HAL Id: tel-02902584
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électrochimique à base de polymères conducteurs à
mémoire de forme pour la détection de petites
molécules : application au cas de l’atrazine
Elodie Pardieu
To cite this version:
Elodie Pardieu. Conception et développement d’un capteur électrochimique à base de polymères conducteurs à mémoire de forme pour la détection de petites molécules : application au cas de l’atrazine. Polymères. Conservatoire national des arts et metiers - CNAM, 2010. Français. �NNT : 2010CNAM0738�. �tel-02902584�
ÉCOLE DOCTORALE ED 415
EA 4131
THÈSE
présentée par :
Elodie PARDIEU
pour obtenir le grade de :
Docteur du Conservatoire National des Arts et Métiers
Discipline/ Spécialité
: Sciences et Techniques Analytiques
Conception et développement d’un capteur
électrochimique à base de polymères
conducteurs à mémoire de forme pour la
détection de petites molécules : application au
cas de l’atrazine
THÈSE dirigée par :
Madame PERNELLE Christine Professeur titulaire de chaire, CNAM RAPPORTEURS :
Madame PICHON Valérie Maître de conférences, ESPCI Monsieur DE OLIVEIRA Pedro Professeur, Université Paris-Sud
JURY :
Monsieur DALKO Peter Directeur de recherche CNRS, Paris Descartes Monsieur EVERS Michel Chercheur associé confirmé, Sanofi-Aventis Monsieur GUY Alain Professeur, CNAM
Monsieur MIOMANDRE Fabien Maître de conférences, ENS Cachan Monsieur REMITA Samy Professeur, CNAM
ÉCOLE DOCTORALE ED 415
EA 4131
THÈSE
présentée par :
Elodie PARDIEU
pour obtenir le grade de :
Docteur du Conservatoire National des Arts et Métiers
Discipline/ Spécialité
: Sciences et Techniques Analytiques
Conception et développement d’un capteur
électrochimique à base de polymères
conducteurs à mémoire de forme pour la
détection de petites molécules : application au
cas de l’atrazine
THÈSE dirigée par :
Madame PERNELLE Christine Professeur titulaire de chaire, CNAM RAPPORTEURS :
Madame PICHON Valérie Maître de conférences, ESPCI Monsieur DE OLIVEIRA Pedro Professeur, Université Paris-Sud
JURY :
Monsieur DALKO Peter Directeur de recherche CNRS, Paris Descartes Monsieur EVERS Michel Chercheur associé confirmé, Sanofi-Aventis Monsieur GUY Alain Professeur, CNAM
Monsieur MIOMANDRE Fabien Maître de conférences, ENS Cachan Monsieur REMITA Samy Professeur, CNAM
Les travaux de cette thèse ont été réalisés au Conservatoire National des Arts et Métiers (Cnam) de Paris, sous la direction de Madame Christine Pernelle, Professeur Titulaire de la Chaire de Génie Analytique. Je remercie le Pr. Christine Pernelle pour m’avoir accueilli dans le cadre de cette thèse au sein de son laboratoire et pour m’avoir donné la possibilité de réaliser. Je la remercie également de m’avoir fait profiter de ses précieux conseils au cours de la thèse.
Je remercie les rapporteurs Madame Valérie Pichon, maître de conférences à L’ESPCI, et Monsieur Pedro De Oliveira professeur à l’université Paris-Sud, pour avoir accepté de juger ce travail de thèse
Merci également Monsieur Michel Evers chercheur associé confirmé Sanofi-Aventis, Monsieur Alain Guy, professeur au CNAM, Monsieur Fabien Miomandre, maître de conférences à L’ENS cachan, et enfin Monsieur Samy Rémita, professeur au CNAM pour avoir accepté de participé à ce jury.
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à Peter Dalko, Directeur de Recherche au Laboratoire de chimie et biochimie pharmacologiques et toxicologiques (UMR-CNRS 8601 Université Paris Descartes) pour m’avoir accueilli dans son labo durant cette thèse pour la partie synthèse. Il m’a appris à travailler avec rigueur et passion. Je le remercie pour sa grande disponibilité, et pour m’avoir fait profiter de son expérience scientifique ainsi que pour les nombreuses discussions enrichissantes.
Je remercie également Christophe Védrine et Mathieu Lazerges qui m’ont suivi pendant mes deux premières années de thèse et permis de me lancer sur ce sujet en me faisant profiter de leurs expériences scientifiques, leurs grands conseils, de leur aide précieuse, mais aussi pour tous les bons moments passés ensembles.
Un grand Merci à Fanny Hauquier pour tous ses conseils et son aide précieuse durant cette dernière année. Mais aussi a Francis Garnier et Michel Evers pour tous leurs conseils, et discussions scientifiques.
Je tiens aussi à remercier pour leur précieuse aide, leurs conseils, les discussions (pas forcément scientifique !!!) et surtout leur bonne humeur les membres permanent du laboratoire : Claudine, Christelle, Fanny, François, Jean-Paul, Laurence, Muriel, Patrick, ainsi que le laboratoire de physique.
Bien sur j’ai aussi une pensée pour les anciens ATER (Hélène et Mathieu), les thésards (Morgane, Youssef), et les docteurs (Nicolas, Bruno) avec qui j’ai passé des moments inoubliables.
J’aimerais remercier mes amis, mis amigos et surtout mon Nicolas qui a subi mes sautes d’humeurs mais qui a toujours été là.
Y para terminar muchisimas gracias a mi madre, mi hermano y mis tias que me han apoyado durante todos estos años. Sin ellos no hubiese logrado llegar hasta aqui!!!!
acac : acétylacétonate ACN : Acétonitrile AcOH : Acide acétique AcOEt : Acétate d’éthyle
ADN : Acide désoxyribonucléique AIBN : Azobisisobutyronitrile AME : Amétryne
AMP : Acide mono phosphorique ATZ : Atrazine
CA : Chronoampérométrie CE : Contre-électrode CH2Cl2 : Dichlorométhane
ChemFET : Chemical Field Effect Transistor DMF : Diméthylformamide
DMSO : Diméthylsufoxyde
DOSY : Diffusion Ordered SpectroscopY dppe : 1,3-diphénylphosphinoéthane DDT : Dichlorodiphényltrichloroéthane EDOT : 3,4-éthylènedioxythiophène EGDMA : Ethylène glycol diméthacrylate ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay EtOH : Ethanol
E-T-E : EDOT-Thiophène-EDOT
E-TAA-E : EDOT-Thiophèneacétique acide-EDOT E-TAZ-E : EDOT-Thiophèneazide-EDOT
E-TMeOH-E : EDOT-Thiophèneméthanol-EDOT E-TEtOH-E : EDOT-Thiophèneéthanol-EDOT FET : Field Effect Transistor
IR : Infrarouge
ISE : Ion Selective Electron
ISFET : Ion Sensitive Field Effect Transistor ITO : Indium Tin Oxide
IRTF : Infrarouge à transformée de Fourier GC : Gaz Chromatography
HOMO : Highest Occupied Molecular Orbital HPLC : High Performance Liquid Chromatograpy LUMO : Lowest Unoccupied Molecular Orbital MeOH : Méthanol
MgSO4 : Sulfate de magnésium MIP : Molecular Imprinted Polymer MAA : Acide méthacrylique
MS : Spectrométrie de Masse NBS : N-bromosuccinimide nBuLi : Butyle Lithium NIP : Non Imprinted Polymer
NSMP : Polymère blanc (Non Shape Memory Polymere) ODN : OligoDésoxyriboNucléotide
PANI : Polyaniline PC : Polymère conducteur
PEDOT : Poly(3,4-éthylènedioxythiophène) Phe-An : L-phénylalanine anilide
PPP : Polyparaphénylène
PPV : Polypara-phénylène- vinylène PPy : Polypyrrole
PT : Polythiophène
QCM : Quartz Cristal Microbalance RMN : Résonance Magnétique Nucléaire SAW : Surface Acoustic Wave
SMP : Polymère à mémoire de forme (Shape Memory Polymere) SMZ : Simazine
SPR : Surface Plasmon Resonance TAA : Acide thiophène-3-acétique
TBATFMS : Trifluorométhanesulfonate de tétrabutylammonium TBZ : Terbutylazine
Th : Thiophène
TMeOH : Hydroxyméthyl-3-thiophène TSM : Tickness Shear Mode
UV : Ultra-violet
VC : Voltamétrie cyclique WE : Electrode de travail
1 Les enjeux économiques et de santé publique poussent aujourd’hui les secteurs d’activité comme la santé, la chimie, l’agroalimentaire ou l’environnement, à détecter et quantifier une panoplie toujours plus vaste d’analytes dans des matrices souvent complexes et à des concentrations toujours plus faibles. Ces besoins en matière d’analyse et de contrôle sont renforcés par une pression législative et normative stricte et de plus en plus diversifiée.
Répondre efficacement à ces besoins émergents implique d’accroître sans cesse les performances des instruments analytiques utilisés à ces fins
,
mais aussi de continuellement enrichir et compléter l’existant en développant des technologies analytiques originales et hautement performantes. Ces technologies se doivent aujourd’hui d’être en adéquation la plus étroite possible avec ces nouveaux besoins qui, à court ou moyen terme, deviendront de nouvelles exigences.Ce climat a favorisé l’émergence de diverses méthodologies analytiques et notamment le développement des capteurs chimiques et des biocapteurs qui connaissent, aujourd’hui, un essor considérable. Dans ce contexte, le développement de polymères à empreintes moléculaires utilisés en tant que couche de reconnaissance de ces capteurs, a connu, lui aussi, une très forte progression au cours de ces dix dernières années. En effet, ces récepteurs biomimétiques ont comme propriété de pouvoir mimer le comportement des biorécepteurs naturels. Ces matrices polymères constituent une alternative prometteuse vis-à-vis des biorécepteurs couramment utilisés (par exemple : les enzymes, les anticorps…) de par leur facilité de préparation, de conservation dans le temps, et de faible coût. Ces couches de reconnaissance sont souvent associées aux transducteurs optiques, piézoélectriques et électrochimiques qui conviennent à la reconnaissance des petites molécules, et permettent ainsi d’atteindre de bonnes sélectivités.
Les performances demandées à ces nouveaux outils, en particulier en termes de miniaturisation, de facilité d’utilisation et de coût, ont pour conséquence d’orienter de nombreuses études sur les capteurs vers la transduction électrochimique. Cependant, pour ce type de capteur, comme pour les autres, l’ensemble des travaux réalisés jusqu’à présent décrit des systèmes où la transduction dépend des propriétés de l’espèce à détecter ou d’une sonde greffée à la surface de la matrice du polymère.
2 Pourtant, les performances d’un capteur sont, non seulement liées à la qualité, en terme d’affinité et de spécificité de la couche chimio(bio)sélective et aux qualités intrinsèques du transducteur, mais elles sont aussi étroitement liées à la bonne intégration de la couche de reconnaissance au transducteur. Ainsi, de par leurs propriétés intrinsèques, les polymères conducteurs peuvent représenter un bon candidat, adapté à la conception et au développement d’un modèle de capteur électrochimique intégré. En effet, permettre à la couche chimiosélective d’un capteur à base de polymères conducteurs d’assurer également la transduction, sans que l’étape de reconnaissance ne soit dépendante d’un marquage (analyte redox, ou sonde redox), devient envisageable. Cela permettrait, entre autre, d’étendre les champs d’applications, à un plus large spectre de cibles, en particulier aux molécules de petit poids moléculaire.
Dans notre étude, nous nous sommes intéressés aux molécules possédant un poids moléculaire inférieur à 800 Da et plus particulièrement aux pesticides qui possèdent un nombre limité de fonctionnalités de reconnaissance. Ces petites molécules représentent un défi en terme de détection étant donné l’impact néfaste qu’elles ont sur l’environnement (eau, sol, terre). Il est donc primordial de pouvoir les détecter et les identifier sur le terrain, à l’état de traces et sans nécessité de marquage. Pour cela, nous nous sommes basés sur l’association des propriétés i) de reconnaissance des polymères à empreinte moléculaire et ii) de conduction des polymères conducteurs, pour le développement d’un capteur qui présente à la fois des propriétés de reconnaissance, en gardant une mémoire moléculaire de l’analyte, mais aussi des propriétés de transduction, sans utilisation d’une sonde rédox. Nous démontrerons que les capteurs à base de polymères conjugués à mémoire de forme représentent une approche prometteuse pour la reconnaissance de petites molécules.
Le premier chapitre sera consacré à une étude bibliographique sur les capteurs chimiques et les biocapteurs ainsi qu’à leurs différents constituants i.e. la couche de reconnaissance et le transducteur. Nous nous focaliserons ensuite sur les récepteurs de type polymères à empreintes moléculaires et leur mode de fonctionnement. Nous terminerons ce chapitre en nous intéressant aux propriétés des polymères conducteurs et à leur association avec les polymères à empreintes moléculaires, permettant ainsi d’aboutir à un effet de mémoire moléculaire.
3 Nous introduirons le deuxième chapitre, en présentant la stratégie de développement de ce capteur à base de polymères conjugués à mémoire de forme. Nous exposerons et discuterons nos choix en ce qui concerne les différents éléments qui constituent notre système : la molécule empreinte, les monomères conducteurs, la solution électrolytique. Nous aborderons ensuite l’étude et la caractérisation du pré-complexe de polymérisation, étape critique de la synthèse du polymère à empreintes mémoires, par des techniques spectroscopiques.
Le troisième chapitre sera consacré à la conception du capteur électrochimique. Les conditions de polymérisation, puis le protocole de lavage et de détection seront examinés. Ensuite les performances du capteur en terme de détection de la molécule empreinte seront abordées. L’objectif est d’obtenir un capteur électrochimique possédant à la fois une bonne sélectivité et un faible seuil de détection pour des petites molécules organiques.
Dans le dernier chapitre, nous présenterons nos résultats concernant la synthèse et l’étude de nouveaux motifs de type terthyényle, destinés à améliorer le capteur précédemment développé. Ce type de composé devrait permettre de diminuer le potentiel d’électropolymérisation et de mieux contrôler la stœchiométrie et la répartition des groupements fonctionnels. Nous présenterons d’abord les différentes approches utilisées pour l’obtention de ces motifs. Puis nous décrirons leurs premières caractérisations spectroscopiques et électrochimiques.
Enfin nous conclurons sur l’intérêt de ce type de capteur et discuterons de ses perspectives de développement dans les prochaines années.
biocapteurs : vers les polymères conducteurs à
mémoire de forme
TABLE DES MATIERES
Chapitre 1 : Les capteurs chimiques et les biocapteurs : vers les polymères conducteurs
à mémoire de forme ………..…...………...4
I Les capteurs chimiques et les biocapteurs ... 4
I.1 Les enjeux ... 4
I.1.a Domaine médical ... 5
I.1.b Industries agroalimentaires ... 6
I.1.c Domaine environnemental ... 7
I.2 Définitions ... 9
I.2.a La couche chimio- ou bio-sensible... 10
I.2.a.1 Les biorécepteurs ... 11
I.2.a.2 Les récepteurs chimiques ... 12
I.2.a.3 Les polymères à empreintes moléculaires ... 13
I.2.b Les transducteurs ... 15
I.2.b.1 Les méthodes de transduction optique ... 15
I.2.b.2 Les méthodes de transduction gravimétrique... 16
I.2.b.3 Les méthodes de transduction électrochimique ... 17
I.2.b.3.1 Les transducteurs ampérométriques ... 17
I.2.b.3.2 Les transducteurs potentiométriques ... 18
I.2.b.3.3 Les transducteurs impédancemétriques. ... 19
I.2.b.3.4 Les transducteurs conductimétriques ... 20
I.2.c Le traitement du signal ... 20
II Polymères à empreintes moléculaires ... 21
II.1 Historique ... 21
II.2 Principe des polymères à empreintes moléculaires ... 23
II.2.a Les systèmes pré-organisés ... 25
II.2.b Les systèmes auto-assemblés ... 27
II.2.b.1 Association « Métal-Ligand » ... 27
II.2.b.2 Approche non covalente ... 28
II.2.c Approche semi-covalente ... 30
II.2.d Approche sans monomère fonctionnel ... 31
II.3 Techniques de polymérisation et voies de synthèse des MIPs ... 32
II.3.a Mode de polymérisation ... 32
II.3.a.1 La polymérisation radicalaire ... 32
II.3.a.2 Approche de polymères préformés ... 32
II.3.a.3 La polycondensation ... 33
II.3.b Synthèse des MIPs ... 34
II.3.b.1 La synthèse en masse ... 34
II.3.b.2 Synthèse en suspension en milieu aqueux et non aqueux ... 35
II.3.b.3 Synthèse par précipitation ... 35
II.3.b.4 Synthèse par étapes ... 36
II.3.b.5 Synthèse par fonctionnalisation de particules de silice ... 36
II.3.b.6 Synthèse par voie électrochimique ... 37
II.4 Domaines d’applications ... 38
II.4.a Les MIPs en chromatographie ... 39
II.4.b Les MIPs comme phase stationnaire pour l’extraction phase solide (SPE) ... 40
II.4.c Les MIPs appliqués aux microorganismes ... 41
II.4.d Les MIPs appliqués aux capteurs ... 41
III Conception d’un capteur à base de polymères à mémoire de forme ... 46
III.1 Les conducteurs organiques ... 47
III.1.a Historique ... 47
III.1.b Conduction dans les polymères ... 49
III.1.b.1 Structure des polymères conducteurs ... 50
III.1.b.2 Dopage des polymères organiques conducteurs ... 51
III.1.c Mécanisme de polymérisation ... 54
III.1.d Polymères conducteurs et champs d’applications ... 57
III.2 Développement d’un capteur électrochimique à base de polymères conducteurs à mémoire de forme ... 59
IV Bibliographie ... 63
TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : schéma simplifié du fonctionnement d’un capteur. ... 9
Figure 2 : Exemples de couches sensibles et de modes de transduction associés aux capteurs. ... 10
Figure 3 : détection de l’ion superoxyde O2.- produit par le système enzymatique HX/XOD sur une électrode d’or modifiée par le cytochrome-c. ... 12
Figure 4 : représentation schématique de capteurs, (A) capteur basé sur les anticorps ; (B) capteur biomimétique basé sur le principe d’impression moléculaire. ... 14
Figure 5 : principe du biocapteur pour le dosage du glucose, basé sur une électrode de Pt modifiée avec une membrane Nafion sur laquelle est déposé un gel de laponite permettant l’immobilisation de la glucose oxydase (GOD). ... 18
Figure 6 : représentation schématique d’un ChemFET. ... 19
Figure 7 : histogramme présentant l’évolution durant les 18 dernières années du nombre d’articles (bleu) ; et de brevets (noir) concernant les MIPs. (obtenu par Scifinder avec mot-clé "molecular imprinted polymer" Avril 2010). ... 23
Figure 8 : principe de l’impression moléculaire : (A) association non covalente, (B) association covalente ; (a) pré-complexe entre le monomère fonctionnel et la molécule empreinte, (b) polymérisation avec un réticulant, (c) extraction de la molécule cible avec un solvant, (c’) extraction de la molécule cible par clivage chimique, (d) reconnaissance de la molécule empreinte ; (1) monomères fonctionnels, (2) molécule empreinte, (3) réticulant. ... 25
Figure 9 : représentation schématique de la formation de l’empreinte du phényl-
α
-D-mannopyranoside avec des liaisons covalentes ester-boronate pour la reconnaissance de pyranose. ... 26Figure 10 : (A) molécule créatinine ; (B) formation de l’empreinte de la créatinine complexée au zinc. ... 28
Figure 11 : représentation schématique du MIP théophylline sur une électrode ITO. ... 29
Figure 13 : formation du polymère à empreintes moléculaires du tri-peptide Lys-Trp-Asp par liaisons mixtes covalentes et non covalentes. ... 31 Figure 14 : mécanisme de polymérisation radicalaire. ... 32 Figure 15 : formation du complexe de polymérisation selon l’approche de polymères pré-formés. ... 33 Figure 16 : formation de l’empreinte du cholestérol en présence de cyclodextrines. ... 34 Figure 17 : image SEM 80x de particules de MIP propazine, (A) diamètre inférieur à 45µm ; (B) 45µm< diamètre <100µm ; (C) diamètre supérieur à 100µm. ... 34 Figure 18 : images SEM des polymères MIPs (A) et NIPs (B) obtenus par précipitation. ... 36 Figure 19 : schéma reprenant les étapes en vue d’obtenir un polymère empreinte électrosynthètisé sur une électrode. ... 37 Figure 20 : les principaux domaines d’applications des MIPs. ... 39 Figure 21 : séparation d’énantiomères grâce à des phases stationnaires MIPs : (A) complexe non-covalent entre L-phénylalanine anilide et le MAA ; (B) séparation des énantiomères par HPLC de la L- et D-Phe-An. ... 40 Figure 22 : (A) histogramme représentant l’évolution du nombre de publications de capteurs couplés au MIP (B) proportion des MIPs selon le type de transduction entre 1995 et 2006.128 ... 41 Figure 23 : représentation schématique d’un capteur SPR. ... 42 Figure 24: (A) microélectrode avec un polymère empreinte à la surface de l’électrode de travail (au centre), la contre électrode petit cercle noir et électrode de référence Ag/AgCl grand cercle gris. (B) structure de l’acide 2,4-dichlorophénoxyactétique. ... 43 Figure 25 : principaux conducteurs organiques d’origine naturelle : le graphite, la mélanine. ... 47 Figure 26 : classification des polymères selon leur conductivité en trois catégories : isolants, semi-conducteurs, et conducteurs. ... 50 Figure 27 : structure des polymères (A) système dégénéré, cas du trans-polyacétylène ; (B) système non dégénéré, cas du polythiophéne (a) structure polyaromatique, (b) structure polyquinonique coplanaire. ... 51 Figure 28 : dopage d’un polythiophène par une réaction d’oxydo-réduction représentation schématique du polymère : (A) sous la forme neutre, (B) du polymère sous la forme dopée qui présente une charge positive contre balancée par un contre-ion. ... 52 Figure 29 : structures des polymères à l’état oxydé : (A) système dégénéré, cas du trans-acétylène formation du soliton ; (B) système non dégénéré cas du polythiophène, (a) formation du polaron, (b) formation du bipolaron. ... 53 Figure 30 : évolution du gap pour le polythiophène au cours du dopage. (a) état neutre, (b) état polaronique, (c) état bipolaronique, (d) bande bipolaronique, (e) état quasi-métallique.160 ... 53 Figure 31 : mécanisme de polymérisation du polythiophène de type E(CE)n. ... 56
Figure 32 : mécanisme de polymérisation du polythiophène (a) attaque en position
α
de l’atome de soufre ; (b) attaque en positionβ
de l’atome de soufre. ... 56 Figure 33 : association du concept polymères à empreintes moléculaires MIPs aux propriétés des polymères conducteurs (PCs) obtenant les polymères à mémoire de forme SMP... 59 Figure 34 : illustration du double rôle assuré par le polymère à mémoire de forme : reconnaissance moléculaire et transduction. ... 61 Tableau 1 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt dans le diagnostic clinique. Pour chacun d’entre eux, le mode de détection est indiqué ainsi que le seuil de détection associé. ... 6Tableau 2 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt pour l’industrie alimentaire. Pour chacun d’entre eux, le mode de détection est indiqué ainsi que le seuil de détection associé. ... 7 Tableau 3 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt dans l’environnement avec le mode de détection et le seuil de détection associé. ... 8 Tableau 4 : seuil de détection du capteur conductimétrique pour divers métaux lourds. ... 20 Tableau 5 : énergie des différents types de liaison. ... 27 Tableau 6 : avantages et inconvénients des interactions covalentes et non covalentes dans les MIPs. ... 29 Tableau 7 : exemples de petites molécules organiques et le capteur MIP associé pour leur reconnaissance. ... 45 Tableau 8 : principales familles de polymères conducteurs. ... 49 Tableau 9 : exemples de monomères thiophènes fonctionnalisés. ... 49
4
I
Les capteurs chimiques et les biocapteurs
Les premiers capteurs ayant suscité l’intérêt général, remontent aux années 1960 avec entre autres, les travaux de Clark et Lyons en 1962,1 repris par Updike et Hicks en 1967 sur le développement d’un biocapteur enzymatique,2 destiné à la détection du glucose dans une solution biologique. Les enjeux de société, économiques et normatifs qui touchent aujourd’hui des domaines comme la santé, la sécurité et l’environnement, renforcent les besoins et les contraintes en matière d’évaluation et de contrôle des substances chimiques et biologiques. Dans ce contexte, les capteurs chimiques et les biocapteurs connaissent depuis quelques années une demande rapidement croissante dans des domaines de plus en plus variés comme l’atteste le nombre croissant de publications et de brevets publiés durant ces dix dernières années.3-7
I.1
Les enjeux
Des avancées considérables ont été réalisées au cours des dernières décennies en matière d’analyse et de contrôle. Les techniques spectrométriques, chromatographiques ou bien celles couplées comme la chromatographie associée à la spectrométrie de masse, permettent aujourd’hui la détection qualitative et/ou quantitative, en routine, d’un très large spectre de molécules, que ce soit des molécules organiques ou des macromolécules biologiques, extraites ou non de matrices complexes. Ce sont des techniques performantes, sensibles et fiables.8-9 Elles requièrent cependant une instrumentation lourde, coûteuse et difficile à mettre en œuvre, nécessitant un personnel qualifié et ne permettant leur utilisation qu’en laboratoire.
Les besoins d’outils de contrôle dédiés, de plus en plus performants en termes de spécificité et de sensibilité, moins coûteux et mieux adaptés à une utilisation sur le terrain, hors laboratoire d’analyse, favorisent le développement des capteurs chimiques et des biocapteurs. Ils devront cependant répondre aux exigences suivantes :
• Identifier une espèce moléculaire dans des milieux complexes, • Abaisser les limites de quantification (traces et ultra traces), • Augmenter la spécificité de l’analyse,
5 • Augmenter la productivité du système analytique pour quantifier le plus grand
nombre de produits dans la même analyse, • Evoluer vers les micro(nano)systèmes,
• Evoluer vers des techniques mixtes «bio» et «chimiques».
Pendant les vingt dernières années, le développement et l’utilisation de capteurs ont été essentiellement réservés à la recherche génomique. Aujourd’hui, cette demande s’étend progressivement à des secteurs tels que l’industrie pharmaceutique et le diagnostic médical mais aussi la sécurité alimentaire et l’environnement, étant donné la demande croissante de contrôles, en particulier sur les molécules chimiques répertoriées dans le cadre de la politique communautaire de REACH. Notons cependant que le développement de capteurs dans le cadre de la détection de petites molécules (inférieures à 800 Da) reste encore à ce jour limité.
Dans les paragraphes qui suivent, nous discuterons plus en détail des avancées en ce qui concerne les capteurs, plus particulièrement, dans le domaine du diagnostic médical, de l’industrie (agro)alimentaire ainsi que dans le domaine de l’environnement.
I.1.aDomaine médical
Dans le domaine médical, la détection des analytes comme les protéines, les peptides, les virus, les cellules (e.g. cancéreuses), l’ADN ou le glucose font l’objet d’intenses recherches. De nombreux capteurs ont été et continuent à être développés pour ces analytes.
10-11
En ce qui concerne leurs performances, l’accent est mis sur les faibles seuils de détection à atteindre, sur leur potentiel de miniaturisation ainsi que sur l’accès à une détection multiparamétrique.
La majorité des capteurs développés à ce jour dans le domaine médical sont des capteurs optiques utilisant, pour la plupart, des marqueurs fluorescents qui permettent d’atteindre des seuils de détection très bas de l’ordre du femtomolaire (fM) que ce soit pour l’ADN, les protéines, les cellules ou les virus (Tableau 1). Des capteurs piézoélectriques avec greffage d’antigènes ou d’anticorps ont aussi été décrits pour la détection d’agents pathogènes et de protéines.12
Par ailleurs, des biocapteurs enzymatiques ont également été développés, par exemple pour la détection de triglycérides en utilisant des enzymes glycérol kinase et glycérol-3-phosphate oxydase13 ou pour la détection du glucose en utilisant la glucose oxydase.
6 La majorité des capteurs décrits sont miniaturisables et peuvent être intégrés dans des systèmes microfluidiques.14
Analyte d’intérêt
Mode de
détection Seuil de détection référence
Cellules
cancéreuses fluorescence / Bajaj15
ADN électrochimique 0,2 nM Garnier16
Glucose électrochimique 2 µM Zhang17
Protéines fluorescence 25 µM Rochat18
Virus fluorescence / Rossi19
Tableau 1 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt dans le diagnostic clinique. Pour chacun d’entre eux, le mode de détection est indiqué ainsi que le seuil de détection associé.
I.1.bIndustries agroalimentaires
Au cours des dernières décennies, pour des raisons de santé publique, la sécurité alimentaire est devenue le centre de nombreuses investigations.
Les denrées alimentaires sont des milieux complexes qui subissent pour la plupart des procédés de transformation et de conservation. Elles peuvent être altérées par des processus naturels, accidentels ou par l’ajout volontaire d’additifs alimentaires. La contamination chimique, biologique ou bactériologique des aliments peut être induite entre autres par le contact avec une surface mal nettoyée ou par la sécrétion de toxines naturelles provenant de bactéries ou de moisissures. Parmi les contaminants les plus courants, se trouvent des mycotoxines,20 l’arsenic,21 de l’acrylamide,22 mais aussi des pesticides (composés triaziniques).23
Actuellement, l’évaluation des risques toxicologiques des denrées alimentaires est effectuée majoritairement via des techniques chromatographiques couplées à la spectrométrie de masse pour des contaminations d’origine chimique,24 et via des techniques de Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour les contaminations bactériologiques.25 Ces techniques performantes permettent d’atteindre des niveaux de sensibilité très faibles, de l’ordre du nanomolaire (nM), voire fM pour la spectrométrie de masse.
7 Les capteurs chimiques et les biocapteurs peuvent également être utilisés pour la détection de composés chimiques ou biologiques dans les denrées alimentaires. Ils présentent l’avantage de pouvoir être miniaturisés, et d’obtenir ainsi des capteurs portables pour effectuer des contrôles sur les chaînes de production.26 Le Tableau 2 répertorie quelques analytes présentant un intérêt pour l’industrie alimentaire et pour chacun d’entre eux, la technique analytique utilisée et le seuil de détection atteint.
Analyte d’intérêt
Mode de
détection Seuil de détection Référence
Paraoxone photoluminescence 1,0 µM Constantine27
Glucose électrochimique 0,1 µM Li28
Mélamine électrochimique 9,6 nM Cao29
Virus électrochimique 50 nM Carralero30
Xanthine et
hypoxanthine électrochimique 2 µM Cubukcu
31
Tableau 2 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt pour l’industrie alimentaire. Pour chacun d’entre eux, le mode de détection est indiqué ainsi que le seuil de détection associé.
I.1.cDomaine environnemental
Dans le domaine environnemental, que ce soit au niveau du sol, de l’air ou de l’eau, on retrouve un certain nombre de contaminants. Depuis les années 1920, l'utilisation croissante d’insecticides a conduit à des interrogations sur l'ingestion chronique par les animaux et par l’homme de métaux lourds, principalement le plomb, ou le mercure via les résidus présents dans les cultures.32 Mais c’est surtout après la seconde guerre mondiale que les pesticides ont connu un très grand essor dans le milieu agricole. En effet de nombreuses molécules ont été élaborées à des fins militaires en tant que gaz de combat, et utilisées par la suite en tant que pesticide ou herbicide. Les molécules organochlorées ont été parmi les premières à être utilisées. Par exemple, dans les années 1950, le dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT) a été très largement employé pour éliminer le doryphore. Par la suite divers organophosphorés (malathion, dianizon, glyphosates),33 des carbamates,34 et plus récemment les triazines ont été développées. De nos jours, d’autres types de polluants posent problème comme les gaz (méthane), les composés radioactifs (uranium, plutonium),35 ou les composés issus de la dégradation de produits pharmaceutiques (antibiotiques, nitroimidazoles).36
8 Des exemples de capteurs dédiés à la détection de différentes catégories de polluants sont cités dans le tableau suivant (Tableau 3). Le mode de détection et le seuil de détection sont précisés.
Analyte d’intérêt
Mode de
détection Seuil de détection référence
Atrazine électrochimique 1,0 µM Shoji37
Uranium fluorescent mM Pestov38
Amoxicilline électrochimique 0,2 µM Rezaei39
Méthane électrochimique 0,167% v/v Li40
Xanthine et
hypoxanthine fluorescent 0,01 µM Wang
41
Tableau 3 : sélection d’exemples d’analytes présentant un intérêt dans l’environnement avec le mode de détection et le seuil de détection associé.
Tous ces polluants sont majoritairement liés à l’agriculture, à l’émanation des gaz d’échappement, ou au déversement des eaux usées dans les rivières. Ils ont un impact néfaste sur l’environnement ainsi que sur la biosphère. Les effets à court terme de ces substances pour la santé sont de mieux en mieux cernés et des études ont permis de mettre en avant certains de leurs effets sur notre quotidien (allergies, effets neurotoxiques, effets tératogènes, troubles hormonaux, effet carcinogène). Il est donc nécessaire de pouvoir détecter et identifier tous ces contaminants, même à l’état de trace dans des conditions qui soient compatibles avec une analyse sur le terrain. Dans ce cadre, les capteurs chimiques et biochimiques constituent des outils de choix, comparés aux techniques classiques utilisables uniquement en laboratoire.
Nous venons de voir que les besoins en matière d’évaluation et de contrôle des substances chimiques et biologiques ne font que s’accroître depuis plusieurs décennies. Cela nécessite le développement d’outils analytiques performants et adaptés aux nouvelles exigences, favorisant le développement des capteurs chimiques et des biocapteurs. Mais avant de nous intéresser aux capteurs à base de polymères conducteurs à mémoire de forme qui ont fait l’objet de notre recherche, il est d’abord nécessaire de définir ce qu’est un capteur, d’en décrire la composition et les différents types.
9
I.2
Définitions
Un capteur chimique ou biologique est un dispositif analytique capable de détecter de manière spécifique et sélective la présence de substances chimiques ou biologiques dans un milieu. Les deux éléments-clefs d’un capteur sont i) la couche chimio- ou bio-sensible, qui permet de reconnaître spécifiquement l’analyte d’intérêt dans un milieu complexe, et ii) le transducteur, qui permet de convertir la reconnaissance chimique ou biologique en signal physique mesurable. Un troisième aspect qui peut dépendre de la nature du capteur, est le traitement du signal physique obtenu. La Figure 1 présente le principe de fonctionnement d’un capteur générique dont nous venons de décrire les différents éléments.
T ra n sd u ct e u r C o u ch e d e r e co n n a is sa n ce tr a it e m e n t d u s ig n a l t V Hz I… Analyte dans un milieu complexe Reconnaissance sélective de l’analyte Signal
physique Signal de sortie
Partie I Partie II Partie III
Figure 1 : schéma simplifié du fonctionnement d’un capteur.
Les capteurs chimiques et les biocapteurs se positionnent aujourd’hui aux frontières des nanotechnologies et des biotechnologies, ce qui suscite un grand intérêt dans la communauté scientifique comme dans l’industrie.42-45 Ils peuvent être classés de différentes manières : en fonction du type de récepteur utilisé au niveau de la couche de reconnaissance, ou selon le mode de transduction associé à cette couche sensible (Figure 2). Les systèmes les plus prometteurs associent de manière intelligente ces deux aspects.
10 CAPTEUR Transducteur Couche sensible Biorécepteurs Récepteurs chimiques Récepteurs biomimétiques Optique Electrochimique Gravimétrique
Figure 2 : Exemples de couches sensibles et de modes de transduction associés aux capteurs.
Les performances d’un capteur chimique ou d’un biocapteur dépendent de trois critères principaux étroitement liés :
• L’affinité de l’analyte pour la couche (bio)chimiosélective, • La bonne intégration de la couche au transducteur,
• Les propriétés intrinsèques du transducteur.
Dans la suite de ce chapitre les différentes parties constitutives d’un capteur (couche sensible, transducteur, traitement du signal) seront développées.
I.2.aLa couche chimio- ou bio-sensible
La couche sensible constitue le système de reconnaissance chimique ou biologique. Cette couche contient un récepteur chimique ou un biorécepteur portant des sites complémentaires capables de reconnaître l’analyte d’intérêt (partie I, Figure 1). Cette couche est immobilisée sur la surface du transducteur et constitue l’élément clef pour la spécificité du processus de reconnaissance. En effet elle va fixer l’analyte d’intérêt et permettre d’éviter les adsorptions non spécifiques sur le transducteur.
11 Il est possible de classer cette couche en 3 catégories :
• Les biorécepteurs (e.g. des cellules, des anticorps/antigènes, des enzymes, de l’ADN...),
• Les récepteurs chimiques (e.g. des complexes de coordination, des complexes d’encapsulation, des systèmes rédox),
• Les récepteurs biomimétiques (e.g. les polymères à empreintes moléculaires).
I.2.a.1Les biorécepteurs
Le biorécepteur est l’entité biologique qui assure la reconnaissance de la molécule à détecter. Il est constitué d’un élément biologique possédant des sites particulièrement sélectifs et affins
,
d’interactions antigène-anticorps ou ADN/ADN, pouvant atteindre des affinités de l’ordre du fM.Les biorécepteurs les plus couramment utilisés sont les anticorps, en particulier les anticorps monoclonaux très développés comme outils de reconnaissance dans le domaine du diagnostic médical grâce à leur grande spécificité et leur remarquable affinité pour leurs cibles biologiques. Ils doivent permettre la détection et la quantification directe d’un analyte contenu dans un fluide biologique à des concentrations qui peuvent être très variables et souvent inférieures au nM. Par exemple, via le greffage d’un anticorps anti-albumine à la surface d’un transducteur de type piézoélectrique, l’albumine bovine a pu être détectée avec un seuil de détection de l’ordre du fM.12
Cependant, ces récepteurs restent difficiles et longs à produire, donc coûteux. Ils sont de plus instables dans le temps et se dénaturent facilement dans des conditions de régénération, ne permettant pas, de ce fait, leur réutilisation.
L’ADN est aussi très largement utilisé comme biorécepteur, par exemple pour la détection de maladies génétiques ou d’infections d’origine microbienne ou virale.46-48 La reconnaissance de la séquence ADN complémentaire que l’on souhaite détecter se fait généralement par hybridation. L’immobilisation de ces ADN sondes sur un transducteur par adsorption, liaison covalente ou par l’intermédiaire d’un complexe streptavidine/biotine ne pose pas de problème particulier.49 Schüler et al. ont développé un capteur microfluidique présentant un faible coût et basé sur une détection électrique rapide d’un brin d’ADN marqué par la biotine.50
12 Certaines enzymes sont aussi couramment employées comme biorécepteurs. Elles peuvent être d’excellents récepteurs de par leur capacité de reconnaissance et par une forte activité catalytique associée à une faible concentration. De nombreux biocapteurs, permettant des applications très diverses, ont été développés avec la glucose oxydase, la lactate oxydase, la cholestérol oxydase, l’uréase, etc… Par exemple, un biocapteur superoxydase destiné à la détermination de la capacité antioxydante d’un jus d’orange a été développé par le groupe de Marty en 2009.51 Après avoir co-immobilisé le cytochrome-c avec de la xanthine oxydase sur une monocouche auto-assemblée à la surface d’une électrode d’or, les auteurs ont pu quantifier la réaction de dismutation de l’ion superoxyde O2.- en O2 qui a lieu via la réaction
enzymatique entre la xanthine oxydase (XOD) et l’hypoxanthine (HX) comme le montre la Figure 3.
Figure 3 : détection de l’ion superoxyde O2 .-
produit par le système enzymatique HX/XOD sur une électrode d’or modifiée par le cytochrome-c.51
Cependant, les enzymes ne sont pas stables en solution et ce, de manière plus critique que pour les anticorps. D’autre part, il est indispensable des les immobiliser et ceci, quelle que soit la technique utilisée, peut conduire à leur inactivation.52
I.2.a.2Les récepteurs chimiques
Les récepteurs chimiques sont des sondes qui assurent la reconnaissance de la molécule à détecter. Ces composés peuvent être de type rédox (i.e. ferrocène, fullerène), de type fluorescent (i.e. chromophores), ou des macrocycles (i.e. éther couronne, cyclodextrines, calixarènes, apatmères).
13 Des capteurs électrochimiques se basent, pour la reconnaissance, sur les propriétés rédox d’une sonde greffée. De nombreuses études utilisent le ferrocène qui est un metallocène ayant des propriétés rédox.53-54 La présence de l’analyte à détecter, e.g. ions (Hg2+), a une influence sur sa signature électrochimique avec un déplacement du potentiel lié au phénomène de reconnaissance.55
La synthèse de macrocycles de type éther couronne, cyclodextrines,56 calixarènes, font l’objet de nombreuses études. Ils offrent de nombreuses applications dans le domaine de la chimie des matériaux et du macromoléculaire. Les cyclodextrines présentent l’avantage d’être des systèmes solubles en milieu aqueux, peu coûteux et offrant de nombreuses possibilités de fonctionnalisation. Grâce à cela
,
ces structures supramoléculaires sont utilisées pour le développement de capteurs chimiques car elles possèdent des propriétés de reconnaissance. Lors de la détection, un changement structural a lieu en présence de l’élément chimique ou de l’ion à détecter.57 Ueno et al ont développé un capteur permettant la détection de stéroïdes en se basant sur un dimère de β-cyclodextrine modifiée avec un fluorophore dansyle. Lors de la détection du stéroïde, une diminution de fluorescence est observée.58Nous allons maintenant nous intéresser à un autre type de récepteur, biomimétique, de type polymère à empreintes moléculaires. Comme nous le verrons plus loin, ce système de reconnaissance donne accès à la détection d’une grande diversité de molécules.
I.2.a.3Les polymères à empreintes moléculaires
Les premières publications sur les polymères à empreintes moléculaires remontent à 1940. Elles sont liées en particulier aux travaux de Dickey qui s’inspira de la théorie de Pauling59 sur le mode de reconnaissance des antigènes par les anticorps et des substrats par les enzymes, selon un mode dit de « clef-serrure », pour créer un récepteur artificiel spécifique d’une molécule sonde dans un gel de silice.60 La deuxième partie de ce chapitre étant dédiée aux polymères à empreintes moléculaires (plus communément appelés MIPs, de l’anglais Molecularly Imprinted Polymers) et à leurs domaines d’applications, nous ne les introduirons que très brièvement dans cette première partie. Ces récepteurs synthétiques ont comme propriété de pouvoir mimer le comportement des biorécepteurs naturels. Ils sont fabriqués par assemblage d’un matériau polymère sur la surface du transducteur. Lors de l’étape de reconnaissance, les liaisons entre la matrice et l’analyte sont créées, ce qui aboutit à un signal mesurable par des outils physiques, de type optique, gravimétrique, électrochimique…
14 Pour illustration, la Figure 4 donne une représentation schématique de deux capteurs : le capteur (A) utilise un biorécepteur naturel de type anticorps pour la reconnaissance de l’analyte et le capteur (B) utilise un MIP comme récepteur biomimétique. Dans le premier cas, lorsque la molécule d’intérêt est reconnue par le récepteur greffé à la surface du transducteur, il se produit une association qui se traduit par une modification du signal. Dans le cas du MIP, les sites de reconnaissance, spécifiques en forme et en taille de la molécule à détecter, sont inclus au sein de la matrice de polymère. Comme dans le cas des biorécepteurs naturels, lorsque la molécule d’intérêt est reconnue par la matrice polymère, une variation du signal est aussi observée.
Figure 4 : représentation schématique de capteurs, (A) capteur basé sur les anticorps ; (B) capteur biomimétique basé sur le principe d’impression moléculaire.61
Les capteurs à base de MIPs présentent de nombreux atouts tels que la stabilité thermique, la conservation dans le temps, la facilité de préparation et la possibilité de régénération du système. De plus ils sont peu sensibles aux variations de pH et de température contrairement aux biorécepteurs, en particulier enzymatiques, comme nous l’avons décrit précédemment. Tous ces avantages ainsi que leur faible coût de production ont permis à cette technique de constituer une alternative prometteuse par rapport aux enzymes, anticorps et autres récepteurs naturels classiquement utilisés. Par ailleurs l’insertion de polymères à empreintes moléculaires comme éléments de reconnaissance de capteurs est facilitée par la grande variété de matrices polymères disponibles.
15
I.2.bLes transducteurs
Le transducteur (Figure 1 partie II) est l’élément du capteur dont la fonction est de retranscrire la reconnaissance physique, chimique ou biologique de la couche sensible en un signal physique mesurable. L’association entre le récepteur et le transducteur permet d’obtenir un signal sensible et facilement exploitable. Il fournit des informations sur la reconnaissance mais aussi sur la quantité d’analytes reconnus. Il mène ainsi à un signal sélectif, sensible et facilement exploitable. De nombreuses méthodes de transduction ont été développées. Certaines d’entre elles, encore les plus couramment utilisées aujourd’hui, utilisent des marqueurs liés au récepteur, ou bien à l’analyte. Ces marqueurs peuvent, en fonction des cas, être fluorescents, radioactifs, oxydo-réducteurs.61 Ce type de capteurs est généralement performant en terme de sensibilité,34,62 mais le marquage engendre un coût supplémentaire auquel peut s’ajouter le coût de l’instrumentation dans le cas de l’utilisation de marqueurs fluorescents ou le coût de la gestion des déchets dans le cas de l’utilisation de la radioactivité. Les méthodes de transduction ne nécessitant pas de marquage sont plus simples à mettre en œuvre. Elles permettent, de plus, de réaliser des mesures en temps réel.
De manière générale, les capteurs sont répertoriés selon leur mode de transduction. Les catégories de transducteurs les plus communément utilisées sont :
• optiques (fluorimétrie, résonance plasmonique de surface SPR, SPRi pour Surface Plasmon Resonance imaging),
• gravimétriques (microbalances à quartz : QCM, capteurs à ondes acoustiques de surface SAW, microcantilevers),
• électrochimiques (conductimétrie, impédancemétrie, ampérométrie, potentio-métrie).
I.2.b.1Les méthodes de transduction optique
Ce type de transduction permet de transformer une grandeur optique reçue au cours de la détection en un signal physique. La reconnaissance a lieu via par exemple, une variation d’indice de réfraction, ou peut dépendre des propriétés d’absorption ou d’émission de fluorescence de l’analyte à une longueur d’onde donnée. Des modifications opto-chimiques de la zone de transduction ont également été utilisées. Plusieurs méthodes ne nécessitant pas de marquage ont été développées, telles que l’ellipsométrie, pour l’étude de la reconnaissance immunologique de type antigène/anticorps induisant un changement d’épaisseur,
16 l’interférométrie ou la SPR. La SPR se produit lorsque, sous condition de réflexion interne totale, la lumière polarisée est incidente sur des films minces déposés sur un support métallique. Quand la lumière interagit avec une couche métallique, une petite quantité d'énergie lumineuse incidente est capable d'interagir avec les électrons délocalisés, ou plasmons, dans le film métallique. Lorsque les molécules interagissent avec la surface, un changement localisé de l’indice de réfraction a lieu. Cette dernière méthode permet une détection quantitative de l’ordre de la femtomole en temps réel (inférieur à 5 min) et sans marquage, contrairement aux deux autres (e.g. Springer et al. ont utilisé cette technique pour détecter des acides nucléiques avec un seuil de détection de l’ordre de la femtomole)63. Depuis la fin des années 1970, l’intérêt pour la SPR comme méthode de transduction n’a cessé de croître. De plus, l’imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) permet de détecter des protéines sans marquage avec des canaux de micro/nano fluidique intégrés permettant la miniaturisation du système.64
I.2.b.2Les méthodes de transduction gravimétrique
Ces capteurs sont basés sur l’exploitation de l’effet piézoélectrique. Les capteurs piézoélectriques donnent accès à des mesures massiques et de fréquences vibrationnelles, ce qui permet d’obtenir un faible seuil de détection, de l’ordre du nM,65 l’automatisation du système et un faible coût. Un des principaux avantages de la piézoélectricité provient de la réversibilité du phénomène. L’effet piézoélectrique direct correspond au phénomène qui a lieu lorsqu’un solide cristallin est soumis à une contrainte mécanique générant des charges électriques. Au contraire l’effet piézoélectrique inverse concerne la déformation mécanique du matériau suite à l’application d’une différence de potentiel entre les faces d’un matériau piézoélectrique. Ainsi, dans le cas de ce type de transducteur, la génération d’un champ électrique oscillant induit une onde acoustique déformant le matériau et dont la propagation est mesurée par la conversion des charges générées en un champ électrique. Parmi ces transducteurs nous pouvons citer les capteurs à onde acoustique de surface (SAW de l’anglais surface acoustic waves). Par cette technique Matatagui et al. ont obtenu un seuil de détection de 0,4 µM pour le composé diméthylméthylphosphonate, qui peut être utilisé comme arme chimique.66 Un autre type de transducteur utilisé est la microbalance à quartz (QCM Quartz Crystal Microbalance). Ce dernier permet des mesures massiques extrêmement sensibles lors de l’interaction entre l’analyte et la surface sensible du matériel piézoélectrique. L’interaction sonde-cible s’accompagne également d’une modification de la fréquence d’oscillation du
17 cristal piézoélectrique selon l’équation de Sauerbrey, qui montre une relation linéaire entre la variation de masse à la surface du transducteur ∆m et les variations de fréquence (∆ƒ).
∆ƒ = - 2,3 * 10-6 * F2 * ∆m/A Équation 1 : équation de Sauerbrey
Avec ƒ est la fréquence de résonance (Hz), F la fréquence fondamentale du cristal (Hz), ∆m la variation de masse (g), A la surface de l’électrode (cm²).
Ce dernier mode de transduction présente un certain nombre d’avantages tels que l’obtention de faible seuil de détection e.g. 50-70 µg/ml dans le cas d’un capteur ADN48 et une réponse rapide.67 Cependant le coût de cette technique et la difficulté à mettre en œuvre restent un facteur limitant.
I.2.b.3Les méthodes de transduction électrochimique
Ce mode de transduction fait appel à quatre types de transducteurs : ampérométriques, potentiométriques, impédancemétriques et conductimétriques. Les trois premiers étant les plus répandus.
I.2.b.3.1Les transducteurs ampérométriques
Ce mode de transduction, du fait de sa sensibilité, de la relative rapidité de mesure et de son faible coût associé, se présente comme une technique de choix, couramment utilisée dans la conception de capteurs électrochimiques. Celui-ci est basé sur la détection d’un courant électrique dans le circuit de mesure associé aux électrons générés au cours d’une réaction d’oxydoréduction à un potentiel imposé, pour une concentration en espèce donnée.
La détection de l’analyte entraîne une variation de la signature électrochimique de la couche de reconnaissance à la surface de l’électrode, par une réaction de type oxydo-réduction. Ceci se traduit par une variation de l’intensité proportionnelle à la concentration en analyte présent dans la solution.
De nombreux biocapteurs ampérométriques ont été réalisés via l’immobilisation d’une enzyme sur la surface d’une électrode de travail.68 Cette méthode permet de combiner à la fois la spécificité de l’enzyme pour un substrat donné et la sélectivité due à la transduction électrochimique. Dans ce cas, la détection de l’analyte s’effectue à potentiel constant. Suite à
18 la réaction enzymatique, les espèces électroactives sont soit produites, soit consommées. Leur oxydation ou réduction à la surface de l’électrode engendre une intensité de courant traduisant directement le phénomène de détection. Ce capteur est très largement utilisé e.g. pour le dosage du glucose en diabétologie. Le principe de ce biocapteur repose sur l’oxydation du glucose, catalysée par l’enzyme glucose oxydase (GOD) en présence d’oxygène et d’eau, générant ainsi du peroxyde d’hydrogène (H2O2). Ce dernier est oxydé au niveau de l’électrode
produisant un courant proportionnel à la concentration de glucose présent dans l’échantillon comme le montrent l’Équation 2 et la Figure 5 ci-dessous.68
Glucose + O2 + H2O Acide gluconique + H2O2
Glucose oxydase
H2O2 600 mV vs Ag/AgCl O2 + 2H+ + 2e
-Équation 2 : équation de la réaction d’oxydation du glucose générant le peroxyde d’hydrogène permettant le dosage électrochimique du glucose.
Figure 5 : principe du biocapteur pour le dosage du glucose, basé sur une électrode de Pt modifiée avec une membrane Nafion sur laquelle est déposé un gel de laponite permettant l’immobilisation
de la glucose oxydase (GOD).
Récemment des capteurs ampérométriques possédant une électrode modifiée par des nanoparticules d’or fonctionnalisées ont également été développés. Par exemple Liang et al. se sont basés sur ce concept pour développer un capteur en vue de la détection de l’ α -fetoprotéine appartenant à la famille des glycoprotéines.69
I.2.b.3.2Les transducteurs potentiométriques
La transduction potentiométrique est une méthode électrochimique qui permet de mesurer la différence de potentiel entre une électrode de référence et une électrode de mesure.
19 Ces variations de potentiel sont dues à des réactions (électro)chimiques, à l’activité des ions, ou à la charge électrique de biomolécules. On distingue deux types de conditions opératoires :
• potentiométrique à courant nul i.e. aucun courant n’est imposé dans le circuit de mesure,
• potentiométrique à courant imposé (contraire au cas précédant).
Par ailleurs divers types de systèmes sont décrits. La littérature fait état d’une électrode sélective d’ions (ISE), sur laquelle est déposé l’élément de reconnaissance. Ce modèle sert en partie pour :
• la mesure du pH,
• l’obtention de membranes sensibles aux ions,
• les électrodes sélectives aux gaz.
I.2.b.3.3Les transducteurs impédancemétriques.
Dans ces transducteurs nous trouvons les transistors à effet de champ (FET) qui sont sensibles aux charges présentes à la surface de l’électrode. Ce système permet d’aboutir à un transistor à effet de champ sensible aux ions (ISFET Ion Sensitive Field Effect Transistor) de la famille des ChemFETs représenté dans la Figure 6 (Chemical Field Effect Transistor).
Figure 6 : représentation schématique d’un ChemFET.
Ces capteurs ISFET présentent de nombreux intérêts dans le domaine environnemental (détection d’ions H+, NH4+ et NO3-),70 ou dans le domaine médical (détection des ions H+, K+,
20 I.2.b.3.4Les transducteurs conductimétriques
La transduction conductimétrique présente l’avantage d’une simplicité de mise au point et d’utilisation. En effet, contrairement aux autres transducteurs électrochimiques, ce type de système ne nécessite pas d’électrode de référence. Cette méthode permet, via la mesure de la conductivité électrique des solutions, de déterminer les variations (consommation ou production) d’espèces chargées générées à l’interface ou dans la région comprise entre les électrodes. Cette technique permet de mesurer les changements d’impédance électrique entre deux électrodes. Cependant, des optimisations de ces systèmes sont attendues afin d’améliorer la sélectivité.
En utilisant ce mode de transduction, un biocapteur à urée, avec immobilisation d’une membrane enzymatique à la surface de l’électrode, a été proposé par Senillou et Jaffrezic.73 La littérature fait également état de capteurs conductimétriques pour la détection de métaux lourds. Zhylyak et Dzyadevych ont développé ce système en utilisant une enzyme comme élément de reconnaissance, l’uréase, immobilisée sur la surface du transducteur, améliorant ainsi la gamme de détection. Les résultats obtenus mettent en relief une gamme de l’ordre du µM variant selon le métal à reconnaître. Les seuils de détection sont présentés dans le Tableau 4.74
Métaux Hg2+ Cu2+ Cd2+ Co2+ Pb2+ Sr2+
concentration 1 µM 2 µM 5 µM 10 µM 20 µM 100 µM
Tableau 4 : seuil de détection du capteur conductimétrique pour divers métaux lourds.74
D’après ces résultats, ce système manque de spécificité car il est capable de reconnaître un large panel de métaux, sans être sélectif.
I.2.cLe traitement du signal
Le traitement du signal va permettre de mesurer et d’amplifier le signal physique retranscrit par le transducteur lors de l’étape de reconnaissance. Le transducteur permet également dans certains cas de traiter directement un signal faiblement intelligible (transformée de Fourrier temps-fréquence) ou d’améliorer le rapport signal/bruit. En effet, plus le bruit de fond est faible au niveau du transducteur, plus le seuil de détection sera bas et ainsi les performances du capteur seront améliorées. Il est également possible, lors de cette
21 opération, d’automatiser la conversion de l’amplitude du signal traité en concentration d’analyte.
Comme nous l’avons déjà mentionné, les performances d’un capteur chimique ou d’un biocapteur dépendent des propriétés intrinsèques du transducteur mais aussi de manière étroitement liée, de l’affinité de l’analyte pour la couche (bio)chimiosélective, des propriétés de cette couche et de sa bonne intégration au transducteur. Cela traduit l’importance que revêt le choix de la couche de reconnaissance dans la conception d’un capteur. Dans ce contexte et comme nous le verrons plus loin, ces vingt dernières années ont vu s’accroître de manière significative le développement de capteurs chimiques et de biocapteurs utilisant des polymères à empreintes moléculaires (MIPs) en tant que couche de reconnaissance.
La deuxième partie de ce chapitre sera consacrée à ces récepteurs biomimétiques afin de mieux en cerner le principe et le mode de fonctionnement. Nous décrirons ensuite les différentes méthodes de synthèse des MIPs ainsi que les applications associées.
II
Polymères à empreintes moléculaires
Les polymères à empreintes moléculaires (MIPs) sont des matrices qui peuvent être utilisées dans des techniques préparatives ou séparatives mais aussi comme élément de reconnaissance d’un analyte.75 De nos jours, un grand nombre de capteurs chimiques et de biocapteurs utilisant des polymères comme couche de reconnaissance sont décrits dans de nombreux articles et revues.76-78 Par rapport à d’autres éléments de reconnaissance, e.g. les biorécepteurs, les MIPs présentent un grand nombre d’avantages, tels que leur faible coût, leur facilité de mise en œuvre, leur stabilité dans le temps, ainsi qu’une grande flexibilité dans le mode de dépôt de la matrice polymère. L’ensemble de ces caractéristiques est en faveur d’une production à grande échelle de ces matériaux rendant très prometteurs leur utilisation pour le développement de capteurs à base de polymères empreintes.
II.1
Historique
Les premières études mettant en avant le concept de reconnaissance moléculaire datent du 19ème siècle, suite aux travaux réalisés par Fischer en 1894 concernant la catalyse enzymatique. L’auteur a associé, pour la première fois, la reconnaissance d’un substrat lors de
22 sa fixation sur l’enzyme au concept « clef-serrure » démontrant que la position de l’enzyme d’un point de vue spatial est complémentaire à la forme du substrat. Par ailleurs, il a mis en évidence la présence de groupements fonctionnels, présents au niveau du site actif de l’enzyme, capables d’interagir avec le substrat via des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques ou hydrophobes.
Dans les années 1930, Breinl et Haurowitz ont proposé une théorie basée sur l’impression moléculaire pour expliquer la diversité des anticorps.79 Selon les auteurs, la spécificité des anticorps est obtenue grâce à l’interaction de ces derniers avec l’antigène correspondant. Pauling en se basant sur le concept émis par Breinl et Haurowitz a corrélé la capacité de repliement avec la spécificité des anticorps et a mis en évidence la modification de leur structure tridimensionnelle afin de créer l’empreinte de l’antigène.59
Polyakov et al. ont mis en évidence en 1931 l’affinité d’un gel de silice avec les solvants dérivés d’aromatiques tels que le benzène, le toluène ou le xylène, utilisés lors de la synthèse.80 En effet, les auteurs ont démontré la capacité du gel de silice à adsorber sélectivement ces molécules.
Dickey a développé, quelques années plus tard, des adsorbants avec des affinités spécifiques pour un substrat ayant la propriété de reconnaissance sélective envers le substrat utilisé comme empreinte.60 Bien qu’abandonnée par la suite, cette théorie est le principe même de l’impression moléculaire.
Il faudra cependant attendre les années 1970 avant d’aboutir à l’impression moléculaire telle que nous la connaissons aujourd’hui. En effet, le groupe de Wulff est le pionnier de cette technique suite à la synthèse en 1972 de polymères vinyliques avec une sélectivité vis-à-vis d’un ligand prédéterminé.81 Ce concept repose sur des interactions de type covalentes. L’impression moléculaire sous la forme d’un polymère monolithique via des interactions non covalentes sera proposée par le groupe de Mosbach en 1981.82 Dès lors, de nombreuses études reposant sur ce concept ont vu le jour. Cette technique suscite aujourd’hui un intérêt considérable et croissant. Ceci est d’autant plus perceptible lorsque nous analysons le nombre de publications, articles scientifiques et demandes de brevet d’invention basés sur cette approche.
