Correction juin 2003
Pour répondre à ce sujet, il fallait connaître un peu de la biologie de C. albicans.
- Pour démontrer l'import d'oligonucléotides, il fallait incuber les cellules de C. albicans en présence d'oligonucléotides divers marqués avec un traceur radioactif. Il suffit ensuite de mesurer la radioactivité incorporée dans les cellules après centrifugation et rinçage de celles-ci (ou bien regarder la disparition de la radioactivité dans le surnageant !). (1.5 point)
- L'addition d'un inhibiteur de la respiration (comme l'oligomycine) permet d'établir la nécessité d'une source d'énergie (l'entrée d'oligonucléotides est alors abolie). (1.5 point)
- Pour évaluer la stabilité des oligonucléotides, il faut récolter les cellules à différents temps les casser et suivre les oligonucléotides radiomarqués. Cela se fait simplement en faisant migrer l'extrait cellulaire sur un gel d'acrylamide, sans oublier un témoin qui permet de voir où migre l'oligonucléotide. Eventuellement, il est possible d'utiliser des oligonucléotides froids et de les suivre par hydridation avec une sonde spécifique. (2 points)
- Les mêmes expériences refaites avec des cellules cos7 permettent de voir que moins de radioactivité est incorporée par unité de cellule (que l'on peut mesurer de différentes manières !). (1 point)
- Un modèle de la structure 3D est établie grâce à des programmes informatiques. (1 point)
- La culture de Candida à différents pH en présence d'oligonucléotides permet de montrer qu'à pH4, sa croissance est inhibée en établissant une courbe de croissance (on peut par exemple suivre à la cellule de Thomas, le nombre de cellule par unité de volume). Un témoin de cellules cultivées dans les mêmes conditions mais sans l'oligonucléotide est nécessaire. Par contre, l'addition de l'oligonucléotide aux cellules cos7 n'a aucun effet. (1.5 point)
- Pour montrer, l'inhibition de la traduction, il faut un extrait acellulaire de Candida qui permet d'assurer la traduction (extrait acellulaire classique). Sur cet extrait, on peut mesurer l'incorporation d'acides aminés radioactifs (en mesurant la radioactivité présente dans un culot de précipité TCA qui ne précipite que les macromolécules).
L'addition de l'oligonucléotide fait diminuer le taux d'incorporation de la radioactivité par unité d'extrait. (2,5 point)
- Pour vérifier l'absence de complémentarité, il suffit de regarder la séquence complète du génome de Candida albicans qui est disponible en libre accès sur internet ! (1 point)
Les conclusions que l'on peut en tirer :
- L'oligonucléotide joue probablement sur la traduction en se liant à un des composants de l'appareil de traduction, aboutissant à son inhibition. Il n'entraîne pas la dégradation d'un ARN. Cela corrobore le fait que C. albicans ne possède pas de mécanisme type RNAi. (2 points)
- Une application évidente est l'utilisation de cet oligonucléotide dans un but thérapeutique. Mais, plusieurs questions doivent être résolues et limitations comprises avant d'en faire un traitement. Premièrement, seules les infections localisées dans une région du corps à pH=4 seront traitables. Deuxièmement, rien n'indique que l'oligonucléotides pénètrera dans les Candida présentes dans le corps (instabilité de l'oligo à cause d'enzymes présentes dans le corps, inhibition du transport vers et dans les cellules de candida, etc.). Troisièmement, rien n'indique que les cellules du corps humain autres que les cellules cos7 ne sont pas inhibées par l'oligonucléotide ! (4 points)
- On peut envisager d'utiliser une stratégie d'inhibition en utilisant des oligonucléotides, même sur des organismes ne présentant pas de RNAi. C'est la cas d'autres champignons ou protozoaires ! (2 points)
