1
Royaume du Maroc
Université Mohammed V
Faculté de Médecine et de Pharmacie,
Rabat
Année: 2020 THESE N°: 13/19 CSVS
CENTRE D’ETUDES DOCTORALES DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
FORMATION DOCTORALE : BIOLOGIE MEDICALE, PATHOLOGIE HUMAINE ET EXPERIMENTALE ET ENVIRONNEMENT.
Option : Bioinformatique/Biologie Moléculaire
THESE DE DOCTORAT
Identification et validation d’anticancéreux, dérivés de la
curcumine, inhibiteurs de la protéine kinase AXL par
approches in silico et criblage virtuel
Présentée et soutenue publiquement le 04 Mars 2020
Par
Mme GHRIFI Fatima
Devant le jury composé de :Pr LMIMOUNI Badre Eddine Président
Faculté de Médecine et de Pharmacie ; Université Mohammed V de Rabat
Pr IBRAHIMI Azeddine Directeur de thèse
Faculté de Médecine et de Pharmacie ; Université Mohammed V de Rabat
Pr El HARTI Jaouad Rapporteur
Faculté de Médecine et de Pharmacie ; Université Mohammed V de Rabat
Pr BENNANA Ahmed Rapporteur
Faculté de Médecine et de Pharmacie ; Université Mohammed V de Rabat
Pr EL KEBBAJ Riad Rapporteur
Institut Supérieur des Sciences de la Santé ; Université Hassan 1er Settat
Pr ANSAR M’hamed Examinateur
Faculté de Médecine et de Pharmacie ; Université Mohammed V de Rabat
Pr SBABOU Laila Examinateur
2
3
Valorisation scientifique
1. Publications-Ghrifi Fatima, Allam Loubna, Lakhlili Wiame, Ibrahimi Azeddine. In Silico Inhibition Studies of AXL Kinase by Curcumin and its Natural Derivatives.
- Ghrifi Fatima, Allam Loubna, Lakhlili Wiame, Ibrahimi Azeddine. Curcumin-Synthetic
Analogs Library Screening by Docking and Quantitative Structure–Activity Relationship Studies for AXL Tyrosine Kinase Inhibition in Cancers
-Fatima GHRIFI, loubna ALLAM, Abdelhak ELKHAZRAJI, Sarah ELHOURCH, Ghizlane SABBAR , Asmae TAHIR, Hinde IRAQI, Azeddine IBRAHIMI.The growth arrest-specific
6 (Gas6) gene polymorphism c.834+7G>A is associated with type 2 diabetes and obesity in Moroccan patients (en cours de soumission).
- Loubna Allam, Wiame Lakhlili, Zineb Tarhda, Jihane Akachar, Fatima Ghrifi, Hamid El Amri and Azeddine Ibrahimi. Three-dimensional Structure Prediction of the Human
LMTK3 Catalytic Domain in DYG-in Conformation.
- Allam Loubna, Ghrifi Fatima, Lakhlili Wiame, El Amri Hamid, Ibrahimi Azeddine.
Molecular screening and docking analysis of LMTK3and AKT1 combined inhibitors. - loubna ALLAM, Housna Arrouchi, fatima Ghrifi, Abdelhak Khazraji, Ilham Kandoussi,
Mohamed Bendahou, Hamid El Amri, Mohamed El Absi, Azeddine IBRAHIMI. AKT1
Polymorphism (rs10138227), and not LMTK3, is associated with risk for colorectal cancer in Moroccan patients (soumis)
-TCF7L2 rs7903146 and rs12255372 association study with type 2 diabetes in the Moroccan
population (soumis) 2. Communications
2.1. Orales
2018 : “In Silico Inhibition Studies of AXL Kinase by Curcumin and its Natural Derivatives”
8 éme journées scientifiques du CeDOC SVS et aux 5ème journées scientifiques d’AMADOC. Prix de la meilleure communication scientifique en science biologie médicale, pathologie humaine.
4
2.2. Affichées
•2015: Structural Elucidation of AXL kinase DFG out conformation and Insight into the Selectivity of BMS777607 inhibitor .
• 2016: Molecular Modeling and Docking Studies of naturals compounds against AXL Kinase domain
• 2017 : Validation de la structure 3D conformationnelle DYG-out du domaine catalytique LMTK3 humain déterminée par homologie.
3. Séminaires, Ateliers et Formations
-Participation à toutes les formations et conférences organisées par le laboratoire « Med
BiotechLab »
2014 : Formation « Initiation à la Modélisation Moléculaire et Drug Design » 2015 : Formation « SIMCA-P + un outil pour faire le QSAR »
2016: Formation QSAR-2D organisée par le laboratoire de biotechnologie en partenariat avec la société marocaine de chimie thérapeutique
2016: Formation Simcyp-Simulator organisée par le laboratoire de biotechnologie (Medbiotech) en partenariat avec le laboratoire de pharmacologie et de toxicologie des hôpitaux universitaires de Genève.
-Participation à toutes les conférences organisées par le laboratoire ‘Med BiotechLab’
• Participation au 2éme journée scientifique du Master de Biotechnologie «
drug discovrey : de la modélisation à la thérapie à FMPR ».
• Participation à la 3éme journée internationale de Biotechnologie Médicale sous le thème « Les Applications Biotechnologiques au Service du Biomédical »
• Participation à la conférence « Le cancer et la Médecine Alternative »
• Participation à la journée internationale de Biotechnologie Médicale sous le thème «
La chirurgie du Génome et Thérapie Génique »
• Participation au 5 éme édition des journées internationales de biotechnologie médicale « Les Outils de Biotechnologie au Service de la Recherche Biomédicale Marocaine
• Animation de l’atelier « la pharmacogénétique » au cours de la 5 éme édition des journées internationales de biotechnologie médicale.
5
-Participation à toutes les conférences organisées dans la faculté de Médecine et de
Pharmacie de Rabat.
• Participation au séminaire « Produits bioactifs naturels et cancers à FMPR».
• Participation aux 6èmes journées scientifiques du CeDOC SVS et aux 3èmes journées scientifiques d’AMADOC « Femme et Recherche ».
3. Développements des compétences d’encadrement et d’enseignement
-Cours de modélisation moléculaire de 3éme année d’Ingénierie biomédicale à l’ENSET, RABAT
-Travaux pratiques de la biologie moléculaire et pharmacogénétique de la 2 éme année de pharmacie à la faculté de médecine de pharmacie de RABAT
-Cours d’expression génique de la 1ère année master de biotechnologie option biotechnologie
et bioinformatique, FMPR
-Travaux d’encadrement des étudiants du master et de la licence dans leurs projets de fin d’études PFE.
6
Remerciements
Le travail présenté dans cette thèse a été réalisé au sein de la plate-forme modélisation et drug design dans le laboratoire de Biotechnologie Médicale (MedBiotech) de la FMPR. Je tiens à remercier chaleureusement, en tout premier lieu, mon directeur de thèse le Pr Azeddine IBRAHIMI, directeur de bio-Inova Research centre, chef du laboratoire MedBiotech, pour m’avoir généreusement offert la liberté de franchir cette voie de recherche qui était non usuelle pour moi, sa manie de se comporter avec ses étudiants, sa passion d’effectuer des croisements fertilisants entre les disciplines scientifiques ont permis de former des chercheurs polyvalents et créatifs dans différentes disciplines instaurées dans le laboratoire MedBiotech. Je dirai encore mille mercis mon professeur pour la spontanéité avec laquelle vous avez bien voulu m’encadrer, vous avez m’accorder ce sujet qui m’a permis d’intégrer ce monde de la bioinformatique et Drug Design in silico. Travailler à tes côtes fut une expérience très enrichissante aussi bien scientifiquement qu’humainement. Tu m’as permis de m’épanouir en me laissant la liberté d’agir, tout en gardant un œil bienveillant sur ma progression. J’apprends de vous et je retiens toujours votre amabilité, votre sérieux, votre compétence et Votre humanisme qui orne vos qualités professionnelles qui séduisent tous le monde. En suivant vos directives, je suis arrivée à cerner et à réaliser cette thèse, veuillez accepter à travers ces mots ma profonde gratitude.
7
Je remercie le Professeur LMIMOUNI Badre EDDINE de me faire l’honneur de présider ma soutenance de thèse malgré ses nombreuses occupations. Nous sommes très sensibles au grand honneur que vous nous faites.
Je remercie vivement les Professeurs EL Harti Jaouad, Bennana Ahmed et El Kebbaj Riad pour avoir accepté de rapporter mon mémoire de thèse. Je suis très honorée de vous compter parmi les membres de ce jury.
J’associe à ces remerciements les Professeurs Ansar M’hamed et Sbabou Laila pour avoir accepté d’examiner ce travail et de faire partie de mon jury de thèse. Qu’ils reçoivent l’expression de ma sincère gratitude.
Je remercie l’ensemble des membres du laboratoire MedBiotech pour les bons moments que j’ai passés avec eux, trop nombreux pour être listés !
Je ne saurais pas conclure ces remerciements sans exprimer ma gratitude à mon mari Mly hafid Madouni Alaoui. Pour son soutien constant sans faille, pour tous mes moments de doute et de spleen où il a toujours su me réconforter.
8
Dédicace
A ma très chère mère
Tu es l’exemple que j’admire pour toutes les peines et sacrifices que tu as fait pour moi, puisse
Dieu vous protège et vous donne la santé et la longue vie
A la mémoire de mon père
Tu es été toujours fière de moi, tu le seras toujours
A ma petite famille, mon mari et mes enfants
Omar, Marwa et Sara
Vous étiez toujours ma source de réussite, aucune dédicace ne saurait être assez
éloquente pour exprimer mon profond amour, puisse Dieu, le tout puissant, vous préserve et
vous donne la santé, le bonheur et la langue vie
A ma grande famille : mes sœurs, mes belles-sœurs, mon frère et mes beaux-frères
A la mémoire de ceux que j’aime et qui nous ont quittés durant la période de réalisation de ce
travail
Mon beau-père, ma belle mère et ma belle-sœur :
Là, où vous êtes, vous me manquez énormément, Allah yarhamkoum,
A ceux qui ont attribué à la réalisation de ce travail de prés ou de loin
9
LISTE DES
10
Liste des Abréviations
ADMET : Administration ; distribution; metabolism ; excretion; toxicity ADN : Acid Deoxyribonucleic
ADP : Adénosine diphosphte ADT:AuotoDOCK Vina
ALK : Anaplastic lymphoma kinase
AMBER : Assisted Model Building with Energy Refinement AMM : Autorisation de mise sur le marché
ATP : Adénosine triphosphate BDMC : Bisdemethoxycurcumin
BMRB: Banque de Résonance Magnétique Biologique CHARMM :Complex Hazardous Air Release Model CMLV : cellules musculaires lisses vasculaires COMFA: Comparative Molecular Field Analysis CRDB : curcumine ressources database
CTGF : connective tissue growth factor CTLA-4 : cytotoxic T lymphocytes 4 antigen
DFG : D Aspartic acid; F Phenylalanine; G Glutamate DHC: Dihydrocurcumine
DKK3: Dickkopf-related protein 3 DL50 : Dose létale à 50%
DMSO : Diméthylsulfoxyde EGF: Epiderm Growth Factor EMT: Extracellular Matrix FDA: Food Drug Administration FGF: Fibroblast Growth Factor GAS6: Growth Arrest Specific 6 GIST: Gastrointestinal stromal tumors GLA: Acide c-carboxyglutamique GnRH : Hormone gonadolibérine
11 GPI: Glycosyl-phosphatidylinositol
GRB2: Growth factor receptor-bound HGFR: Hepatocyte Growth Factor Receptor HIF:Facteur inductible par l'hypoxie
HNSCC: Head and neck squamous cell carcinoma HPLC : High Performance Liquid Chromatography IC50 : Concentration d’inhibition à 50%
ICAMs : Intercellular Adhesion Molecule 1 IGF-1 : Insuline Growth Factor 1
IL-2 : Interleukine 2 INSR : Insuline Receptor IFN : Interférons de type I IκB : I kappa B kinase
IRAK : Kinase Associée au Récepteur de l'Interleukine-1 ITK :Inhibiteurs Thyrosine Kinase
KEAP1: Kelch-like ECH-associated protein 1 LMC : Leucemie Myéloïde Chronique
LMO : Leave Many Out LOO : Leave-one-out
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MD: Dynamique Moleculaire
MLK : Mixed Lineage Kinase MLR: Multiple Linear Regression
MOE : Molecular Operating Environement Mrcc :carcinome rénal métastatique
MTOR : Mammalian Target Of Rapamycin NIH : National Institut of Health
NK: Natural killer NO: oxyde nitrique
Nrf2: Facteur Nucléaire Dérivé des Erythroïdes 2 NSCLC :Non-small-cell lung carcinoma
12 PCR : polymerase Chain Reaction
PD : Mort Cellulaire Programmée-1 PDB: Protein Data Bank
PDGF : Platelet-Derived Growth Factors PAP : Phénylamino Pyrimidine
PK : Protéines Kinases PKA: Protein kinase A PLS : Parcial least squares PROS1 : Protéine S
PG : Prostaglandines PtdSer :Phosphatidyl serine
PLCg : Phospholipase C, gamma 1 PTK :Proteines tyrosines-kinases
QSAR : Quantitative Structure Activity Relation
RFLP : Polymorphisme de longueur de fragment de restriction RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire
RMSD : Root Mean Square Deviation ShRNA: Short hairpin RNA
SCOP: Structural Classification of Protein SCWRL: Side Chain Weighted Rotamer Library SGF: Facteur de croissance du sarcome
SHBG : Globuline liant l'hormone stéroïde Protéine SOMFA: Self Organizing Molecular Field Analysis SOD: Superoxyde Dismutase
SVM: Machines à vecteurs de support TLR : Récepteurs de type Toll
TNF : Facteur de nécrose tumorale TTBK : Tubuline kinase tau
VEGFR : Vascular Endothelial Growth Factor VHL : Von Hippel-Lindau
13
Listes des figures
Figure 1: Selon Bubble Map (carte à bulles) le mot curcumine est apparu dans 18036
publications ... 3
Figure 2: Progression et invasion des cellules cancéreuses... 12
Figure 3: Pourcentage de décès du au cancer en 2018 selon OMS ... 13
Figure 4: Les cancers qui tuent le plus chez l’homme et la femme dans le monde (selon OMS) ... 14
Figure 5 : Augmentation en pourcentage de la mortalité par cancer depuis 2002 ... 14
Figure 6 : Les proportions des cancers liés aux principaux facteurs de risque ... 15
Figure 7: Profil de mortalité par cancer au Maroc en 2014 (selon OMS) ... 16
Figure 8: Structure de l’Imatinib ... 20
Figure 9: le kinome humain ... 23
Figure 10: Le cycle catalytique de Phosphorylation d’un substrat par une kinase ... 24
Figure 11 : Représentation d’une Kinase (complexe 1R0P/KSA) sous sa conformation active (motif DFG-in). ... 25
Figure 12: Représentation schématique de la structure de la tyrosine kinase et des états conformationnels. ... 27
Figure 13: Les modes de liaison des inhibiteurs des kinases ... 31
Figure 14: Représentation schématique de c-Met, Tyro3, MERTK, AXL et leur ligand Gas6 ... 35
Figure 15 : Organisation structurelle des domaines de Gas6 et de la protéine S. ... 37
Figure 16: La régulation du cycle d'inflammation par les TAM récepteurs dans les cellules dendritiques. ... 39
Figure 17 : Les fonctions de TAM récepteurs dans le maintien de l'homéostasie immunitaire. ... 45
Figure 18 : a) Structure du gène AXL alignée avec les domaines protéiques fonctionnels, (b) Gas6 est une protéine dépendante de la vitamine K qui lie AXL avec une affinité supérieure à celle de Tyro3 ou Mer. ... 47
Figure 19: Activation Gas6 / AXL et signalisation en aval... 50
Figure 20: L'activation d’AXL par hétérodimérisation avec d’autres protéines membranaires entraîne des conséquences spécifiques aux cellules ... 51
14
Figure 22: Mécanismes d'activation de l'AXL dans le cancer... 57
Figure 23: Structures chimiques des inhibiteurs AXL ... 71
Figure 24 : La curcumine cible de nombreuses kinases dans la signalisation oncogénique. ... 74
Figure 25: Photos du Curcuma longa linné en arrière plan et de son rhizome ... 75
Figure 26 : En arrière-plan des rhizomes en morceaux saupoudrés de curcuma propres à la vente ... 76
Figure 27 : Structure chimique des curcuminoïdes ... 77
Figure 28 : Les formes enol et céto de la curcumine ... 78
Figure 29 : Synthèse de la curcumine décrite par Pabon en 1964 ... 79
Figure 30 : Les différentes formes céto-énoliques de la curcumine et les liaisons hydrogènes de solvatation en fonction des types de solvants ... 81
Figure 31 : Schéma général simplifié des différents sites impliqués dans les interactions hydrogènes entre la curcumine dans ces formes cétoniques et énoliques ... 82
Figure 32: Schéma simplifié du métabolisme prépondérant de la curcumine en fonction de la voie d’administration choisie (orale ou intraveineuse) avec les structures des principaux métabolites ... 84
Figure 33: Les molécules ciblées par la curcumine... 87
Figure 34: Potentiel thérapeutique de la curcumine sur diverses maladies humaines ... 88
Figure 35: La curcumine est impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire et la stimulation de l'apoptose via la régulation à la hausse de p16 et de p53 ... 89
Figure 36 : Les régions de la curcumine. (A) la β-dicétone ou le céto-énol; (B) le groupe phénolique; (C) le lieur central. ... 91
Figure 37: La souris (A) montre une infection à papillomavirus (B) une autre souris traitée par une application cutanée d’huile essentielle de curcuma... 92
Figure 38: Pipeline de découverte de médicaments ... 93
Figure 39: Organigramme illustrant le processus de découverte de médicaments et les composants informatiques utilisés ... 95
Figure 40: Alignement simple entre séquence de requête et le modèle ... 108
Figure 41: Les étapes de la modélisation par homologie ... 116
Figure 42 : Les étapes typiques de docking moléculaire ... 125
15
Figure 44: L’interface du logiciel Saves présentant les six programmes de validation ... 131 Figure 45: (A) la structure 2D de la curcumine et ses deux analogues naturels DMC et
BDMC, (B) la structure 2D de la molécule d’ATP ... 133
Figure 46: (a) l’interface du logiciel Autodocktools version 1.5.6. ; (b) la fenêtre de script du
programme Vina. ... 134
Figure 47 : Schéma général des différentes étapes d'une étude QSAR ... 136 Figure 48: Les paramètres de validation interne et externe d’un modèle QSAR valide ... 147 Figure 49 : Classification des méthodes de criblage virtuel « ligand-based »
et « structure based » ... 149
Figure 50 : Résultats de la validation et la validation croisée du modèle QSAR développé par
PLS ... 157
Figure 51: Corrélation entre log IC50 calculés (P pred) et observés (pIC50) pour le modèle
QSAR ... 158
Figure 52: Panel a: La superposition des ligands dans le site actif de la protéine AXL, la
curcumine (couleur jaune), BDMC (couleur verte) et DMC (couleur rouge). Panel b: La superposition des ligands dans le site actif de la protéine AXL vue de surface. ... 162
Figure 53: La structure chimique de la curcumine. ... 163 Figure 54 : Structure 2D des trois ligands potentiels tirés de la base de données pubchem . 164 Figure 55: (a) Les interactions de CID 10765707 avec le site actif de la kinase AXL. (b) les
interactions de CID 11257493 avec le site actif de AXL protein. (c) les interactions de CID 21159180 avec le site actif de AXL. ... 164
Figure 56: Les résultats de détection du polymorphisme intronique GAS6 834 + 7 G> A chez
16
Listes des Tableaux
Table 1: Les cinq principaux journaux, organisations et pays / territoires contributeurs sur les
18 036 manuscrits ... 4
Table 2: L'expression d'AXL dans les cancers humains est corrélée à un mauvais pronostic, des métastases et une résistance aux médicaments. ... 55
Table 3: l'analyse physico-chimique de la poudre de curcuma ... 79
Table 4 : Les programmes de modélisation moléculaire ... 114
Table 5 : les bases de données (DB) pour obtenir les séquences protéiques ... 115
Table 6 : les bases de données pour obtenir la structure 3D des protéines ... 116
Table 7: Quelques algorithmes de recherche utilisés pour générer des conformations de ligand dans la protéine ... 118
Table 8 : Classification des descripteurs en fonction des dimensions de leur représentation moléculaire ... 137
Table 9 : Les paramètres structuraux utilisés dans le développement les modèles QSAR ... 138
Table 10 : Les paramètres thermodynamiques utilisés dans les modèles QSAR ... 139
Table 11: Les descripteurs électroniques utilisés dans la construction des modèles QSAR . 140 Table 12: Les paramètres spatiaux utilisés dans le développement des modèles QSAR. .... 141
17
18
Table des matières
Valorisation scientifique ... I Liste des abréviations ... IV Liste des figures ... VII Listes des tables ... X
Introduction Générale ... 1
Partie 1 ... 6
I. Cancer, Traitement et Innovation Thérapeutique ... 6
I-1 Les transformations cellulaires et classification tumorale ... 7
I-2.Les étapes de la cancérogenèse ... 8
I-3. La tumorigenèse ... 11
I-4. Le cancer en quelques chiffres ... 12
II. Traitements et Avancées Thérapeutiques dans le Cancer ... 16
II-1. Les fondements du trépied thérapeutique classique ... 16
II-2. La naissance de la thérapie ciblée ... 17
II-3. L’immunothérapie ... 20
Partie 2 ... 22
I. Protéine Kinase AXL Comme une Cible Thérapeutique Majeure ... 22
I-1. Protéines kinases : Rôle physiologique et classification ... 22
I -2. Structure du site catalytique et ses états d’activations ... 24
I-2.1. La conformation active DFG in ... 26
I-2.2. Conformation inactive DFG out ... 26
I -3. Rôle des kinases dans le cancer ... 27
I-4. Les inhibiteurs des protéines kinases à petites molécules ... 28
II - Les Récepteurs TAM Kinases ... 32
II-1.Structure des TAM kinases ... 33
II-2. Ligands endogènes des récepteurs TAM kinases ... 35
II-3. Les fonctions cellulaires des récepteurs TAM ... 37
II-3. 1. Rôle des TAM récepteurs dans le système immunitaire inné ... 37
19
II-3.3. Rôle des TAM récepteurs dans la clairance des cellules apoptotiques ... 40
II-3.4.Rôle des TAM récepteurs dans l’intégrité de l’immunité innée et adaptative ... 42
II-3.5. Rôle des récepteurs TAM dans l’hémostase ... 42
III- Voie de Signalisation Gas6 / AXL ... 45
III- 1.Conséquences d’Activation de Gas6/AXL en aval de la voie de signalisation ... 47
II-2. Régulation de l’activation de l’AXL ... 51
III-3. Implication de la protéine AXL dans le cancer ... 53
III-3.1.L’expression de la kinase AXL dans le microenvironnement tumoral ... 56
III-3.2. Rôle de la protéine AXL dans l’anxiogènese... 58
III-3.3. Rôle de la protéine AXL dans les métastases ... 59
III-3.4. Rôle de la protéine AXL dans la résistance à la chimiothérapie ... 60
III-4. L’expression de la kinase AXL dans d’autres pathologies ... 62
III-5. Les inhibiteurs de l’AXL ... 64
Partie 3: ... 72
I- Les Composés Naturels, Curcumine et Inhibition des Kinases ... 72
I-1. La curcumine de l’épice au médicament ... 74
I-2. Les analogues naturels de la curcumine ... 76
II. Propriétés Physico-Chimiques de la Curcumine ... 78
II-1.Structure de la curcumine ... 78
II-2. Solubilité de la curcumine ... 80
II-3.Stabilité de la curcumine ... 80
III. Propriétés Pharmacocinétiques de la Curcumine ... 82
III-1. Absorption ... 82
III-2. Distribution de la curcumine ... 83
III-3. Métabolisation ... 83
III-4. Élimination ... 84
III-5. Etudes de toxicité de la curcumine ... 85
IV. Effets Thérapeutiques de la Curcumine ... 86
IV-1. Propriétés anti-tumorales/anti-angiogénèse de la curcumine et induction de l'apoptose ... 88
IV-2. Propriétés anti-inflammatoires de la curcumine ... 90
20
Partie 4 : ... 93
I-Rôle de la Bioinformatique dans la Découverte et la Conception de Médicaments ... 93
II. Les méthodes in silico ... 94
II.1.Modélisation par homologie ... 96
II-2. Etudes de relation structure activité quantitative (QSAR) ... 97
II-.3. Types des études de relation structure activité quantitative ... 98
II-4. Criblage virtuel (Virtual screening) ... 99
Objectifs ... 102
Méthodologie ...
Partie 1
... 103I. Construction d’un Model Protéique 3D par Homologie et Amarrage Moléculaire ... 103
I-1. La modélisation par l'homologie (homology Modeling) ... 103
I-2. Les méthodes ab initio ... 104
I-3.Reconnaissance de pli: Fold Recognition threading ... 104
II. Les étapes de la Modélisation par Homologie (homology modeling) ... 106
II-1.Choix de séquence de référence template et alignement de séquences ... 106
II-2. Génération de squelette (backbone) ... 108
II-3.Modélisation des boucles (loop-modeling) ... 109
II-4. Modélisation des chaînes latérales des résidus... 110
II-5.Optimisation du modèle ... 110
II-6. Validation du model 3D construit ... 111
II-7.Exactitude et limites de la modélisation par homologie ... 112
II-8. Serveurs, outils et logiciels de modélisation moléculaire ... 113
II-9.Les bases de données de protéines ... 114
III-L’amarrage (docking) Moléculaire: Etude d’Interaction Protéine-Ligand ... 117
III-1. Principe de docking moléculaire ... 117
III-2.Outils de docking moléculaire ... 118
III-3. Description des fonctions de scoring utilisées dans l’amarrage ... 118
III-4.Types de docking moléculaire ... 120
III-5. Procédure de docking moléculaire ... 121
21
Partie 2 ... 126
I. Inhibition in silico de la Kinase AXL par la Curcumine et Ses Dérivés Naturels ... 126
I.1. Génération d’un modèle 3D du domaine kinase de la protéine AXL par homologie moléculaire ... 126
I-1.1.Outils et bases de données ... 126
I-1.2.Choix de « Séquence de référence ou template» ... 128
I-1.3. Modélisation par homologie ... 129
I-1.4.Visualisation et validation du modèle 3D construit ... 129
II. Etude d’Inhibition de la Protéine AXL Kinase ; par la Curcumine, DMC et BDMC ; par Amarrage Moléculaire ... 131
II-1.La procédure Autodock ... 131
II-2.Préparation des fichiers de docking et définition de la boite de docking ... 133
Partie 3
: ... 135I. Etudes de Relation Quantitative Structure/Activité 2D-QSAR ... 135
I-1. Principe ... 135
I-2. Les descripteurs moléculaires ... 136
I-2.1.Les descripteurs 2D ... 137
I-2.2.Les descripteurs 3D ... 140
I-3. Les modèles statistiques ... 142
I-4. Les outils de validation des modèles QSAR ... 143
I-4-1.Les méthodes internes de validation ... 143
I-4-2.Les méthodes externes de validation ... 145
I-4-3.Les critères de modèle QSAR développé fiable et prédictif ... 147
II. Le criblage virtuel « Virtuel Screening » ... 148
II-1.Stratégie de Criblage Virtuel ... 148
II-2 Criblage virtuel « Ligand-Based » ... 149
II-3 Criblage virtuel « Structure-Based » ... 149
Partie 4 :... 151
I. Etude 2D–QSAR et criblage virtuel d’une bibliothèque des analogues synthétiques de la curcuminepour l’identification et la validation de nouveaux inhibiteurs de la kinase AXL ... 151
22
I.1.1. Choix de descripteurs moléculaires et génération du modèle 2D-QSAR par PLS ... 153 I-1.2. Validation du modèle ... 153 II. Criblage Virtuel pour la kinase AXL ... 154 II-1. Criblage Virtuel Ligand Based ... 155 II-2.Criblage Virtuel Structure Based ... 155
Résultats... 156
I-Génération et Validation du Modèle 3D du Domaine Kinase de la Protéine AXL ... 156 II. Etude 2D-QSAR des Analogues Synthétiques de la Curcumine Comme Inhibiteurs de la Kinase AXL ... 157 III-Criblage Virtuel ... 159DISCUSSION GENERAL ... 160
CONCLUSION GENERALE ... 167
PERSPECTIVES ... 169
Résumé ... 172
Abstract ... 173
Résumé en Arabe ... 174
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ... 175
ANNEXE 1 ... 199 ANNEXE 2 ... 206 ANNEXE 3 ... 207 ANNEXE 4 ... 20823
24
Introduction Générale
Le cancer est connu depuis la plus lointaine antiquité, il a été défini comme une tumeur dure, non inflammatoire, avec tendance à la récidivité et à la généralisation, amenant à une issue fatale.
Au début, la thérapie systémique du cancer a été dominée par l’utilisation de la chirurgie comme le moyen le plus efficace dans le traitement des tumeurs primaires localisées et lymphatiques régionales associées. Lorsqu'elle est utilisée comme traitement unique, la chirurgie guérit le patient plus que toute autre forme individuelle de traitement du cancer, car la chirurgie fonctionne selon une cinétique d'ordre zéro, dans laquelle 100% des cellules excisées sont tuées. Avec l'avènement de la radiothérapie dans les années 1920 et de la chimiothérapie après, dans années 1940, la chirurgie du cancer est devenue conservatrice. Contrairement à la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie sont deux processus complémentaires capables de tuer qu'une fraction des cellules tumorales par chaque traitement. Au cours des deux dernières décennies, des améliorations majeures à la fois sur la technique opératoire et l’utilisation des thérapies combinées ont considérablement réduit la morbidité et la mortalité associées à la chirurgie des néoplasmes solides mais les résultats n’étaient pas entièrement satisfaisants.
La recherche s’est avancée à grand pas, même-ci la première réaction de phosphorylation a été décrite en 1954, la découverte des protéines qui agissent par transfèrent d’un groupe phosphate de l'ATP aux résidus sérine/ thréonine n’a eu lieu qu’en 1970. Ces protéines sont identifiées biochimiquement par certains inhibiteurs non puissants ni sélectifs. En 1978, le premier oncogène découvert s'était une protéine kinase (1). Cette découverte a été étayée par une autre en 1981 de la protéine kinase C (PKC) (2). La recherche d’autres kinases a continué. En 1991, la structure tridimensionnelle de la protéine kinase A (PKA) a été élucidée. Il est devenu évident que les résidus impliqués dans la liaison de l'ATP étaient conservés de kinase à kinase (3, 4), ce qui a permis de caractériser une super famille de protéines serine /thréonine et tyrosine kinases, jouant un rôle central dans divers processus biologiques tels que le contrôle de la croissance cellulaire, le métabolisme, la différenciation et l’apoptose, leur dysrégulation augmente le potentiel oncogénique. A cet égard, les protéines kinases ont émergé comme l’une des cibles les plus visées dans la recherche sur le cancer, et le concept de leur inhibition était toujours un souci des scientifiques.
25
L’exploration du rôle des kinases a non seulement contribué à faire progresser le domaine de la biologie du cancer, mais elle a également conduit à l’avènement de la «thérapie ciblée » ou «médecine personnalisée » conduisant à un changement du paradigme dans la thérapie du cancer. Au début des années 1990, le développent de la 1ère thérapie anticancéreuse ciblée, a
pris un grand essor en oncologie. Elle a perpétué le mythe selon lequel il était «impossible » de développer des inhibiteurs de protéine-kinase dotés de la puissance et de la spécificité requise. Un groupe de chercheurs formé d’Alex Matter, Brian Druker, et Elisabeth Buchdunger chez Novartis, pensait que la protéine Bcr-Abelson était la cible sur laquelle il fallait travailler, ils ont lancé un programme portant sur la mise au point d’inhibiteurs de cette protéine. C’est au cours du printemps 1993 qu’une nouvelle molécule synthétisée, de bonne efficacité biochimique et semblant non toxique, le STI 571, a permis aux chercheurs de comprendre qu’ils tenaient entre leurs mains une molécule exceptionnellement active sur les cellules leucémiques tout en préservant les cellules saines. Les tests sur des animaux modèles ont été rapidement suivis d’essais cliniques. Une intense collaboration entre chercheurs et cliniciens a rapidement conduit à l’autorisation de mise sur le marché (AMM) de cette nouvelle molécule, appelée imatinib ou Glivec®, facilement acceptée par les autorités de santé du fait des taux de réponse élevés et d’une survie significativement augmentée des patients. Malgré la diminution importante du taux de mortalité, des échecs sont cependant observés. Le type de résistance et les caractéristiques des patients expliquent la personnalisation du traitement par la sélection du bon inhibiteur.
L’AXL kinase est un membre de la famille TAM kinase qui regroupe trois récepteurs à activité tyrosine kinase (Tyro 3, AXL et MERTK) largement étudiés ces dernières années en raison de leurs fonctions notables dans les différents processus tumoraux que ce soit la promotion, la prolifération cellulaire, la résistance à la chimiothérapie, l’invasion et les métastases. En raison de l’absence des inhibiteurs efficaces, puissants et sélectifs contre AXL, l’intérêt de développer des nouvelles molécules inhibitrices de l’AXL était toujours une préoccupation scientifique.
Les produits naturels ont présenté toujours une source riche en agents de valeur pour la médecine. Il existe plus de 25 000 composés phytochimiques dans différents plantes qui ont souvent des effets biologiques (5, 6). Les régimes riches en plantes fournissent au corps les vitamines et les minéraux essentiels. Plus de la moitié des médicaments sont des composés naturels ou sont liés à ceux-ci (7). Dans le cas du cancer, cette proportion dépasse 60% , cette
26
situation s'accompagne d'un intérêt croissant des sociétés pharmaceutiques et des institutions consacrées à la recherche de nouveaux médicaments à base de plantes (8) .
La curcumine présente l’un des produits thérapeutiques d'origine naturelle les plus étudiés au cours des dernières décennies (Figure1 et Table 1), en raison de ses diverses propriétés et ses activités normolipémiantes, normoglycémiantes, anti-inflammatoires et antioxydantes qu’on lui connaît aujourd’hui. Son activité anticancéreuse et son effet inhibiteur sur les protéines kinases ne sont mises en avant que dans les années 1980 sur plusieurs modèles in vitro et in
vivo. A l’heure actuelle, des essais cliniques évaluant la curcumine ont prouvé son innocuité.
La Food andDrug Administration des Etats Unis a depuis approuvé la curcumine en tant que composé generally recognized as safe (GRAS) dans son programme de notification alimentaire des adjuvants culinaires débuté en 1998.
Figure1: Selon Bubble Map (carte à bulles) le mot curcumine est apparu dans 18036 publications (9). Le logiciel VOS viewer a été utilisé pour analyser et visualiser les termes récurrents dans les titres et les résumés des publications. Seuls les mots apparaissant dans au moins 1,0% (n = 181) des publications ont été analysés et visualisés. Il y avait 422 termes qui sont apparus dans au moins 1,0% des publications évaluées. La taille des mots indique la fréquence d'affichage des mots (les apparences multiples d'un manuscrit comptent pour une). Deux mots sont plus proches l'un de l'autre s'ils co-apparaissent plus fréquemment dans les publications évaluées. Les couleurs à bulles représentent les citations moyennes des termes.
27
Table 1 : Les cinq principaux journaux, organisations et pays / territoires contributeurs sur les 18 036 manuscrits (9).
Dans ce travail de thèse, nous discutons des stratégies d’inhibition de la kinase AXL par la curcumine et ces dérivés naturels et synthétiques en utilisant des approches plus rationnelles. L’intérêt et l’implication de cette cible thérapeutique dans les processus physiologiques et pathologiques seront détaillés dans la partie bibliographique. Dans la partie pratique on va traiter les modes d’inhibition de cette cible protéique pertinente par des approches in silico. Cette partie a été réalisée sur deux volets, dans un 1er volet, la modélisation par homologie va servir pour construire un modèle 3D du domaine kinase de la protéine étudiée et l’amarrage moléculaire est utilisé pour tester l’interaction de la curcumine et deux de ses analogues naturels (DMC et BDMC) avec le site de fixation de l’ATP au niveau du domaine kinase de la protéine AXL. L’amarrage moléculaire a permis la mise en évidence des mécanismes de reconnaissances moléculaires et structurelles des inhibiteurs ATP compétitifs étudiés.
Dans l’autre volet, en basant sur l’interprétation des résultats de l’amarrage moléculaire obtenus et pour mieux comprendre l’influence de la structure des inhibiteurs étudiés sur l’activité de la protéine, une étude de relation structure/ activité (2D–QSAR) est réalisée. Dans laquelle, nous avons détaillé les outils statistiques et les descripteurs chimiques permettant de construire des modèles 2-dimensionnels quantitatifs des relations structure-activité des composés biologiquement actifs. Le modèle 2D- QSAR validé sera utilisé pour faire un criblage virtuel d’une série de 400 molécules décrites comme des dérivés
28
synthétiques de la curcumine. Ensuite, deux approches de Drug design : Structure Based Drug Design (SBDD) et Ligand Based Drug Design (LBDD) sont utilisés pour sélectionner à partir des 400 molécules étudiées, les composés les plus actifs et les plus pertinents comme des inhibiteurs (ATP) compétitifs de la protéine AXL. Les composés sélectionnés seront soumis à des analyses in vitro et in vivo afin de mieux comprendre leurs caractéristiques physico-chimiques et structurelles associées à leurs propriétés biologiques. Ce qui facilitera la conception de nouveaux inhibiteurs de l'AXL à base de la curcumine dans un avenir proche.
29
30
Partie1 :
I : Cancer, Traitement et Innovation Thérapeutique
Le cancer est un groupe de maladies d'organismes multicellulaires supérieurs, caractérisé par des altérations de l’expression de multiples gènes, influencé par des événements épigénétiques et environnementaux. Le développement d'une tumeur maligne à partir d'une cellule normale initiale s'étale généralement sur une période considérable de notre vie (10). La tumeur est plutôt le résultat d’un processus évolutif mettant en jeu des générations successives de cellules qui tendent progressivement vers une prolifération cancéreuse (11), conduisant à une dérégulation du programme cellulaire normal. Il en résulte un déséquilibre dans la division et la mort cellulaire, favorisant ainsi la croissance d'une population de cellules tumorales.
Le cancer possède la capacité d’envahir localement, se propager aux ganglions lymphatiques régionaux, et métastaser les organes distants du corps. À mesure que la croissance cancéreuse progresse, la dérive génétique dans la population cellulaire produit une hétérogénéité cellulaire présentant des caractéristiques telles que l’antigénicité cellulaire, le caractère envahissant, le potentiel métastatique, le taux de prolifération cellulaire et l’état de différenciation. Ces traits impliquent qu'il y a une inhérence dans la capacité des cellules à proliférer en clones ou à se différencier en différents types de cellules et de se déplacer dans le corps vers des sites d'organogenèse qui sont la clé du processus de tumorigenèse. On pourrait également soutenir que l'évolution a joué un rôle dans le développement de la cellule cancéreuse, car certaines des propriétés sélectionnées pourraient être elles-mêmes des processus utilisés par les cellules cancéreuses pour devenir invasives et métastasiques, ou autrement dit, le cancer est le résultat inévitable d'un ensemble de processus évolutif complexe. Certains de ces processus pourraient être :
La motilité cellulaire qui permet aux cellules neurales, par exemple, de migrer de la crête neurale d'origine pour former le système nerveux.
Le développement d'un grand génome complexe comprenant jusqu'à 20 000 gènes, qui doit être parfaitement répliqué chaque fois qu'une cellule se divise.
Le grand nombre de cellules chez un humain ou un mammifère supérieur qui doit se répliquer et se différencier presque parfaitement à chaque fois.
La longue durée de la vie humaine et des mammifères supérieurs, augmentant les chances qu'un "choc" génétique se produit et conduit une cellule vers une voie maligne.
31
Au niveau moléculaire, tous les cancers ont plusieurs points communs, ce qui suggère que les lésions biochimiques ultimes conduissent à la transformation maligne et la progression peuvent être produite par un schéma commun mais non identique d'altérations de la lecture des gènes. En général, les cancers entraînent une morbidité importante et seront mortels pour l'hôte s'ils ne sont pas traités. Les exceptions à cela semblent être des cancers indolents latents qui peuvent rester cliniquement indétectables ou in situ, permettant à l'hôte d'avoir une espérance de vie standard. Le cancer ne survient pas uniquement chez l'homme, ni chez les mammifères d'ailleurs, on a observé des cancers (ou au moins des masses tumorales métastasées ou non) chez des phylums aussi vieux que Cnidaria, apparus près de 600 millions d'années, et dans d'autres anciens phylum tels que Echinodermata (> 500 millions ans), Céphalopodes (500 millions d’années), Amphibiens (300 millions d’années) et Aves (150 millions d'années).
I-1 Les transformations cellulaires et classification tumorale
Les néoplasmes ou cancers ont plusieurs caractéristiques distinctives qui permettent au pathologiste de les caractériser comme anormales. Le terme néoplasme, qui signifie nouvelle croissance, est souvent utilisé de manière interchangeable avec le terme tumeur pour indiquer une croissance cancéreuse. Cependant, il est important de garder à l'esprit que les tumeurs sont de deux types fondamentaux bénignes et malignes (10).
Les tumeurs malignes se métastasent par les canaux lymphatiques ou les vaisseaux sanguins jusqu'aux ganglions lymphatiques et d'autres tissus dans le corps. Les cellules tumorales malignes ont tendance à être "anaplasiques" ou moins bien différenciées que les tissus normaux plus étroitement que les tumeurs malignes.
Les tumeurs malignes se développent généralement, bien que non invariablement, plus rapidement que les tumeurs bénignes. Une fois qu'elles atteignent un stade cliniquement détectable, les tumeurs malignes présentent généralement des signes de croissance significative, avec une atteinte des tissus environnants, pendant des semaines ou des mois, alors que les tumeurs bénignes se développent souvent lentement sur plusieurs années. Les tumeurs malignes continuent de croître même face à la famine de l'hôte. Elles se pressent et envahissent les tissus environnants, interrompant souvent des fonctions vitales ; elles se métastasent aux organes vitaux. En général, la tumeur maligne se progresse selon trois niveaux (12):
32
L'hyperplasie signifie qu'il y a trop de cellules résultantes d'une division cellulaire non
contrôlée. Ces cellules semblent normales, mais des changements sont survenus, entraînant une perte de contrôle de leur croissance (13).
La dysplasie, résultant d'une croissance ultérieure, accompagnée de modifications anormales
des cellules. La troisième étape nécessite des modifications supplémentaires, qui se traduisent par des cellules encore plus anormales et pouvant désormais se propager sur une plus grande surface de tissu. Ces cellules commencent à perdre leur fonction d'origine, ces cellules sont appelées anaplasiques (anaplasie). A ce stade, la tumeur est toujours contenue dans son emplacement d'origine (appelé in situ) et n’est pas invasif. Après, les cellules de la tumeur acquièrent la capacité de se métastaser, et d’envahir les tissus environnants, et d’autres tissus distaux à travers la circulation sanguine (14). Le type de tumeur qui se forme dépend du type de cellule initialement altérée. Il existe cinq types de tumeurs.
• Les carcinomes résultent de cellules épithéliales altérées, qui recouvrent la surface de notre peau et de nos organes internes. La plupart des cancers sont des carcinomes.
• Les myélomes qui se développent au niveau de la moelle osseuse et qui affectent les plasmocytes.
• Les sarcomes résultent des modifications des muscles, des os, de la graisse ou tissu conjonctif.
• Les leucémies et qui touchent les cellules de sang.
• Les lymphomes sont des cancers des cellules du système lymphatique qui proviennent de la Moelle osseuse.
I-2. Les étapes de la cancérogenèse
La cancérogenèse n'est pas un événement isolé, mais une longue chaîne de processus résultant d'une lésion subcellulaire légère, non létale. La carcinogenèse est un processus en plusieurs étapes, classiquement divisé en initiation, promotion et progression.
L’initiation : Lorsque les cellules deviennent plus anormales, elles acquièrent de nouvelles
capacités, elles deviennent capables de libérer des facteurs de croissance et des enzymes. Les cellules continuent à se diviser anarchiquement, influençant ainsi la croissance des cellules normales voisines, réduisant souvent la fonction de l'organe affecté. Bien que tous les cancers ne présentent pas exactement les mêmes étapes, certaines caractéristiques générales sont partagées lors du développement de nombreux types de cancer. Cette étape débute par l'action d’un cancérogène sur l'ADN chromosomique, induisant une lésion, qui peut être réparée ou
33
reproduite. Ainsi, une lésion peut être identifiée par une endonucléase spécifique qui dissèque le filament endommagé, une ADN-polymérase est fixée au niveau de la dissection et assure la synthèse en utilisant comme modèle le filament complémentaire intact, et une polynucléotide-ligase permet la fusion du segment réparé et le reste du filament. D'autres enzymes peuvent agir pour l'excision d'une base simple modifiée: N-glycosylase, AAE (endonucléase acide apurinique et endonucléase acide apyrimidinique), exonucléase, ADN polymérase, ligase, etc. La phase d'initiation d'une cellule commence par l'impossibilité de réparer la lésion d'ADN, elle implique sa compatibilité génétique avec l'activation de différents facteurs cancérogènes pouvant agir seuls ou en association, de manière isolée ou en cours en plusieurs étapes. Les facteurs génotoxiques peuvent être de différents types : virus, radiations, substances chimiques, etc. Les facteurs cancérogènes ont, selon le schéma de BERENBLUM (15), une action génotoxique irréversible; les processus de réparation ne se produisent pas. L'initiation conduit au stade de la promotion. Suite à l'action des facteurs chimiques, physiques ou biologiques, la cellule initiée présente une altération irréversible du matériel génétique et est susceptible de développer un clone de cellules néoplasiques. L'initiation représente un processus rapide, de l'ordre de quelques minutes ou heures, et la cellule initiée peut rester indéfiniment dans cet état, sans produire d'effets indésirables et sans être reconnue par les systèmes de défense de l'organisme, car elle ne se manifeste pas de manière phénotypique. La plupart des cancérogènes sont des initiateurs, mais les promoteurs peuvent être des facteurs environnementaux qui agissent sur les agents cancérigènes pour les activer au niveau des tissus et des organes particuliers, ainsi que sur les mécanismes par lesquels les lésions cancérogènes sont corrigées ou éliminées (10, 11).
La promotion : Cette lésion primaire nécessite l'action d'un agent cancérigène et de
nombreux efforts ont été déployés pour tenter d'identifier la nature de la lésion. La première étape importante était la découverte par BERENBLUM d'une classe de substances qui n'étaient pas cancérogènes en elles-mêmes, mais qui augmentaient considérablement le taux et l'efficacité de la cancérogenèse, s’elles étaient administrées avec ou après des cancérogènes connus, mais pas avant. Celles-ci ont été appelées «promoteurs », tandis que les substances qui ont causé le préjudice primaire ont été nommées «initiateurs ». La plupart des cancérogènes sont des initiateurs, mais quelques-uns peuvent également agir en tant que promoteurs et sont appelés «cancérogènes complets ».
34
Au cours de la promotion, la cellule initiée se dilate dans une tumeur visible, souvent une lésion bénigne telle qu'un papillome. Ce processus implique sans doute au moins certains facteurs épigénétiques qui influencent sélectivement la prolifération de la cellule initiée. Les produits finaux de la promotion tumorale sont généralement des lésions bénignes ou des foyers de cellules pré-néoplasiques. Ces cellules doivent subir un ou plusieurs changements héréditaires supplémentaires au cours de la progression à une tumeur maligne (16).
L’initiation et la progression du cancer dépendent des facteurs externes liés à l’environnement (tabac, produits chimiques, radiations et organismes infectieux) et des facteurs internes liés à la cellule (mutations héréditaires, hormones, affections immunitaires et mutations résultant du métabolisme). Ces facteurs peuvent agir ensemble ou en séquence, entraînant un comportement cellulaire anormal et une prolifération excessive. Par conséquent, des masses cellulaires se développent et s'étendent, affectant les tissus normaux environnants (tels que le cerveau), et peuvent également se propager à d'autres endroits dans le corps (métastases). Cependant, il est important de se rappeler que les cancers les plus courants prennent des mois et des années pour que ces mutations de l'ADN s'accumulent et entraînent un cancer détectable (17).
La progression : L'évolution des tumeurs malignes à partir d’une lésion bénigne implique
l'acquisition d'un ou plusieurs changements qualitatifs dans les cellules précurseures. En fait, la progression implique probablement plusieurs, changements héréditaires. Les altérations génétiques chroniques de la cellule initiée déterminent la transformation néoplasique et l'apparition de cellules capables de croissance autonome (17). Des études expérimentales de cancérogenèse ont montré que l’étape de la promotion présente une première phase réversible et une seconde phase irréversible. La promotion de la tumeur est dans une large mesure, peut-être même totalement, associée à des facteurs épigénétiques qui modifient, directement ou indirectement, l'expression de l'ADN génomique. La promotion comprendrait des événements survenant dans le programme génétique de la prolifération et de la différenciation terminale. La cellule promue ne reconnaît plus les signaux de différenciation, ce qui la supprime normalement de la population de réplication. Contrairement aux initiateurs, la cible principale des promoteurs est la membrane cellulaire, ils ne se lient pas à l'ADN.
35 I-3. La tumorigenèse
Après que les cellules cancéreuses ont acquis la capacité d'envahir les tissus environnants, leur passage dans la circulation sanguine nécessite la dégradation de la paroi d'un vaisseau sanguin pour qu'elles puissent y pénétrer. Les macrophages associés à la tumeur facilitent cette étape en ouvrant un passage dans un vaisseau sanguin pour les cellules cancéreuses. Les vaisseaux sanguins ainsi que les vaisseaux lymphatiques deviennent accessibles aux cellules cancéreuses qui peuvent être tuées dans la circulation sanguine à cause de la forte pression hydrodynamique, elles s'entourent des plaquettes pour survivre aux contraintes physiques de la circulation sanguine. Ces cellules cancéreuses ont un diamètre trop important, elles arrivent à des capillaires sanguins qui perfusent un organe, elles se bloquent car elles sont plus grosses que le diamètre des capillaires sanguins et les plaquettes qui les entourent gênant d'autant plus leur passage. Bloquées au niveau du capillaire sanguin, les cellules cancéreuses peuvent proliférer au sein de ce capillaire et le rompre, elles forment de nouveaux vaisseaux sanguins pour irriguer la tumeur et l'alimenter en oxygène et en nutriments (18). C'est ce qu'on appelle l'angiogenèse. Ce point est capital car l'angiogenèse survient pendant le développement et le remodelage vasculaire en tant qu’une série d'événements contrôlés conduisant à la néovascularisation. L'angiogenèse associée à la tumeur peut être définie comme la germination de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux déjà existants. Les vaisseaux sanguins qui soutiennent la croissance tumorale peuvent également proviennent des cellules recrutées dans la moelle osseuse ou peuvent même se différencier à partir des cellules souches tumorales (mimétisme vasculaire). Ultérieurement, elles sortent alors de la circulation sanguine pour rejoindre un autre tissu (19). L'environnement du nouveau tissu dans lequel les cellules cancéreuses se naissent est différent à celui de la tumeur dont elles proviennent, le petit groupe de cellules cancéreuses métastatiques forme une petite tumeur invisible appelée une micrométastase dans un environnement qui n'est pas favorable à la pousse tumorale, ces cellules s'adaptent au nouveau tissu pour former une métastase, ce qui leur prend beaucoup de temps. Ce processus de formation de métastases s'appelle la colonisation. En clinique, il arrive que cette colonisation apparaisse plusieurs mois ou années après l'excision d'une tumeur chez un patient, bien qu'au moment de son opération aucune autre tumeur n'était détectable. Cela montre qu'au moment de l'éradication de la tumeur, les micrométastases sont déjà mis en place, et qu'elles ont mis plusieurs mois ou années à s'adapter à leur environnement pour former des métastases (19). Leur déplacement par voies lymphatiques ou
36
veineuses pour localiser des niveaux tissus avoisinants donne lieu à des métastases. La circulation sanguine joue un rôle catalyseur dans l’invasion cellulaire, en effet, les cellules tumorales ayant besoin d’un milieu favorisant leur croissance et leur déplacement, elles acquirent un pouvoir d’angiogenèse (systeme sanguin nourricier) par stimulation des cellules endothéliales des capillaires voisins. Selon l'endroit où le cancer a émergé, certains organes vont être plus favorables pour le développement des métastases car ils fournissent dès le départ un environnement plus avantageux aux cellules cancéreuses. Par exemple pour les cancers du sein, les sites de métastases préférentiels sont les os et les poumons tandis que pour les cancers du côlon, les métastases au niveau du foie sont plus fréquentes.
Figure 2: Progression et invasion des cellules cancéreuses
I-4. Le cancer en quelques chiffres
Selon les données de l’Organisation Mondiale de Santé (OMS) en 2018, le cancer est la deuxième cause de mortalité dans le monde. Dans l'ensemble, la prévalence du cancer a effectivement augmenté, Une personne sur trois est susceptible de souffrir d'un cancer au cours de sa vie. Rien qu'aux États-Unis, environ 1 665 540 personnes ont été atteintes d'un cancer et 585 720 d'entre elles sont décédées suite à cette maladie en 2014. Le cancer est donc un problème grave qui affecte la santé de toutes les sociétés humaines. Malheureusement, c’est une maladie hétérogène au niveau des tissus et cette hétérogénéité pose un défi majeur pour son diagnostic spécifique, et même pour l’efficacité du traitement. Chez les hommes, on
37
trouve le cancer de la prostate en premier lieu suivi des poumons et les bronches, du côlon et du rectum, et de la vessie, respectivement. Chez les femmes, la prévalence du cancer de sein est la plus élevée suivie des poumons et les bronches, le côlon et le rectum, le corps utérin et la thyroïde, respectivement. Ces données indiquent que les cancers de la prostate et du sein constituent une part importante du cancer chez les hommes et les femmes, respectivement. Chez les enfants, les types les cancers du sang vient en premier lieu suivi des cancers du cerveau et des ganglions lymphatiques, respectivement.
Le cancer ignore les frontières, le nombre de décès dans le monde dû aux cancers a atteint 18,1 millions en 2018. Près d’un décès sur 6 dans le monde est dû au cancer. Le cancer constitue la 2éme cause de mortalité dans les pays développés, il fait partie des trois principales causes de mortalités chez l’adulte dans les pays en développement, environ 70% des décès par cancer surviennent dans les pays à revenu faible ou intermédiaire. Le cancer est à l’origine de 12.5% du total des décès, soit plus que la proportion de décès par le SIDA, la tuberculose et le paludisme réunis.
38
Figure 4: Les cancers qui tuent le plus chez l’homme et la femme dans le monde (selon OMS)
39
Les facteurs de risques
Environ un tiers des décès par le cancer sont dus aux cinq principaux facteurs de risque comportementaux et alimentaires: un indice élevé de masse corporelle, une faible consommation de fruits et légumes, le manque d’exercice physique, le tabagisme et la consommation d’alcool. Les composés chimiques jouent un rôle évident dans la formation de mutations géniques et de cellules cancéreuses. De plus, le tabagisme implique plusieurs composés chimiques cancérigènes qui entraînent le cancer du poumon. Il est intéressant de noter que les substances chimiques environnementales ayant des propriétés cancérogènes ont une influence directe ou indirecte sur le cytoplasme et le noyau des cellules et conduisent à des troubles génétiques et à des mutations génétiques. Les virus, les bactéries et les rayons du rayonnement sont d’autres facteurs de cancérogenèse, représentant environ 7% de tous les cancers (20).
Figure 6 : Les proportions des cancers liés aux principaux facteurs de risque.
Les données au Maroc
Selon de nouveaux chiffres publiés par l'OMS, 52.783 nouveaux cas de cancer ont été recensés au Maroc en 2018, le taux d’incidence du cancer est de 139,6 cas par 100.000, et le taux de mortalité est estimé à 86,9 cas par 100.000. Les Marocains ont 14,67% de probabilité de contracter un cancer avant l’âge de 75 ans, et 9,28% de risque d’en mourir avant le même âge. En 2018, 52.783 nouveaux cas de cancer ont été recensés dans le Royaume.
40
Figure 7: Profil de mortalité par cancer au Maroc en 2014 (selon OMS)
II. Traitements et Avancées Thérapeutiques dans le Cancer
II-1. Les fondements du trépied thérapeutique classique
Bien que le cancer est connu depuis l’antiquité, la tumeur offrait déjà une première cible aux traitements qui ne se limitaient pas seulement à l’ablation chirurgicale mais aussi à la destruction par cautérisation, qui n’est qu’une forme rudimentaire de la radiothérapie, ou encore à l’application locale de quelques emplâtres de plantes où on peut voir les prémices de la chimiothérapie (21).
A l’exception d’une observation unique datant de 1865 (22) où Lissauer rapporte l’efficacité de l’arséniate de potassium chez un patient leucémique, les choses restèrent quasiment stagnantes pendant des décennies, A la fin du XIXesiècle lorsque les premiers balbutiements
de la radiothérapie sont apparus, ils ont connu alors une explosion plus rapide, en 1895 Wilhelm Conrad Roentgen a découvert les rayons X (23), quelques mois plus tard, un étudiant en médecine à Chicago, Emil Grubbe, s’avise que ce sont les mêmes rayons qui ont causés ses brûlures en travaillant avec. Il raisonne alors que ces effets délétères sur sa peau pourraient être bénéfiques s’ils réussissaient à brûler une tumeur. Une femme atteinte d’un cancer de sein avancé lui est immédiatement confiée pour tester ces nouveaux rayons X. Elle meurt trois mois plus tard sans aucune guérison de tumeur. En 1896 Victor Despeingnes a utilisé la radioactivité pour traiter un cancer de l’estomac (24). C’est ainsi que la notion de la thérapie anticancéreuse a été née, elle consiste à recourir à des agents destructeurs vis-à vis des tissus sains et dont le ciblage de la tumeur ne peut être que directionnel. Aussi, il a été remarqué que la description de la maladie cancéreuse est restreinte à la seule tumeur et que les métastases ne présentent pas encore des cibles thérapeutiques. Il faudra attendre le début du XXe siècle pour que la notion de métastase soit bien établie par les médecins français Bayle et
41
Récamier sur la base des milliers d’autopsies qu’ils avaient réalisées (25). C’est d’ailleurs que la reconnaissance du rôle des métastases dans la mortalité par cancer fait appelle à des traitements systémiques par chimiothérapie. Les agents alkylants sont les premières molécules à entrer en scène.
Dans les années trente, le gaz motarde est testé aux Etats –Unis sur des souris atteintes de lymphome. Cependant, les vrais débuts de la chimiothérapie anti-cancéreuse commencent en 1942 et 1943. En 1942, l’américain Alfred Gilman traite par la caryolysine un malade atteint d’un lymphome étendu, avec une efficacité certaine durant les deux premières cures (26). En décembre 1943, le navire américain Liberty ship john Harvy contenant des stocks de gaz moutarde accumulés a été bombardé dans le port italien de Bari, l’équipage est gravement intoxiqué, 13 des marins périrent. Ce fut là était le premier test « accidentel » de la toxicité de ces produits chez l’homme.
II-2. La naissance de la thérapie ciblée
Les premiers travaux réalisés sur les effets de la radiothérapie et la chimiothérapie, ont montré que ces deux méthodes de traitement de cancers ont des effets délétères sur les cellules à renouvellement rapide comme celles de la peau, la muqueuse digestive, du sang ou des gonades, ce qui a attiré l’attention sur la cellule cancéreuse, reconnue par leurs nombreuses mitoses. En 1914, Schwartz proposait de multiplier les séances de la radiothérapie afin d’augmenter les chances de toucher la cellule en mitose puisque cette phase de cycle est considérée comme la plus radiosensible. A cette époque, les gènes impliqués dans l'initiation et la promotion du cancer étaient très mal définis, les gènes spécifiquement modifiés dans le cancer étaient presque totalement inconnus. L’identification des oncogènes n’a véritablement commencé que dans les années soixante dix. Le gène src a été identifié en 1976 par Stehelin et al (27). Et erb, myc et myb oncogènes ont été identifiés à la fin de 1970, mais le terme de gène suppresseur de tumeur n’a même pas existé jusqu’au début des années 1980, bien que son existence ait été suggérée par les expériences de fusion cellulaire de Henry Harris, qui a montré que, si une cellule normale était fusionnée avec une cellule maligne, le phénotype était généralement non malin. Le gène RB était le premier cloné, en 1983 par Cavenee et al. À l'origine, p53 était considéré comme un oncogène. Il n'a pas été compris qu'en 1989 que p53 de type sauvage pouvait réellement supprimer la transformation maligne(28). Un certain nombre de gènes suppresseurs de tumeurs ont été identifiés depuis. La découverte des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs a constituée une révolution dans la recherche
42
sur le cancer en établissant la notion fondamentale que les racines du cancer sont dans les gènes.
D’autres événements importants dans la recherche sur le cancer ont marqué cette période : - La découverte des gènes de susceptibilité au cancer: En 1981, nous savions que certains cancers, notamment ceux du colon, avaient été regroupés au sein de la famille (familial clustering), mais les gènes impliqués n’avaient pas été déterminés. L'APC, BRCA-1, BRCA-2 et p53, les mutations héritées, par exemple, n'étaient pas connues à ce moment-là. La recherche dans ce domaine a identifié un certain nombre de gènes impliqués dans la susceptibilité au cancer et, avec les techniques de clonage modernes, de plus en plus les gènes sont identifiés tous les quelques mois.
-Les techniques de la biologie moléculaire moderne en étaient à leur début à l'époque. La réaction en chaîne de la polymérase (PCR), les puces à ADN, les puces à protéines et la bioinformatique ne figurent pas encore.
-Les gènes impliqués dans l'initiation et la promotion du cancer étaient très mal définis. Bien que nous sachions que les produits chimiques et l’irradiation pouvaient endommager l’ADN et provoquer le cancer chez les animaux et les humains, les gènes spécifiquement modifiés étaient presque totalement inconnus.
-L’immunologie des tumeurs était encore mal maîtrisée en 1981, tant du point de vue du mécanisme de la réponse immunitaire que de sa capacité à la manipuler avec des cytokines, des cellules dendritiques activées et des vaccins. Une telle manipulation n'était pas dans l'arsenal thérapeutique
-L'étiologie virale du cancer était encore largement débattue en 1981. L'implication du virus d'Epstein Barr dans le lymphome de Burkitt et le virus de l'hépatite B dans le cancer du foie commençait à être acceptée, mais le rôle des virus dans ces maladies et du cancer du col utérin, le sarcome de Kaposi, et dans certains lymphomes à cellules T sont devenus plus clair plus tard.
-Bien que certains facteurs de croissance ayant une incidence sur la réplication des cellules cancéreuses, tels que l'IGF-1 et l'IGF-2, le FGF, le NGF, le PDGF et l'EGF, soient connus en 1981, la connaissance de leurs récepteurs et des mécanismes de transduction du signal était vraiment primitive.
-Le facteur de croissance tumorale α était connu sous le nom du facteur de croissance du sarcome (SGF) et l’existence de son partenaire, le TGF-β, n’était déduit que de ce que l’on
