HLBI307 Biologie Moléculaire

(1)

1

Cours de

Biologie Moléculaire

HLBI307

2015-2016 Eric VIVES

eric.vives@umontpellier.fr 2

Plan du cours (8 CM) Structures des acides nucléiques

Sucre, phosphate etbases Double hélice

Propriétés physicochimiques des acides nucléiques Hybridation

Applications Réplication

Mécanismes moléculaires de la réplication chez les procaryotes Réplication chez les eucaryotes

Réparations de l’ADN Recombinaison

3

1866: Gregor Mendel identifie l’existence des gènes et les règles qui régissent leur transmission de génération en génération (hérédité).

Un peu d’histoire…

4

1866: Gregor Mendel identifie l’existence des gènes et les règles qui régissent leur transmission de génération en génération (hérédité).

1869: Découvert par Friedrich Miescher d’un acide faible, la nucléine, dans les noyaux de globules blancs (acide désoxyribonucléique (ADN)).

1900: Wilson remarque que les chromosomes sontidentiques en composition à la nucléine de Miechler.

1909 Levene découvre les nucléotides :hydrolyse basique de l’ADN donne quatre bases différentes (levure).

1928: Griffith découvre la transmission héréditaire d'une souche bactérienne à une autre à travers les générations, et identifie

l'ADN comme le support de cette hérédité.

1938: Hamarsten, Singer et Levene déterminent séparément le poids moléculaire de l'ADN (biréfringence et ultracentrifugation).

1940: Beadle, Tatum et Ephrussi démontrent le lien gène-enzyme (Nobel de médecine et de physiologie en 1958).

Un peu d’histoire…

5

1944: - Avery, MacLeod et MacCarty : ADN : support de l'hérédité.

L'addition d'ADN purifié d'une souche bactérienne à une autre (pneumocoques) confère à cette dernière des propriétés héréditaires différentes caractéristiques de la première.

-Todd réalise la synthèse des désoxyoligonucléotides (prix Nobel de chimie, 1957).

1950: Chargaff découvre la complémentarité des bases de l'ADN dans toutes les espèces

1953: Wilkins, Watson et Crick réalisent un modèle de l’ADN (double hélice composée 2 chaînes antiparallèle de polynucléotides) Watson et Crick déterminent le codage de l'information génétique sous forme de triplets.

(Prix Nobel de médecine et de physiologie, 1962)

1961: Jacob et Monod: ARN messager intermédiaire entre l'ADN et les protéines.

1966: Décryptage du code génétique par Khorana et Nirenberg (codons).

1995: Premier séquençage total : la bactérie Haemophilus influenza (4,5.10⁶ pdbp) 1976: Mise au point du séquençage de l'ADN par Sanger et Gilbert.

1999: Séquençage total du génome de drosophile (160.10⁶ pdbp). 26 juin 2000: Fin du séquençage du génome humain (en avance de 3 ans)

(2900.10^6* pdb pour 2,7 Mds de USD !).

Un peu d’histoire…

* 400 volumes de 1000 pages (20 mètres de rayonnage)

6

1944: - Avery, MacLeod et MacCarty : ADN : support de l'hérédité.

L'addition d'ADN purifié d'une souche bactérienne à une autre (pneumocoques) confère à cette dernière des propriétés héréditaires différentes caractéristiques de la première.

-Todd réalise la synthèse des désoxyoligonucléotides (prix Nobel de chimie, 1957).

1950: Chargaff découvre la complémentarité des bases de l'ADN dans toutes les espèces

1953: Wilkins, Watson et Crick réalisent un modèle de l’ADN (double hélice composée 2 chaînes antiparallèle de polynucléotides) Watson et Crick déterminent le codage de l'information génétique sous forme de triplets.

(Prix Nobel de médecine et de physiologie, 1962)

1961: Jacob et Monod: ARN messager intermédiaire entre l'ADN et les protéines.

1966: Décryptage du code génétique par Khorana et Nirenberg (codons).

1995: Premier séquençage total : la bactérie Haemophilus influenza (4,5.10⁶ pdbp) 1976: Mise au point du séquençage de l'ADN par Sanger et Gilbert.

1999: Séquençage total du génome de drosophile (160.10⁶ pdbp). 26 juin 2000: Fin du séquençage du génome humain (en avance de 3 ans)

(2900.10^6* pdb pour 2,7 Mds de USD !).

Un peu d’histoire…

1876 Invention du téléphone 1897 Invention du moteur diésel 1923 Invention de la

Télévision

1933 Invention de l

’avion de ligne

1936 Invention de l’ordinateur

1963 Invention de la souris informatique 1969 Invention du téléphone portable

(2)

7

Caryotype humain:

23 paires de chromosomes

8 11nm

30nm

Niveau de structuration extrêmement élevé

3,4nm 11nm

1µm

30nm nucléosome

Super enroulement Double hélice

noyau protéique

9

L’ADN dans le chromosome

Structure publiée dans Nature 25 avril 1953 Par James Watson et Francis Crick

(Prix Nobel en 1962)

10 Structure publiée dans Nature

25 avril 1953 Par James Watson et Francis Crick

11 Structure publiée dans Nature

25 avril 1953 Par James Watson et Francis Crick

12

(3)

13

14

L’ADN dans le chromosome Equivalence A/T et G/C

15

34Ao

20A^o

16

Le support génétique

grand sillon

17

ADN

groupe phosphate

14 18

Noyau purique (Guanine)

O HO

OH OH*

Liaison β-N-osidique

β-D-ribofuranose Le support génétique

NH₂ O

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

1’

2’

3’

4’

5’

*absent sur l’ADN nucléoside

(4)

19

20

21

22 O

HOCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

2’-désoxyribose

B

HOCH5 ’ ₂_O 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

ribose

B

HO HO OH

ADN désoxyribonucléosides

ARN ribonucléosides

A T G C

A U G C Le support génétique

23 O

HOCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HOCH5 ’ ₂_O 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO HO OH

nucléoside nucléoside

P OH HO

O OH

P OH HO

O OH

Acide phosphorique Acide phosphorique

24 O

OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

OCH5 ’ ₂_O 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO HO OH

nucléoside nucléoside

nucléotide nucléotide

P HO

O OH

P HO

O OH

Liaison

phosphoester Liaison

phosphoester

(5)

25 O

OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

OCH2O

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO HO OH

P HO

O OH

P HO

O OH

O OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

HO P HO

O OH

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO OH P HO

O OH O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO OH P

HO O OH O

OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P HO

O OH

26 O

OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

OCH2O

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

OH

P HO

O O

P HO

O O

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P HO

O O

O OCH5 ’2

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO OH P

HO O O O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

OH P HO

O OH O

OCH5 ’ ₂ 4 ’

3 ’ 2 ’ 1 ’

B

P HO

O OH

5’

3’ 5’

3’

Liaison

phosphodiester Liaison

phosphodiester

27

ADN : support génétique

O HOCH5 ’ ₂

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

5 ’

3 ’

5 ’

désoxyribose

B

28

T δ⁺

δ^- δ⁺

δ^-

δ^- A

Etablissement des liaisons hydrogène

29

T 5’

3’

CH³

HNNH N Etablissement des liaisons hydrogène

A

^δ⁺

δ^- δ⁺

δ^-

δ^- 5’

3’

30

δ^- δ⁺

δ^-

δ⁺

G C

(6)

31

δ-

δ+

δ-

δ+

δ-

δ+

G C

32 - δ

+ δ

- δ

δ+

δ-

δ+

5’

3’

33

Noyau purique

Adenine ADN

ARN NH₂

Adenine

6-amino-purine

HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

34

Noyau purique

Guanine

Guanine ADN

NH2 ARN O

2-amino-6-oxypurine

HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

35

Le support génétique Grand sillon

Petit sillon

5’

3’ 5’

3’

36

Noyau pyrimidique

Cytosine NH₂

O

ADN

ARN Cytosine

2-oxy-4-aminopyrimidine Le support génétique

HN 3

N

2 6

5 4

1

NH 7 N

8

9

(7)

37

HN 3

N

2 6

5 4

1

Noyau pyrimidique

Thymine CH3 ADN

O

O H

5-méthyl-2,4-dioxypyrimidine

38

Le support génétique Grand sillon

Petit sillon 5’

3’

5’

3’

39 l’environnement atomique est totalement

différent selon qu’une protéine interagisse

côté petit sillon ou grand sillon ⁴⁰

Interactions ADN-protéines

41

Interactions ADN-protéines

l’environnement atomique est totalement différent selon qu’une protéine interagisse

côté petit sillon ou grand sillon ⁴²

Noyau pyrimidique

2,4-dioxypyrimidine

Uracile ARN O

O

HN 3

HN

2 6

5 4

1

Thymine

(8)

43

Bases rares (env 50) trouvées chez certains bactériophages

ou dans les ARNt 5-hydroxymethyl

cytosine NH2

O HN 3

N

2 6

5 4

1

CH₂OH

O

5-methyl cytosine NH2

O HN 3

N

2 6

5 4

1

CH₃

Dihydro-uracile O HN 3

HN

2 6

5 4

1

inosine

(6-oxypurine) ⁴⁴

1-methyl-guanine H₂N

O N

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9 H₃C

N₂-dimethyl-guanine N

O HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9 H₃C

H3C

hypoxanthine O HN

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

6-methyl-amino-guanine N

N

N NH

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9 CH3

H

45

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P HO

O OH

Nucléotide monophosphate

46

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P O

O OH

Nucléotide diphosphate P

HO O OH

47

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P O

O OH

Nucléotide diphosphate

Nucléotide triphosphate P O

O OH P HO

O OH

48

O OCH2

5 ’

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

B

HO P O

O OH P O

O OH P HO

O OH

α β γ

O O-CH⁵^’₂

4 ’ 3 ’ 2 ’

1 ’

Adenosine O

HO P O

Adenosine-3’-5’-monophosphate cyclique (cAMP) nucléotide-5’-triphosphate

(9)

49

NH2

O

HO O

OH OH

Noyau purique (Guanine)

Liaison β-N-osidique β-D-ribofuranose Le support génétique

HN

N N

1 N

2 4

3

6 5

7

8

9

50

Adenine Adenosine

Thymine Thymidine

Guanine Guanosine

Cytidine Cytosine Nomenclature bases

Base azotée Base azotée + sucre

51

N⁹(2-hydroxyethoxyl)methyle-Guanine NH₂

O

CH2-O-CH2-CH2-OH

ACYCLOVIR^TM Le support génétique

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

Source de développement de molécules thérapeutiques

52

NH₂ O

HN

N N

N 1

2 4

3

6 5

7

8

9

N⁹(2-hydroxyethoxyl)methyle-Guanine ACYCLOVIR^TM

CH₂ CH2 O CH₂ HO

Source de développement de molécules thérapeutiques

53

Structure de l’AZT et du 3TC

O

O HN

N

Thymidine OH

O CH3

OH

O

O HN

N

AZT OH

O CH3

N3

NH

O N

N

3TC OH

O

S 2

Présence de noyaux insaturés (bases aromatiques)(+++) Présence de liaisons hydrogène (+++) 54

Présence de phosphates(---) Stabilité

Propriétés physicochimiques des acides nucléiques

(10)

55

Liaison H : de 1,5 à 1,8 kcal/mole Appariement A/T (2 liaisons hydrogène; 3,5 kcal).

Appariement G/C

(3 liaisons hydrogène; 5,5 kcal). ⁵⁶

Présence plans de noyaux insaturés superposés (bases aromatiques)

(Forces de Van der Waals)

Liaison H : 1-5 kcal/mole

57

attraction répulsion Forces de Van der Waals

distance 58

34Ao

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

34 A/10=3,4 A entre 2 plans

de pdb

o o

59

attraction répulsion Forces de Van der Waals

60

20A^o

(11)

61

_ ..

.. _ _ ..

_ ..

Présence de phosphates

51

62

_ ..

.. _ _ ..

_ ..

Présence de phosphates

-

Présence de liaisons hydrogène

+

Présence de noyaux insaturés (bases aromatiques)

+

52

63

Stabilisation -  Liaisons hydrogène - Empilement des bases

+

Déstabilisation -  Présence de phosphates

-

Double hélice d’ADN

64

L' ADN est moléculairement dynamique, et peut, sous l’influence de divers facteurs,

changer de conformation,

afin de modifier le rôle fonctionnel associé à sa séquence.

Structure de l’ADN

Ces modifications peuvent favoriser des cassures de l’ADN (et les délétions potentiellement

induites par ces cassures), mais aussi des amplifications,

des recombinaisons, ou des mutations.

65

ADN-A

Enroulement à droite

ADN-B

Enroulement à droite

ADN-Z

Enroulement à gauche

66 10,5 bp/tour de 34 Å

Grand sillon large (11,7Å) Petit sillon étroit (5,7 Å) 11 bp/tour de 31 Å

Grand sillon large (11 Å) Petit sillon inaccessible (2,7Å)

12 bp/tour de 46 Å Petit et Grand sillons

équivalents Poly(GC)2

56

(12)

67

Crystal structure of a junction between B-DNA and Z-DNA reveals two extruded bases

Ha, Lowenhaupt, Rich, Kim and Kim Nature 437, 1183-1186 (October 2005)

Z B

B Z B

ADN-Z, riche en GC2, proche des promoteurs, stimule la transcription

57 68

Ha, Lowenhaupt, Rich, Kim and Kim Nature 437, 1183-1186 (October 2005) Skeletal stereo views of DNA.

Red and blue lines connect phosphate groups in Z-DNA and B-DNA, respectively.

a, Front view showing A0 (right) and T0' (left), and the abrupt reversal of helical twist.

Distances between stacked bases in the central region b, Side view with A0 in front.

The deviation in helical axes between B- and Z-DNA is shown.

Z B

69

Ha, Lowenhaupt, Rich, Kim and Kim Nature 437, 1183-1186 (October 2005)

Exclusion de la paire De bases AT à l’extérieur de l’hélice

70

Présent dans l’ADN

«déshydraté»

(cristallographie ?) ou suite à la fixation de

certaines protéines (ADN-polymérases)

Possibilité d’être une structure de prédilection

dans les hybrides ADN-ARN et dans les ARN double-brin

71

Structure de l’ARN

5’…AUGGCUUACGAAUAGCGUAAGCCAGCUUAA…3’

5’ 3’ 5’ 3’

A U A A G G C A U U C G G U

… C G U A A G C C A

5’3’ 5’3’

Séquences répétées-inversées ou palyndromiques

72

ARNt

Structures en tige-boucle (stem-loop)

(13)

73

ARNm

Structures en tige-boucle

(stem-loop) ⁷⁴

Structures en hélice

Rotation de la liaison β-N-glycosidique

Structures en triple hélice

Protonation de N3 requise

(Promoteur C-myc) ⁷⁶

Propriétés physicochimiques

acides des nucléiques

77

TECHNIQUE LA PLUS COURANTE:

ELECTROPHORESE EN GEL D’AGAROSE (polyacrylamide pour tailles < 100 nts)

PRINCIPE:

Migration des molécules dans un gel sous l’action d’un champ électrique Comme les acides nucléiques ont une charge anionique par nucléotide

la migration ne sera dépendante que de la taille de la molécule Mobilité électrophorétique de l’ADN

78

Pores de grande taille : 0,15 µm de diamètre 1% agarose Séparation de molécules de grande taille

TECHNIQUE LA PLUS COURANTE:

ELECTROPHORESE EN GEL D’AGAROSE Mobilité électrophorétique de l’ADN

10 pdb correspondent 3,4 nm 1000 pdb correspondent 340 nm

soit 0,340 µm

(14)

79

O

O O O CH ² O

CH ²OR

O

STRUCTURE CHIMIQUE DE L

’

AGAROSE

R = H ou CH ₃ OH

n

D-galactose Anhydro -3,6 galactose-1

Polymère d’environ 120000 daltons 80

Peigne PREPARATION D

’

UN GEL D

’

AGAROSE

Moule

Solution d(température env . 60°C) ’

agarose dissoute à chaud

81

Moule Peigne

Laisser revenir à température ambiante Le gel devient solide

Gel PREPARATION D’UN GEL D’AGAROSE

82

Peigne Puits Moule Gel PREPARATION D’UN GEL D’AGAROSE

Démouler délicatement les puits en retirant le peigne

83

PREPARATION D ’ UN GEL D ’ AGAROSE

Immerger le gel dans le tampon d’électrodes (+BET)

Déposer les échantillons dans les puits

100v .030A

anode +

cathode -

^-⁺

84

Puits

Sous rayonnement U.V. (256nm), le BET inséré dans les plans de bases de l’ADN fluoresce en orangé

ANALYSE D

’

UN GEL D

’

AGAROSE

(15)

85

ANALYSE D

’

UN GEL D

’

AGAROSE

d

Log ( pdb )

x

d1

86

ANALYSE D

’

UN GEL D

’

AGAROSE

x

d

Log ( pdb ) x x

x x

x

d2

87 Log(pdb)x

d

Log ( pdb )

x

x x

x

Dx

ANALYSE D’UN GEL D’AGAROSE

88

FlashGel^™ System (Cambrex)

89

Mobilité électrophorétique de l’ADN Puits

MWM

MWM 21kpb

9kpb

6kpb

2kpb

1kpb

90

Mobilité électrophorétique de l’ADN

Coupure par une nucléase

10kpb 10kpb

10kpb

(16)

91

Mobilité électrophorétique de l’ADN Puits

MWM

MWM 10kpb

10kpb 10kpb

Même masse moléculaire mais mobilité électrophorétique

apparente dépendante de la

structure 3D

21kpb

9kpb

6kpb

2kpb

1kpb

78 92

Présence de chromophores (bases aromatiques) (Tyrosine, Phénylalanine, Tryptophane dans les protéines)

Hyperchromicité de l’ADN/ARN

93

Spectrophotométrie

Protéines ---

DO de 1 pour une concentration de

1,5mg/ml Acides Nucléiques

_______

DO de 1 pour une concentration de

50 µg/ml (dS) 37µg/ml (sS) (1000nts = 150nM)

280 λ in nm

Absorbance

260

94

Le support génétique UV

81

95

Acide nucléique double-brin

(db) ---

Absorbance

λ in nm 260

db sb

Acide nucléique simple-brin

(sb) ____

+30%

Hyperchromicité de l’ADN

96

db sb

dénaturation

Temp (°C) Absorbance (260nm)

t_1/2 100% db

100% sb

50% db 50% sb Hyperchromicité de l’ADN

(17)

97 Temp (°C) Absorbance (260nm)

T_m1/2A Tm1/2B ATTTTAAATTTATAT!

TAAAATTTAAATATA!

A B CGGCCCGGGCCCGCG!GCCGGGCCCGGGCGC!

98

Le Tm augmente avec le pourcentage de GC

99 Env 72% AT Env 26% AT Env 47% AT Env 60% AT

100 Temp (°C) Absorbance (260nm)

T_m1/2

Dénaturation de l’ADN

Renaturation de l’ADN Dénaturation/Renaturation de l’ADN

Processus réversible

101

c_ot Renaturation de l’ADN

Dénaturation/Renaturation de l’ADN

% de dénaturation

100%

50%

0%

Cinétique de réhybridation 102

Dénaturation/Renaturation de l’ADN Facteurs influençant l’hybridation de l’ADN

1) La concentration:

(18)

103

104

105

Paramètre cinétique: c₀t (en mole x sec/L)

Une solution diluée d’ADN incubée pendant un temps important aura la même capacité de réhybridation

à son brin complémentaire qu’une solution concentrée d’ADN

incubée pendant un temps court

Renaturation sur environ 106 2 ordres de magnitude

c_ot

mole x sec /L

% de dénaturation

100%

50%

0%

10⁰ 10¹ 10² 10³ 10⁴

10^-1

10^-2 10⁵

VS40

VS40 4 x 10³ pdb

Τ4

Τ4 1,8 x 10⁵ pdb

ε

^-coli

ε

^-coli^{4,5 x 10}⁶^pdb

Pour une quantité identique d’ADN, plus le génome est grand,

moins on aura de copies des régions complémentaires,

et plus longtemps il faudra pour les réhybrider

107

Colliers de 60 paires de perles

Bracelets de 20 paires de perles

108

c_ot

mole x sec /L

% de dénaturation

100%

50%

0%

10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10³ 10^-2

10^-3 10⁴

ADN fortement répété (30%)

ADN moyennement répété (40%)

ADN faiblement répété (30%)

chez les eucaryotes

(19)

109

2) La température:

Temp (°C) Absorbance

(260nm)

T_m1/2 Dénaturation

Renaturation Zone favorable

à la formation de dS

Zone favorable à la formation

de sS

110

3) La force ionique:

Le support génétique _ ..

_ ..

_ .. _ ..

_ ..

.. _ Na⁺Cl^-

K⁺Cl^-

Na⁺ Na⁺

Na⁺ + Na

+ Na + Na

111

GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC!

3’-CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG-5’!

5‘- -3’!

3’-CGTAATCCGATATAATGCTATACGTAGGCATAACGG-5’!

5‘- -3’!

GGCAATACGGATGCATTATAGCCTAATGC

112

5‘- -3’!

3’-CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG-5’!GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC!

5‘- -3’!

A A!

A T!

TGC

113

Dénaturation/Renaturation de l’ADN Applications

PCR : Polymerase Chain Reaction

1) Chauffage à 95°C 2) Amorces + Refroidissement à env. 50°C

Amorces

114

Sujet sain

5‘-GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC-3’!

Sujet malade

5’-GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC-3’!

3’-CGTAATCCGATATAACGTAGGCATAACGG-5’!

Exemple d’application

Identification d’un sujet porteur d’une maladie génétique

(20)

115

Sujet sain Sujet malade

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane

Identification d’un sujet porteur d’une maladie génétique Dénaturation/Renaturation de l’ADN

116

Sujet sain

Sujet malade

mutation

117

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane Incubation avec sonde complémentaire

radioactive ___*

Incubation avec sonde complémentaire radioactive ___*

5’-AGGCTATAATGCATCCG-3’!

5’-…GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC…-3’!

3’-…CGTAATCCGATATAACGTAGGCATAACGG…-5’!

5’-…GCATTAGGCTATAATGCATCCGTATTGCC…-3’!

3’-…CGTAATCCGATATTACGTAGGCATAACGG…-5’!

5’-AGGCTATAATGCATCCG-3’!

118

Sujet sain

Sujet malade

mutation

*

119

Dénaturation totale de l’ADN Dénaturation totale de l’ADN Adsorption de l’ADN sur membrane Adsorption de l’ADN sur membrane Incubation avec sonde complémentaire

radioactive ___*

Incubation avec sonde complémentaire radioactive ___*

Lavage de la membrane à une température appropriée Mesure de la radioactivité présente sur le filtre

mutation

*