignons de façon à en éliminer complètement le fer et le manganèse, sans avoir affaibli beaucoup leur puis- sance oxydante. Contrairement

à la

théorie

de

Bertrand le manganèse n'est donc ^pas le principe actif de la laccase, Mais si les métaux lqurds ne sont pas nécessaires pour la manifes- tation ^de I'action oxydasique, à quoi faut-il attribuer Paccélé- ration

de

I'oxydation,

en

présence

de

certains sels ? Estce l'action du ferment lui-même qui est accélérée par les sels ou bien

le

sel ne fait-il qu'accélérer la transformation' ultérieure des produits d'oxydation déjà formés ?

Pour résoudre cette question, Bach r

fit

I'expérience sui- vante:

une

solution d'oxydase

de

champignons purifiée a

été additionnée de pyrogallol et le mélange a été traité ^par un courant d'air. Lorsque

la solution eut pris une

coloration jaune prononcée,

la

moitié

de la

solution

a

été soumise à

llébullition

pour

détruire I'oxydase et après refroidissement les deux portions ont été additionnées de quantités égales de sulfate d'alumine. Dans

les

deux cas, la marche de la trans- for'mation

du

^produit d'oxydation jaune en purpurogalline a

1 Oxydase aus Retlischmurzel, St-Pelersbourg ¹⁹⁰⁶ (thèse).

2 Contribution à l'étude de Ia peroxydasa, Genève 1907 (thèse).

3 Berichle der d. Chem. Ges,, 41,2345 (1908).

a Berichte der d. Chent. Ces., 43,364 ^(1910).

5 Archives des sciences physiques et natu,relles,30, 152 (1910).

-t2-

.été exactement la rnême. D'où

il

résulte que c'est Ia deuxième supposition qui se trouve confirmée.

En même temps Bach ¹ énonça une théorie qui donne une tout autre interprétation des faits observés. Le trait essentiel de cette théorie consiste dans la supposition que la molécule êntière d'oxygène libre se combine avec les substances faci- lement oxydables

pour

donner un peroxyde labile. La subs- tance

difficilement

oxydable

par

I'oxygène

libre,

s'oxyde facilement par ce peroxyde.

Soit

A

une substance facilement oxydable,

par

exemple I'essence de térébenthine. B une substance se trouvant mélan- gée à celle-ci et ne pouvant, à elle seule être oxydée par l'oxy- .gène

libre

que très lentement.

Au

contact avêc I'oxygène A

'se combine avec une molécule d'oxygène qui a subi préala- blement une scission partielle

* O

O

-,

^et

^{il en}

^résulte

un

peroxyde AOz. Celui-ci réagit avec

B

en

lui

donnant la moitié de I'oxygène additionné:

AO'+B AOfBO:

La

molécule de I'oxygène O

:

O subit grâce à l'énergie libre des corps oxydables

une

scission incomplète en

-

^O

-

^O

-.

^Ce proupe s'additionne à toutes les substances oxy- .dables indépendamment de leur nature chimique, en donnant des peroxydes dans lesquels la moitié de I'oxygène est très faiblement liée. C'est cette partie de l'oxygène

qui

se trans- porte facilement sur d'autres substances oxydables.

.

D'après cette théorie, I'action de la ^{phénolase 1} se produit d'après le même schéma d'après lequel se produisent toutes .les oxydations lentes.

'

Biochemisches Cehtralblatt,Bd.l, Nos 11 et 12,15mai et ljuin (1903)

t _{Dans son mauuel} Die Fermente untl ihrc Wirhunsen. Onnen- ,heimer propose de donner à Ia laccase le nom de phénolas"e.

_13_

La

phénolase se combine avec

|oxygène de l'air

^pour-

donner un peroxyde intermédiaire,labile qui oxyde ensuite le phénol se. trouvant en sa présence.

Gependant Bertrand 1a _cru

voir

une nouvelle preuve ^de sa théorie dans

le fait

que

les

acides exercent une action paralysante sur la laccase.

En

partant de I'idée que la ^laccase est un sel.de manganèse d'un acide organique laible RHz, on pouvait prévoir que tout acide plus fort que le complexe RHz, devait s'emparer du manganèse de la laccase pour former un sel stable et incapable de

donier

lieu ^à la série de transfor- mations

qui,

d'après Bertrand, expliquent

le

mécanisme ^de.

I'action oxydasique. On aura par exemple, âvec I'acide chlor- hydrique, la réaction suivante:

RMnf2HCl:RH'+MnCl2

Comme I'activité du complexe RHz est très faible,

on

pour- rait également s'attendre à ce que la laccase

fût

très sensible aux acides. En faisant agir de

la

laccase sur une solution à

20lo de gaïacol additionnée de quantités croissantes d'acides, Bertrand a en effet constaté qu'une quantité d'acide sulfurique correspondant

à

une

dilution

dlune demi,molécule-gramme d'acide sulfurique dans 1000 litres d'eau, arrête I'action de la laccase au ^1,'zoooo. Ayant repris l'étude de cette question, Bach et Sbarsky ¹ ont tout d'abord relevé que Bertrand n'a pas tenu compte du

lait

que I'acidité du milieu peut retarder ou arrêter complètement l'oxydation des phénols indépendamment de I'action qu'ils peuvent exercer sur lâ laccase elle-même. Pour

se fâire une idée de I'action des acides sur la laccâse, il fallait donc étudier séparément ces deux facteurs.

..

^{r_C. R.} dp l'Académie des Sceences, t. 115, p.340 et Annale de l'Ins- titut Pasteur, t. 21, p. 673 (1907).

.1 ^De l'influence des acides et des alcalis sur la phënolase et la pero- xydase, par B" Sbarsky (thése), Genève 1911.

-.14

^,

'Les lecherches étendues que:Bach

et

Sbarsky

ont.insti-

.tuées avec

'

I'ci>tydase des champignohs ont déinontré:

1o que de petites quantités d'aiides,:loin de pâralyser I'ac, tion de l'oxydase, l:accélèrent

rrotablement

^:

' "2o qùe

,les ,quantitês d'acides, nécesÉaires ,pôùr,airêter complètemeht I'actibn d'une quantité donnée,de ferinent'soiit très considéiables'et dépassent, suivant'la nature dès acidds,

5

à 100:fois: le poids du ferrnent emplôyé, comme

le

moniie

le

tableau suivant

i

.

Dose'mortelle poui 0,02 g. de'phénolase

Acides:

sullurique chlorhydriquc oxalique

citrique

lactique

grarnmes:0,134 0,109 0,135 3,904 7,0i0 gr.équiv.: 0,0027

^0,0029

30

que les

quantitês 'dtacides nécessaires

pour

arrêter complètement I'action

d'une quantité

donnée

de

ferment 'varie _avec la nature des phénols sôumis à I'oxydation. Ainsi, pour supprimer totalemeirt I'action oxydante ^de ta phenoh$é :sur des quantités équivalentes d'hydroquinone, de pyrogallol

et de

galacol;

il a fallu

employer

les

quaritités suivantes .d'acide sulfuriQue:

Hydroquinpne i

0,0989 gr. HzSOa

Pyrogallol

0,134

.

^>

Caiacol , ^0,245

^>

,

Les

résultats

de

ces, recherches ont .enlevé toute 'base expérimentale

à

llhypothèse

de

Bertrand

en

même temps .qu'ils

ont

fait,surgir des problèrnes nouveaux. Ce

qui

étalt particulièrement intéressant, c'était de rechercher les causes .des variations des doses paralysantes d'acides en'fonction ..des substrats soumis à l'oxydation par

la

phénolase. Pour expliquer ces variations,

deux

hypothèses se présenteht à

l'esprit: ou bien le fermênt connu sbus le nom de'lâcCase ou -phénolase _{serait en.} réalité un mélange

de

plusieurs ferments

*pécifiques se comportant différemmént aùec les acides;'ou

-

^{15 -._}

bien

les variations observées seraient dues

aux

caractères propres des substrats dont I'oxydabilité serait modiTiée dans des proportions différentes par les acides.

Pour

élucider

ce

problème, Bach ¹

et

Maryanovitch onl institué des recherches

qui les ont

conduits à

la

conclusion

que c'est la

:première alternative

qui

répond

à la

réalité.

Toutes les tentatives d'isoler par précipitation fractionnée ou par I'action ménagée des acides I'une ou I'autre des oxydases ,spécifiques supposées exister dans Ia phénolase, soit de sup- prirtrer

I'une

des fonctions

de

I'oxydase sâns

en

détruire toutes les autres, ont complètement échoué.

D'autre part, pour éviter I'action

par trop

énergique des acides sur Ia phénolase, ils les ont remplacés, dans l'étude ^de I'influence du milieu sur I'oxydation des différents substrats, par des sels neutres. Les résultats

qu'ils ont

obtenus ont de nouveau démontré que, toutes choses égales d'ailleurs,

I'in-

fluence

des

sels varie avec

Ia

nature

des

substrats. C'est .ainsi, par exemple, que le chlorure de calcium retarde

I'oxy-

dation

du

gaiacol par

la

phénolase

(-

^{74 o/o),} mais accélère

I'oxydation de I'orcine

(+

234 ^0/0). Le sulfate

de zinc,

par .contre, accélère I'oxydation

du

gaïacol

(+

42 ^o/o)

et

retarde -celle de I'orcine

(-

37 ^o/o), etc.

Bach et Maryanovitch expliquent ces faits en admettant que.les sels forment avec les substrats des complexes dont

les

propriétés, entre autres I'oxydabilité, diffèrent

de

celles des substrats primitifs.

Un

grand nombre de faits tirés de la chimie des composés complexes organo-minéraux militent ^en faveur de cette interprétation. Bach et Maryanovitch formulent leur conclusion en disant que l'influence spécifique des sels sur I'action de la phénolase résultent

non

pas des propriétés 'du ferment, mais de celles des substrats.

I

Contribation à l'étude des

.de la phénolase (thèse), Genève I913.^ph[nonènes

de spéciJicité dans l'action

-16-

D'après Ia théorie de Chodat et Bach, théorie-qui s'appuie sur un.-grand nombre dpr-.{aits;

la

laccase

ou

^phênolase est constituée par.un _système oxygénase

f,

péroxydase.

L'oxy-

génase est.un corps termolabile

qui

absorbe lloxygène avec

fprmaiion de

peroxydes.

La

peroxydase accélère ltaction oxydante de ces peroxydes comme Ie sulfate ferreux accélère l'action oxydante

du

peroxyde d'hydrogène.

Il

était intéres- santde.fechercher quglle serait lfinfluence des sels sur cha-

cun

d.es éléments de ce système oxydant, et.,notamment sur:

la peroxydase qui se laisse facilement isoler à liétat physiolo- giquement pur, c'est.à-dire,

ne

contenant.

ni

oxygénase, ,ni aucun autre fermgnt. Monsieur A..Bach a bien voulu me pro- poser d'étudier c-ette question, et les recherches auxquellàs ^je, me suis

livré

sous sa direction constituent I'objet du préqent

travail.

j

Dans la première partie de'ce travail, j'ai

tout

dlabord étu- dié I'influence

du

chlorU.rq de calcium, du sulfate de manga- nèse et du sulfate derzinc sur I'oxydation de l,hydroquinone, du gaiacol

et du

pyrogallot par

le

système peioxyd.ases _-1.- peroxyde dlhydrogène en fonction _de

la

concentration des sels et en fonction de

la

concentration

du

ferment. A titre de comparaison, j'ai

fait

une série d'expériencei avec de la phé- nolase en merapplochant autant que faire se pouvait des con- ditions "d'gxydation que

j'ai

clioisies

pour les

expériences principales.

Dans

la

seconde partie

du

travail,

j'ai

_{répété les mêmes} expérlences avec de la peroxydase purifiée par ultrafiltration d'après.la méthode de Bach.

PREMIERE PARTIE

Expérlences avec la peroxydase purlfiée par slmple préctpitailon.

CHAPITRE I

tlrtraction

de

la

peroxydase.

La peroxydase employée ^danS toutes les expériences qui vont être décrites a été extraite du rhizome de raifort.

Deux kiiogr. de raifort jeune et bien lavé ont été hachés à

la machine et mis à macérer avec 600 cm3 d'eau..Au bout de

24

heures,

le

mélange

a

été soumis

à la

presse

et

I'extrait obtenu ⁽⁸⁰⁰ cm) a été traité avec son volume d'alcool à 98 ^o/0, abandonné

au

repos pendant 16 heures et

filtré. Le

Tiltrat clair,

qui

contenait la majeure partie de

la

peroxydase de la plante, a été précipité par 3 fois son volume dralcool à 98 ^o/0.

Après 24 heures de repos,

le

précipité a été recueilli sur un filtre tit lavé ^à I'alcool. Ce premier précipité n'étant ^pas entiè- rement soluble dans I'eâu, a été broyé avec 100 cm3 d'eau, ^la solution a été débarassée des portions insolubles par

filtra-

tion et ^de nouveau précipitée par 400 cm3 d'alcool â 98 ^0/0. Le précipité, bien lavé à I'alcool, a été séché dans le vide sur du chlorure de calcium. De cette manière,

on a

obtenu

3,8

gr.

d'une

poudre jaunâtre

très

hygroscopique

et

entièrement soluble dans I'eau. L'activité de ^cette préparation a été déter- 'minée en faisant agir ^0,05 gr. sqr ¹ gr. de pyrogallol et 0,3 gr.

de peroxyde d'hydrogène daits,50 ^cm3 d'eau et en pesant la'

purpurogallineformée d'ap!è9_fa méthode de Bach et Chodat.

Obtenu 0,158 gr. de purpurog'alline, soit 3,1 mg.

par

mg. de peroxydase employée. L'activité

de

cette peroxydase était 1 fois et ^1/z aussi grande que celle préparée pour

la

première fois par Bach et Chodat.

20

CHAPITRE II

Méthode employée pour

suivre

I'influenoe _{des sels}

sur

le

$,V,s!ème oxydant poroxydase

*

^pproryrlo dthydrogène.

Pqur étudier Finflqençg des divers, sels

sur le

syst.ème

perolydase,f

perpxyde d'hydrogÈne dans I'oxydation de diffé1.ç4!s subgtrals,

il

^{a fallu} adopter une mpthpdg d'analyse applicable à toug les cas. Lorsqu'on oxyde le pyrogallol, I'hy- droquinpne

et:le

^gaiacol

par la

peroxydase

et le

pçroxyde d'lrydrogène,

il

se forme ,d'abord des produits dioxydation colorés (quinonqs) qui se condensent ensuite avec les subs- tances non encpre oxydées'pour former des pro.duits plus ou mains insolubles dans I'eau

:

purpurogalline, quinhydrone, tètragaîacoqurnone. On peut dgnc suivre l'action oxydante en prenant comme point de repère, soit la coloration des mélan- ges en réaction, soit les produits de ôondepsation formés.

Pour duivre lloxydation du pyrogallol, la pesée de la pur- purogalline, oui. est peu soluble dans l'eau froide, donne de très bons résultats. Mais avec l'hydroquinone

et le

gaiacol,

les

résultats

sont

beaucoup moins bons: C'est

pour

cette raison,que i'ai

dt

recourir au dosage colorimétriqUe deq pro- duits d'oxydation primaires qui sont encore entièrement solu:

bles dans I'eau.'Comme pour les dosages colorimétriqup I'ho- mogénéité de liquides colorés est une condition essentielle;

il

^a fallu choisir les concentrations de ferment et de substrals de telle sorte que la. formation de produits de condensation peu solubles ne

vint

pas troubler I'opératipn.colorimétrique.

Après

un

certain nombre d'expériences prélimimaires, j'ai adopté le mode d'opération suivant:

Toutes les expériences

ont

éte effectuées dans des tubes

-21 -

de colorimètre de

2

centimètres

de

diamètre et de

20

centi- mètres de hauteur. Dans les tubes disposés en série,

j'ai

_intro-

duit un

mélange de 0,0001 gr. de peroxydase, de 0,001 gr.- mol. de substrat de 0,0002 gr.-mol. de peroxyde d'hydrogène et des quantités croissantes de sels de 0,0002 à 0,0010 gr.-équi- valent dans 20 cm3 d'eau. Comme coloration étalon

j'ai

pris pour le dosage celle que le perodyde d'hydrogène produisait dans les conditions de I'expérience en agissant sur le substrat en dehors de I'intervention de la peroxydase et des sels.

Toutefois, dans le cas du gaïacol

qui

n'est point attaqué

par le

peroxyde d'hydrogène dans ces conditions,

j'ài

étê

obligé de prendre pour unitÉ de comparaison

la

coloration provoquée par les quantités indiquées

de

peroxydase

et

de

peroxyde d'hydrogène en I'absence des sels.

En

outre des essais-étalons, des .essais-témoins

ont

êté institués avec ^le peroxyde d'hydrogène et les sels en I'absence de peroxydase

et

avec

le

peroxyde d'hydrogène et

la

peroxydase rendue inactive

par

l'ébullition en I'absence de sels.

Les expériences ont été faites à la température ordinaire et

Ieur durée

a

été

de t

^heure, comptée depuis

le

moment de I'addition du peroxyde d'hydrogène au mélange.

Au

bout de ce temps, tes teintes ont été égalisées dans tous les tubes en laissant couler

de

I'eau pure, au moyen d'une burette, dans les tubes

dont

la coloration était plus intense que celle du tûËe-étalon. D'après les quantité,

d'."u

ajoutées, on pouvait facilement calculer

les

intensités de coloration relatives des produits d'oxydation

Mes expériences ont porté sur

trois

substrats

:

le gaiacol, I'hydroquinone et le pyrogallol, et sur

4

sels

: le

chlorure de calcium, Ie sulfate de manganèse, le sulfate de zinc

et

sulfate d'alumine.

Dâns les tableaux

qui

suivent,

j'ai

_{consigné les résultàts}

obienus avec la première concentration de péroxydase.

- ^22.-

T.tslrlu

No 1

fnfluenôe du chlorure de calcium

Peroxydase 0,0001 gr.,'peroxyde d'hydrogène 0,0002

gr.-

mol., substrats 0,0001 gr.-rnolécules, chlorure de calcium quan- tités croissantes de 0;0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

'

Intensitês relatives de coloration

Substrats

Gaïacol ^{0 0} 0

H

I

0

1

1,40 2 2,60 ,15 1,90

1,

1,60,

2,25 3,30

1;40 2,05 2r95 1,25 1,70 2,45

On voit que,le chlorure de calcium qui, à lui seul, n'accé-' 1ère pas I'action oxydante

du

peroxyde d'hydrogène sur Ie.

gaiacol, accélère au contraire de 25

à

40 ^0/o celle

du

syStème peroxydase

f

^peioxyde d'hydrogène. Avee I'hydroquinone

et le

pyrogallol,

dont

I'oxydation est notablemênt accélérée par'le chlorure de calcium dans les mêmes

conditions,'ii

sé'

produit une superposition de I'action des systèmes oxydants sels

f,peroxyde

d'hydrogène

et

peroxydase

f

^peioiyde

d'hydrogène. On constate ici que les nombreb obtenus rlans I'action simultanée' de ces deux systèines, est pôur'ôhaque concentration, inférieure

à la

somme des nombres Que ^les' deùx systèrires ont fourni en agissant séparément.

Li

^cause

probable de'ce phénomène sera discutée plus loin.

Sans ^peroxydase Avec peroxydase'

sans Sel

gr.-équivaient CtCl2 0,000? 0,0006 0,0010

Sans gr.:équivalentCacl2

Sel 0,0002 0,0006

-23-

Tlst-elu

No ²

.

^Influence

du sulfate

de manganèse

Peroxydase 0,0001 gr., peroxyde d'hydrogène 0,0002

gr.-

moléc., substrats 0,001 gr.-molécule, sulfate

de

^manganèse

quantités croissantes de 0,0002 ^{à 0,0010} gr.-équivalent.

I ntensités relativ ^es de co loration

Substrats

0,0006

Gaiacol Hydroquinone

Pyrogallol

1,00 1,05 l,2O lr25 ^1,25

Les résultats ci-dessus confirment les observations ^faites avec le chlorure de calcium.

:

_{TABLEAU No 3}

.

Influenoe du gulfate de zinc

Pero:iydase ^0,0001 gr., peroxyde d'hydrogène 0,0002

gr.- mol.,

substrats 0,001 gr.-moléc., sulfate

de zinc

^quantités

croissantes de 0,0002 a 0,0010 gr.-équivalent.

Intensités relatives ^d'e coloration

Sans peroxydase Avec peroxydase Subàtrats gr.-équival, ZnSOI gr.-équival. ZnSOr

0,0006 0;0010 0,0006 0,0010

1 1 1

0

1 1

0

1

I

0 0 0 ^{1 1,10} ,20

,30 ,85

1,26 1,50 1;05 1,15 1,25 lr70 1,75 1 95

sans sel

Gaiacol Hydroquinone

Pyrogallol

0 1,75 1,10

0 3,50 1,75

0 5,50

4e5

1

1,50 1,70

1,50 2,00 1,70

1,50 4,59 2,10

1,50 6,50 2,80 Mêmes observations ^que pour les résultats du tableau No 1.

Sans peroxydase Avec peroxydase

gr.-équival. MnSOr o,ooo2l0,0006lo,oolo sans

sel

gr.-équival. MnSOa o,oooz

I o,oooo

I

sans sel

Tlsleeu

No 4

fnfluenos

du

suffate d.,aluminium

Peroxydase 0,0001 gr., peroxyde d,hydrogène 0,0002 gr._

mol., substrats Q001 gr.-moléc., sulfate d'aluminium quantités croissantes de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

-24-

Intensités relatives de coloration Avec

gr.-équiv. Alg(SOl)a sans gr,-équiv. Al2(SOq)3

sel 0,0010

Substrats

Gaiacol

0,0002 0,0006

0,35 7,00 7,00

0,001

Hydroquinone Pyrogallol

1

1,50

l,4o

De tous les sels examinés, seul

le

sulfate d'alumine s'est trouvé accélérer I'action oxydante

du

peroxyde. d'hydrogène sur le gaiacol. Mais en se superpo.ant à I'aciion o*yAantË Ou

système peroxydase

f

peroxyde d'hydrogène,

I'action

du sulface d'alumine

a

produit, non pas une accélération, r.nais

un retard absolu de I'oxydation. Dans Ie cas de l,hydroqui-

llne

et du pyrogallot, it.

y a

purement

et

simplement éffet additif de l'action oxydante des deux systèmes pour toutes les concentrations de sulfate d'alumine employées.

0

I

1

Ar22 3,50 3,50

0,70 7,75 8;00 0,45 .5,00 4,00 o;50

1

Sans peroxydase

sans

sel ^0,0002 Q,0006

-25-

CHAPITRE iII

Elxpériencet""";"";;ljlir:ï*concentrâtioû'

Le fait que, dans l'action simultanée des systèmes

sel

_-[- peroxyde d'hydrogène

et

peroxydase

f

^{peroxyde d'hydro-}

gène sur les substrats,

ily

à eu superposition dei deux actions ayant pour résultat dans la plupart des cas un retard manifeste

de

I'oxydation, pouvait s'expliquer,

soit par

le.partage des substrats entre les deux systèmes oxydants,

soit par

I'effet des sels sur

la

peroxydase. La première supposition pouvait

à

peine entrer

en ligne de

compte, puisque les substrats étaient toujours employés

en

excès

et

que par conséquent, rien n'empêchait I'oxydation de se poursuivre jusqu'à l'épui- sement complet des deux systèmes oxydants. Restait donc la seconde supposition, l:effet des sels sur Ia peroxydase. Dans I'espoir d'obtenir des données de nature

à

_ieter quelque

lu-

mière sur cette question,

j'ai

_répété

_les

expériences décrites plus haut en variant la concentration de la peroxydase. Les ex- périences ont été faites avec des concentrrtion, de peroxydase allant de 0,0001 à 0,0005 gr. dans 20 cm3. Mais pour nL

p"t

trop encombrer mon travail de tableaux,.je relate ci-après les résultats extrêmes, c'est-à-dire ceux obtenus avec 0,0005 gr. de peroxydase air lieu de 0,0001 gr., toutes choses étarit reitées égales d'ailleurs.

Tlelenu

No b

Influence du

sulfate

de manganèse

Peroxydase 0,0005 gr., peroxyde d'hydrogène 0,0002

gr.-

tnol.,

substrats 0,001 gr.-molécule,

sulfate:de

mangarièse quantités croissantçs de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

Sans peroxydase

-26-

I ^{nte nsitë s re lat iv es de c o lo r atio n}

Substrats

Caiacol Hydroquinone

Pyrogallol

gr,-équival, MnSOe 0,0002 0,0006

0 0

1,00 0,15 1,15 1,15

Avec peroxydase

gr,-équival. MnSOI

0,0006 0,0010

1,15 1,25 1,25 1,60 1,60 1,60 2,00 2,05 2,05 sans

sel 0

1 1

1 1

3,25 2,25 0 ,20 ,25

En

comparant les nombres consignés

dans ce

^tableau- avec ceux

du

tableau N0

2, on

note que, pour

le

gaiacol, I'augmentation de la concentration de la peroxydase du simple au quintuple n'a en rien modifié I'influence du sulfate de man- ganèse sur le système: dans les limites de l'erreur d'expérience, I'accélération de I'oxydation est restée la même dans les deux cas. La même remarque s'applique aussi à I'oxydation de I'hy- droquinone

et du

pyrogallol, avec cette différence

que

le retard relatif s'est maintenu dans les mêmes limites, malgré l'accélération absolue déterminée

par

l'augmentation

de

la concentration de la peroxydase.

T.reI-eÀ,u No ⁶ fnfluence

du sulfate

de zinc

Peroxydase 0,0005 gr., peroxyde d'hydrogène 0,0002

gr.-

moléc., substrats 0,00l gr.-molécule, sulfate de zinc quantités croissantes de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent,

Intensités relatives de co lo ration

Sans peroxydase Avec peroxydase Substrats

Caiacol Hydroquinone

Pyrogallol

gr.-équivalent ZnSO+

gr,-équival.

0,0010 0,0002

0,0010 0,0006

sans sel

1

2,5O 2,60

I

3,00 2r25 0 5;50 2,95 0 3,50 1,80 0

I

1 0,0002

0 1,75 1,15

1

4,00 2,65

1

2,75 2,65 sans

sel ^0,0006

27-

L'augmentation de la concentration de

la

peroxydase dur

simple au quintuple a eu pour ^effet d'abolir I'accélération pro- duite par

le

sulfate

de zinc sur I'oxydation du

gaïacol par I'intermédiaire

de la

peroxydase

moins

concentrée (50 ^0/0, voir tableau N0 3) et d'accentuer le retard ^{dans le cas de} I'oxy-' dation de I'hydroquinone ^et du pyrogallol.

TesteAU No ⁷

fnfluence

du sulfate d'aluminium

Peroxydase 0,0005 gr., peroxyde d'hydrogène 0,0002 gr.-' mol., substrats 0,001 gr.-moléc., sulfate d'aluminium quantités croissantes de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

I ntensités relatives de co loration

Sans peroxydase Avec peroxydase Substrats gr,-équiv. Als(SO+).q sans gr.-équiv,AIg (SOr)g

sans

sel ^{0,0003 0,0010} sel 0,0006

Gaîacol Hydroquinone

Pyrpgallol

2,50 2,25

"

Comme pour le sulfate de manganèse (tableau No 5) l'aug*

mentation de la concentration de

la

peroxydase'n'a pas mo- difié sensiblement le retard exercé

par

le sulfate d'aluminiumr sur la peroxydase 5 fois moins concentrée (tableau No 4).

0

1 1

0,60 0,32 1

0,11 4,00 3,00

0,0006

0,20 7,55 7,00

2,50 0,65 3,50 8,25

0,0010

0,62 5.25 12,00

28

CHAPITRE IV

lkpériences

_avec

la

phénolase

-

^{- I} contribution à l'étu_de des phénomènes de spécificité dans I'action

"de la phénolase. (Thèse 1913)

Les expériences décrites jusqu'ici

ont

démbntré

que

le

"chlorure ^de calcium, re sulfate de manganèse et Ie surfàte de :zinc, qui n'exercênt, pendant la durée àe I'expérience, aucune

"action accélératrice sur l'oxydatigg du gaiacol par le peroxyde .d'hydrogène, accélèrent notablement-l'oxydition

âe

rnérn.

,substrat par le système peroxydase

f

peroxyde d'hydrbgène

"(Tableaux Nos

l,

2 et 3). Dans tous les autreé cas, aussi

îien,

pour le gaiacol que pour lrhydroquinone.et le;iryrogallol, il y 'a superpostiton dg I'acrion du sel et de celle de la peroxydasÀ,

superpo.sition ayant pour résultat un retard de l,oxydaiion. Ce retard trouve son expression _{dans le} fait que l,actiàn des deux 'facteurs (sel et peroxydase) âgissant,simultanértrent

sur

les ,substrats en présence de peroxyde d'hydrogène, est inférieure à la somme de leur acticins sépârées.

iorri.'pour

l'influence ,des sels sur la phénolase, nous nous trouvon.

i.i.n _,rré;;;;;

.de certains phénomènes

de

spécificité

liés

à'

la

naiure des substrats. Les mêmes sels, agissent _{dans des} conditicins iden- tiques, accélèrent

ou

n'accélèrent pas.,I'action oxydante du système peroxydase

f

peroxyde dlhydrogène.

Toutefois ces phénomènes de spécificité sont d?un autre

"ordre que ceux observés par Mlle Maryanovitch ¹ avecla phé- nolase. En examinant de plus près les conditions de ces expé- riences, i'ai ^relevé qu'elle

a

préparé sa phénolase d,ap1èJ la 'méthode de ^{Bach en} soumettant du suc de Lacterius vallereus

-29-

à Ia précipitation froctfônnée par I'alcool en présence de sulfate.

de magnésie.

ll

en résulte

que la

phénolase

ainsi

préparée.

devait contenir âes quantités plus

ou

moins notables de ce.

sel. Or ^la présence de sulfate de magnésie pouvait contrecarrer ou au contraire favoriser I'action des sels que

Mlle

Maryano- vitch a employés.

C'est ôn

partant

de

ces considérations que

je _me

suis décidé à répéter partiellement les expériences de Mlle Marya- novitch en me servant d'une phénolase préparée par un autrê.

procédé.

Deux kilogrammes de champignons (Lacterius vallereus), récemment cueillis ont été broyés dans une machine à hâcher,.

la pulpe obtenue (700 cms)

a

été mélangé avec son volume d'eau préalablement chauffé à 200 dans une capsule de porce__

laine, et

le

mélange

a

été chauffé au bain-marie

à la

même température pendant 3 minutes. La tyrosinase contenue dans.

la

pulpe

a été

complètement détruite, mais I'extrait obtenu s'est trouvé être très riche en ^phénolase.

L'extrait, filtré à traveis un linge, renfermait des substances.

pectiques et gommeuses

qui

rendaieni longue

et

difficile la,

purification ultérieure

du

ferment.

Le

suc obtenu

(l

^{litre), a}

été rnélangé avec

1

litre d'alcool et abandonné pendant 24 heures

à

lui-même.

Au

bout

dp

ce temps

il

s'est produit un précipité abondant, contenant en majeure partie des substances peu solubles dans I'eau. Le liquide

filtré

a été additionné de- 3 volumes d'alcool et abandonné à lui-même pendant ₄₈ heures.

Il

s'est formé un précipité

qui a

été séparé par le filtre, Iavé avec 100cm3 d'alcool.et séché dans

Ie

vide

sur

chlorure de calcium. Le précipité sec a été dissous dans 200 cm3 d'eau et-

filtré. La.solution Iimpide et jaunâtre _{obtenue a été} additionnée d'un litre d'alcool à 98 ^0/0. Après 48 heures le précipité formé, a été recueilli sur un filtre, lavé à l'alcool et séché.

On a

obtenu

ainsi

1,25 gr. de phénolase,

qui

éiait très active.

30-

,

Avant de procéder âux expériences, j'ai déterminé i'activité

"de la phénolase obtenue.

1

centimètre cube d'une solution, 'contenait 0,000.1 gr. du ferment a donné, avec

l9

^{cm3 d'une}

'solution contenant 0,726 gr. de pyrogallol, une coloration iaune accentuée après

5

^minutes.

Dans les

mêmê conditions, -0,0005 gr. de phénolase ont donné, après

3

heures,

un

dépôt

de purpurogalline.

On

pouvait donc concidérer

le

ferment obtenu comme très actif.

Pour étudier I'influence du chlorure de calcium, du sulfate de manganèse,

du

sulfate de zinc et du sulfaie d'aluminium

sur

I'oxydatiôn

du

gaiacol,

de

I'hydroquinone et

du

pyro- .gallol sur la peroxydase, j'ai procédé de

la

manière suivante:

Une série de flacons Erlenmeyer de 100 cm8 de capacité, munis de bouchons percés de deux trous et portant des tubes d'adduction et d'abduction, a été disposée en batterie reliée à

une trompe à eau. Chaque fiole

a

reçu 50 cms d'eau distillée renfermant des quantités déterminées de ferment, de sel et de :substrat.

La quantité de ^phénolase a été clans chaque cas de 0,0001 gr., celle du substrat de 0,001 gr.-molécule; les quantités de sels allaient en croissant de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

Les fioles chargées et réunies à I'aspirateur, j'ai _fait passer

un

courant

d'air:purifié

par

la

^potasse caustique et I'acide sulfurique jusqu'à ce'que les liquides se soient colorés suffisa- ,ment pour permettre un dosage colorimétrique exact.

Pour effectuer les dosages j'ai _prélevé sur chaque fiole ^des portions de 5 cm3, que j'ai introduites dans des tubes colori- 'métriques et,

à

I'aide d'une burette,

j'ai

_{ajouté de l'eau} aux 'essais jusqu'à ce que la teinte fût uniforme dans tous les tubes.

'Comme coloration étalon,

on

a

pris

dans chaque série celle

que

0,0001

gr. de

phénolase produisait

en

agissant sur 0,001 gr.-molécule

de

substrat dans 50 cm8 d'eau, dans ^les conditions ^des expériences. D'après les volumes d'eau ajoutés

-31 -

:aux essais pour égaliser les teintes,

il

était facile

de

calculer les intensités de coloration servant de 'mesure des ^processus -d'oxydation. _Je les

ai

expiimées numériquement en les rap- portant à la teinte étalon, prise pour unité. En outre de ^I'essai étalon,

il

a été

fait

dans chaque série des essais de contrôle .comprenant.

1o Lrri:essai qui renfermait 0,001 gr.-molécule de substrat avec de'la phénolase rendue inâctive par ébullition et 0,0010 :gr.-éqdivalent de sel.

20 Un essai avec 0,001 gr.-mol. de substrat

f

^{0,0010 gr.-}

.équivalent de sel sans phénolase.

30

Un

essai avec 0,001

gr.-molécule de

substrat seul, sans phénolase,

ni

sel. Ces essais de contrôle avaient pour but de mettre en évidence I'action des sels sur les substrats .en dehors de l'intervention du ferment actif, soit des matières

minérales qu'il contient.

Pour toutes

les

expériences

je

_me suis servi

de

réactifs chimiquement purs.

Les résultats obtenus

sont

consignés dans les ^tableaux :suivants :

TesLe.Au No 8

Influence

du

chlorure

de calcium

Phénolase 0,0001 gr., substrats 0,001 gr.-molécule, chlo- ,rure de calcium 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent dans 50 cm3.

Intensités relatives de coloration

Expér. de contrôle Substrats

b c

Calacol .I-lydroquinone

Pyrogallol

1 1 1

0,6 0

0 0,23 0,53

1r20 1,65 20

1 1

0,49 1,80 2,60

0 1,85 1,30

0 1,85 1,35

1

I .9-Ë6_L=

E'oo ^0,0006

gr.-équivalent de sel

0,0002 0 a

-32-

Expériences de contrôle :

a/

Substr.at

+

^0,0010 gr.-éq.uivalent de sel

f

^phénolase

inactive.

ô/

Substrat

f

^0,0010 gr.-équivâlent de sel.

c)

Substrat seul.

Il résulte du tableau ci-dessus que Ie chlorure de calcium, qui est sans action sur le gaiacpl Jeul, retarde l,oxydation de celui-ci par:'la phénolase. Dans

le

cas de

l,hydroiuinone

_et du pyrogallol, I'effet du sel se-superpôse â celui de la phéno- lase poui aboutir à un retard relatif de I'oxydation.

T,lsle,{u

_No ^g

.

Influence du

sulfate

d.o manganèse

Phénolase, 0,0001 gr., substrats, 0,001 gr.-moléc., sulfate de manganèse 0,0002 à ^0,0010 gr.-équivalçnt dans 50 cms.

Intensitës relatives de co lo ration

Expér. de contrôle Substrats

0,0006 0,001 a c

0 0 0,27 b

Gaiacol.

Hydroquinone Pyrogallol

0,61 _I 0,55 1,50 | ^1,90 0,69

| 0,69

o,55

ll o I

^o

1,8011 1,40 | ^1,30 0,6e

Il 0.42

| 0,45

1 1 1

Expériences de contrôle :

. ^a)

^Substrat

f

^0,0010 gr.-équivalent de sel

-f

^phénolaser

inactive.

É) Substrat

+

^0,00100 gr.-équivalent de sel.

c)

Substrat seul.

Mêmes observations que pour le tableau N0 ^g.

€r

Sd,lJ

Ë'o(J

gr.-équivalent _{de sel}

-

Phénolase, 0,0001 gr., substrats, 0,001 gr.-moléc., _suffate de zinc 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent danslbo cmu.

-33

T,lsreAu No 10

.

_fnfluence

_du

suHato de zinc

In,tensités relatives de co loration

Expér. de contrôle Substrats

Gaïacol

b c

Hydroquinone Pyiogallol

1 1 1

0,83 0,87 0,66

0,83 0,83 0,66

0"

0 0,45 6 0 0 0,5 0

0.

0,56 0,78 0,75 0,70 Expériences de contrôle :

.

a) Substrat

f

0,0010 gr.-équivalent de sel

f

^phénolase

inactive.

â) Substrat

+

^0,0010 gr.-équival,ent de sel.

c) Substrat seul.

On voit d'après ces tableaux que pour les trois sels et les substrats que i'ai ^étudiés, la phénôlasè precipitée sans te côn- cours du sulfate de m'agnésie a donné des rèsurtats

qui

diffè- rent quelque peu

de

cieux obtenus

f",

fufff" Maryanovitch :

Elle a.obtenu, _avec

Ia

sulfate de

zinc, une

accélération de I'oxydation du gaiacol, alors que j,ai.constatê un retard.

Pour les autres substrats, nos résultats concorflent com- .9cF9

Ë,o-()

gr.-équivalent _{de sel} 0,0006jo,oot