lkpériences avec la phénolase

-

^{- I} contribution à l'étu_de des phénomènes de spécificité dans I'action

"de la phénolase. (Thèse 1913)

Les expériences décrites jusqu'ici

ont

démbntré

que

le

"chlorure ^de calcium, re sulfate de manganèse et Ie surfàte de :zinc, qui n'exercênt, pendant la durée àe I'expérience, aucune

"action accélératrice sur l'oxydatigg du gaiacol par le peroxyde .d'hydrogène, accélèrent notablement-l'oxydition

âe

rnérn.

,substrat par le système peroxydase

f

peroxyde d'hydrbgène

"(Tableaux Nos

l,

2 et 3). Dans tous les autreé cas, aussi

îien,

pour le gaiacol que pour lrhydroquinone.et le;iryrogallol, il y 'a superpostiton dg I'acrion du sel et de celle de la peroxydasÀ,

superpo.sition ayant pour résultat un retard de l,oxydaiion. Ce retard trouve son expression _{dans le} fait que l,actiàn des deux 'facteurs (sel et peroxydase) âgissant,simultanértrent

sur

les ,substrats en présence de peroxyde d'hydrogène, est inférieure à la somme de leur acticins sépârées.

iorri.'pour

l'influence ,des sels sur la phénolase, nous nous trouvon.

i.i.n _,rré;;;;;

.de certains phénomènes

de

spécificité

liés

à'

la

naiure des substrats. Les mêmes sels, agissent _{dans des} conditicins iden-tiques, accélèrent

ou

n'accélèrent pas.,I'action oxydante du système peroxydase

f

peroxyde dlhydrogène.

Toutefois ces phénomènes de spécificité sont d?un autre

"ordre que ceux observés par Mlle Maryanovitch ¹ avecla phé-nolase. En examinant de plus près les conditions de ces expé-riences, i'ai ^relevé qu'elle

a

préparé sa phénolase d,ap1èJ la 'méthode de ^{Bach en} soumettant du suc de Lacterius vallereus

-29-à Ia précipitation froctfônnée par I'alcool en présence de sulfate.

de magnésie.

ll

en résulte

que la

phénolase

ainsi

préparée.

devait contenir âes quantités plus

ou

moins notables de ce.

sel. Or ^la présence de sulfate de magnésie pouvait contrecarrer ou au contraire favoriser I'action des sels que

Mlle

Maryano-vitch a employés.

C'est ôn

partant

de

ces considérations que

je _me

suis décidé à répéter partiellement les expériences de Mlle Marya-novitch en me servant d'une phénolase préparée par un autrê.

procédé.

Deux kilogrammes de champignons (Lacterius vallereus), récemment cueillis ont été broyés dans une machine à hâcher,.

la pulpe obtenue (700 cms)

a

été mélangé avec son volume d'eau préalablement chauffé à 200 dans une capsule de porce__

laine, et

le

mélange

a

été chauffé au bain-marie

à la

même température pendant 3 minutes. La tyrosinase contenue dans.

la

pulpe

a été

complètement détruite, mais I'extrait obtenu s'est trouvé être très riche en ^phénolase.

L'extrait, filtré à traveis un linge, renfermait des substances.

pectiques et gommeuses

qui

rendaieni longue

et

difficile la,

purification ultérieure

du

ferment.

Le

suc obtenu

(l

^{litre), a}

été rnélangé avec

1

litre d'alcool et abandonné pendant 24 heures

à

lui-même.

Au

bout

dp

ce temps

il

s'est produit un précipité abondant, contenant en majeure partie des substances peu solubles dans I'eau. Le liquide

filtré

a été additionné de-3 volumes d'alcool et abandonné à lui-même pendant ₄₈ heures.

Il

s'est formé un précipité

qui a

été séparé par le filtre, Iavé avec 100cm3 d'alcool.et séché dans

Ie

vide

sur

chlorure de calcium. Le précipité sec a été dissous dans 200 cm3 d'eau

et-filtré. La.solution Iimpide et jaunâtre _{obtenue a été} additionnée d'un litre d'alcool à 98 ^0/0. Après 48 heures le précipité formé, a été recueilli sur un filtre, lavé à l'alcool et séché.

On a

obtenu

ainsi

1,25 gr. de phénolase,

qui

éiait très active.

30-,

Avant de procéder âux expériences, j'ai déterminé i'activité

"de la phénolase obtenue.

1

centimètre cube d'une solution, 'contenait 0,000.1 gr. du ferment a donné, avec

l9

^{cm3 d'une}

'solution contenant 0,726 gr. de pyrogallol, une coloration iaune accentuée après

5

^minutes.

Dans les

mêmê conditions, -0,0005 gr. de phénolase ont donné, après

3

heures,

un

dépôt

de purpurogalline.

On

pouvait donc concidérer

le

ferment obtenu comme très actif.

Pour étudier I'influence du chlorure de calcium, du sulfate de manganèse,

du

sulfate de zinc et du sulfaie d'aluminium

sur

I'oxydatiôn

du

gaiacol,

de

I'hydroquinone et

du

pyro-.gallol sur la peroxydase, j'ai procédé de

la

manière suivante:

Une série de flacons Erlenmeyer de 100 cm8 de capacité, munis de bouchons percés de deux trous et portant des tubes d'adduction et d'abduction, a été disposée en batterie reliée à

une trompe à eau. Chaque fiole

a

reçu 50 cms d'eau distillée renfermant des quantités déterminées de ferment, de sel et de :substrat.

La quantité de ^phénolase a été clans chaque cas de 0,0001 gr., celle du substrat de 0,001 gr.-molécule; les quantités de sels allaient en croissant de 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent.

Les fioles chargées et réunies à I'aspirateur, j'ai _fait passer

un

courant

d'air:purifié

par

la

^potasse caustique et I'acide sulfurique jusqu'à ce'que les liquides se soient colorés suffisa-,ment pour permettre un dosage colorimétrique exact.

Pour effectuer les dosages j'ai _prélevé sur chaque fiole ^des portions de 5 cm3, que j'ai introduites dans des tubes colori-'métriques et,

à

I'aide d'une burette,

j'ai

_{ajouté de l'eau} aux 'essais jusqu'à ce que la teinte fût uniforme dans tous les tubes.

'Comme coloration étalon,

on

a

pris

dans chaque série celle

que

0,0001

gr. de

phénolase produisait

en

agissant sur 0,001 gr.-molécule

de

substrat dans 50 cm8 d'eau, dans ^les conditions ^des expériences. D'après les volumes d'eau ajoutés

31

-:aux essais pour égaliser les teintes,

il

était facile

de

calculer les intensités de coloration servant de 'mesure des ^processus -d'oxydation. _Je les

ai

expiimées numériquement en les rap-portant à la teinte étalon, prise pour unité. En outre de ^I'essai étalon,

il

a été

fait

dans chaque série des essais de contrôle .comprenant.

1o Lrri:essai qui renfermait 0,001 gr.-molécule de substrat avec de'la phénolase rendue inâctive par ébullition et 0,0010 :gr.-éqdivalent de sel.

20 Un essai avec 0,001 gr.-mol. de substrat

f

^0,0010

gr.-.équivalent de sel sans phénolase.

30

Un

essai avec 0,001

gr.-molécule de

substrat seul, sans phénolase,

ni

sel. Ces essais de contrôle avaient pour but de mettre en évidence I'action des sels sur les substrats .en dehors de l'intervention du ferment actif, soit des matières

minérales qu'il contient.

Pour toutes

les

expériences

je

_me suis servi

de

réactifs chimiquement purs.

Les résultats obtenus

sont

consignés dans les ^tableaux :suivants :

TesLe.Au No 8

Influence

du

chlorure

de calcium

Phénolase 0,0001 gr., substrats 0,001 gr.-molécule, chlo-,rure de calcium 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent dans 50 cm3.

Intensités relatives de coloration

Expér. de contrôle

qui est sans action sur le gaiacpl Jeul, retarde l,oxydation de celui-ci par:'la phénolase. Dans

le

cas de

l,hydroiuinone

_et du pyrogallol, I'effet du sel se-superpôse â celui de la phéno-lase poui aboutir à un retard relatif de I'oxydation.

T,lsle,{u

_No ^g

.

Influence du

sulfate

d.o manganèse

Phénolase, 0,0001 gr., substrats, 0,001 gr.-moléc., sulfate de manganèse 0,0002 à ^0,0010 gr.-équivalçnt dans 50 cms.

Intensitës relatives de co lo ration

Expér. de contrôle

Expériences de contrôle :

. ^a)

^Substrat

f

^0,0010 gr.-équivalent de sel

-f

^phénolaser

-

Phénolase, 0,0001 gr., substrats, 0,001 gr.-moléc., _suffate de zinc 0,0002 à 0,0010 gr.-équivalent danslbo cmu.

-33

T,lsreAu No 10

.

_fnfluence

_du

suHato de zinc

In,tensités relatives de co loration

Expér. de contrôle Expériences de contrôle :

.

a) Substrat

f

0,0010 gr.-équivalent de sel

f

^phénolase I'oxydation du gaiacol, alors que j,ai.constatê un retard.

Pour les autres substrats, nos résultats concorflent com-.9cF9

Ë,o-()

gr.-équivalent _{de sel} 0,0006jo,oot

:-34-plètement.1

Il

me semble donc que sous le rapport de I'influ-ence des sels, il. n'y

a

aucune différence essentielle entre ^la phénolase

et le

système peroxydase

-f-

peroxyde d'hydro gène,

1 Une erreur matérielle a fait dire à Mlle Marj'anovitch qué le chlorure de caléium aicélère ltoxydation de I'hydroquinone par la phé-nolase. Il résulte des nombres de-son tableau (thèse, page 23) qqe dans ce cas, comme dans les autres,

il y

a 9n réalité superposition ^{des deux} actions et retard de l'oxydation

Dans le document Influence des sels sur le système oxydant peroxydase + peroxyde d'hydrogène (Page 31-38)