Données expérimentales pour établir l’équation 2D-QSAR

Notre étude QSAR a été effectuée sur 123 molécules définies comme des inhibiteurs de la kinase AXL, ces inhibiteurs sont sélectionnés à partir de base de données canSAR 3.0 (https://cansar.icr.ac.uk) en fonction de leurs poids moléculaire et de l’IC50 (Concentration d’inhibition à 50%). CanSAR est une base de connaissances intégrée qui rassemble des données multidisciplinaires sur la biologie, la chimie, la pharmacologie, la biologie structurale, les réseaux cellulaires et les annotations cliniques. Elle applique des approches d'apprentissage automatique pour fournir des prédictions utiles à la découverte de médicaments. L’objectif de canSAR est de permettre la recherche translationnelle sur le cancer et la découverte de médicaments en fournissant ces connaissances à des chercheurs de différentes disciplines. Elle fournit un portail d'information unique pour répondre à des questions multidisciplinaires complexes, notamment: que sait-on d'une protéine, dans quels cancers est-elle exprimée ou mutée et quels outils chimiques et quels modèles de lignées cellulaires peuvent être utilisés pour sonder expérimentalement son activité ? Que sait-on d'un médicament, de son profil de sensibilité cellulaire et de quelles protéines est-il connu pour se lier qui pourrait expliquer une bioactivité inhabituelle? canSAR est disponible gratuitement pour tous les chercheurs sur le cancer.

Nous avons converti les valeurs IC50 en unités de molarité (M) en pIC50 (-log IC50) afin de fournir des valeurs de données numériquement plus grandes. Pour établir et valider l’équation

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de QSAR-2D, toutes les molécules sont divisées aléatoirement en training set (l’ensemble d’entraînement 70%) composé de 95 molécules exposées en Annexe 1 et en test set (l'ensemble de tests (30%)) formés de 28 molécules qui restent.

I.1.1. Choix des descripteurs moléculaires et génération du modèle 2D-QSAR par PLS

Le logiciel MOE est utilisé dans cette étude. MOE génère 184 descripteurs 2D différents pour tous les composés d’entraînement (training set). Les descripteurs moléculaires 2D sont définis comme étant des propriétés numériques qui peuvent être calculées à partir de la table de connexion de représentation d’une molécule comprenant (697):

- propriétés physiques (14 descripteurs),

-superficies de surface subdivisées (18 descripteurs), -calcul du nombre d’atome et leurs liens (41 descripteurs),

-indices de connectivité de Kier&Hall et de forme de Kappa (16 descripteurs), -descripteurs de matrice distants et adjacents (33 descripteurs),

-descripteurs de caractéristiques de pharmacophore (12 descripteurs), -descripteurs de charge partielle (50 descripteurs).

Les informations sur les descripteurs moléculaires 2D peuvent être trouvées sur

http://www.chemcomp.com.

Le «Module QuaSAR-Contingency», une application statistique dans MOE a été systématiquement employée pour choisir les meilleurs descripteurs. Le module "Modèle QuaSAR" du MOE a été mis au point pour développer les modèles PLS QSAR. La régression PLS relie les descripteurs en tant que variables indépendantes à l'activité biologique (pIC50) des composés en tant que variable dépendante pour construire les modèles prédictifs. La qualité des modèles est évaluée sur la base du coefficient de corrélation R², du coefficient de corrélation d’évaluation croisé q2 (LOO = LeaveOneOut), et de l’erreur de RMS (Root Mean Square).

I-1.2. Validation du modèle a.Validation interne

Cette validation évalue comment le modèle peut prédire avec précision les bioactivités des composés de training set, elle est réalisée par ‘‘The QuaSAR fit validation” une application dans le logiciel MOE. Elle est exprimée par le coefficient de corrélation au carré (R2) qui compare entre les activités prévues et expérimentales, l’erreur quadratique moyenne (RMSE)

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est utilisée pour montrer l’erreur entre la moyenne des valeurs expérimentales et des activités prévues. R² et RMSE approuvent si le modèle possède la qualité prédictive reflétée par R².

b. Cross validation

Le test de validation croisée (LOO) "Leave-one-out", également implémenté dans le MEO, a été utilisé pour calculer le coefficient de corrélation croisé (CV; q²) et le RMSE croisé. Les valeurs de CV sont considérées comme plus caractéristiques de la capacité prédictive du modèle. De nombreux auteurs considèrent la valeur de q2> 0,5 comme preuve ultime du pouvoir prédictif élevé du modèle QSAR. Les données utilisées pour obtenir q² correspondent aux composés de l'ensemble d'apprentissage utilisés pour déterminer R².

c. Z-score

Le Z-score est un autre paramètre de validation qui représente la différence absolue entre la valeur du modèle et celle du champ d'activité, divisée par la racine carrée de l'erreur quadratique moyenne de l'ensemble des données. Le Z-score a été utilisé pour détecter les molécules qui sont en dehors de l'ajustement, dites «aberrantes» (698).

d.Validation externe

Le test set est représenté par les composés qui n'ont pas été utilisés dans le développement du modèle. Dans plusieurs recherches, l'estimation de la corrélation de puissance prédictive réelle dans le modèle QSAR développé a été réalisée uniquement par comparaison des activités prédites et observées des molécules de test (699).

II. Criblage Virtuel pour la kinase AXL

Le domaine kinase de la protéine AXL généré par homologie et le modèle QSAR construit ont été utilisé pour faire un criblage virtuel de 400 dérivés synthétiques de la curcumine et sélectionner ceux qui présentent une meilleure activité inhibitrice contre AXL.

Notre stratégie de criblage virtuel a été effectuée sur deux niveaux, premièrement un filtrage sur la «plate-forme ChemBioServer» (700) a été effectué sur les 400 analogues pour éliminer les composés toxiques et qui ne répondent pas aux cinq règles de Lipinski (Lipinski Rule of Five). Ensuite, pour prédire l’activité des molécules qui restent un criblage a été réalisé en utilisant le modèle QSAR validé (Ligand Based Virtuel screening). Les composés potentiels retenus seront docker avec le domaine kinase AXL construit par homologie (Structure Based Virtuel Scrinning).

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II-1. Criblage Virtuel Ligand Based

400 molécules sont collectées à partir de la base de données de ressources de la curcumine (CRDB) Ver.1.1. Cette base de données est la première base complète et actualisée qui couvre exclusivement les analogues de la curcumine, leurs cibles moléculaires et leurs brevets, les variétés de Curcuma longa et la littérature existante sur la curcumine. Lancé en 2015, CRDB est une base de données à accès ouvert qui est manuellement organisée et référencée avec d'autres bases de données telles que PubChem, Scopus, Web of Science, PubMed, PatentScope pour fournir des données de haute qualité aux utilisateurs. Le portail Web du CRDB contient des interfaces conviviales et devrait être très utile aux chercheurs travaillant sur la conception moléculaire d’analogues de la curcumine à base de structure / ligand.

Avant de faire le criblage virtuel de ces 400 molécules, un filtrage a été effectué sur la «plate-forme ChemBioServer» (700) qui est un ensemble d’outils développés pour faciliter le criblage et l’analyse computationnels des composés, elle a été utilisée pour éliminer les composés toxiques en se basant sur une liste de 25 composés organiques toxiques connus inclus dans le serveur (Annexe2). Nous avons ensuite effectué un deuxième filtrage pour éliminer les composés non conformes aux cinq règles de Lipinski (Annexe3). L'application «Evaluation de modèle» dans le logiciel MOE est utilisée pour prédire l’activité de 355 molécules résidentes du 1^er filtrage en utilisant le modèle QSAR validé, ensuite toute molécule ayant une activité prédite supérieure au seuil fixé à pIC50≥6 (699) a été retenue pour être docker avec le modèle de la protéine kinase construit par homologie.

II-2. Criblage Virtuel Structure Based

L'amarrage moléculaire a été réalisé pour mieux comprendre l'interaction entre les ligands et la protéine cible. 63 molécules ayant une activité prédite ≥ à 6,00 (seuil) ont été dockés avec la structure cristalline de la kinase AXL obtenue par une approche de modélisation par homologie. Pour tous les 63 ligands, les charges de Gasteiger étaient désignées et les torsions, permettant de tourner pendant la procédure d'amarrage, sont ajoutées à l'aide des outils Autodock v.1.5.6. Le récepteur AXL a été préparé, des hydrogènes polaires ont été attribués, la grille a été configurée pour couvrir le site actif de l’AXL, les dimensions ont été définies à 30, 30, 30 Å (x, y et z) constituées de résidus du site actif. Le récepteur et les ligands ont été sauvegardés au format pdbqt, une inspection visuelle des résultats d'amarrage a été effectuée à l'aide du logiciel PyMOL.

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Résultats

I-Génération et Validation du Modèle 3D du Domaine Kinase de la Protéine

AXL

Dans cette partie, bien qu’aucune structure cristallographique de la kinase AXL ne soit disponible dans les bases de données, nous avons envisagé la construction d’un modèle structural 3D du domaine kinase AXL par homologie. Les structures précises du domaine kinase de la protéine MERTK membre de la famille TAM nous a permis de construire un modèle fiable de l’AXL kinase. Le logiciel AUTODOCK Vina nous a permis de calculer les positions de l’amarrage moléculaire de l’ATP dans cette protéine pour définir le site actif et valider le modèle. Le modèle obtenu porte de nouvelles informations et contribue à la compréhension des mécanismes d’interaction des ligands à l’intérieur du site catalytique. Il participe à la compréhension des règles nécessaires à la conception future d’inhibiteurs ATP-compétitifs à base de la curcumine. Les résultats de ce travail ont fait l’objet de notre première publication.

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Research Article a SciTechnol journal

Abstract

The last few years have seen the intensive investigation efforts for understanding the wide relevance of AXL activation in multiple aspects of oncogenesis, invasion, metastasis and drug resistance. Therfore, targeting AXL can be considered as one of the promissing approaches for the treatement of cancer. A series of curcumin derivatives which are natural polyphenolic coumponds were well- reported as an anti cancer and chemopreventive agents. We have investigated them as an ATP-competitive inhibitors of AXL kinase by using a docking studies. We built a model of AXL catalytic domain from the crystal structure of proto-oncogene tyrosine-protein kinase MER (MERTK) and the modeling of the three-dimensional (3D) structure of the AXL was performed by SWISS-MODEL homology modeling program. The quality and validation of the model were performed using PROCHECK and VERIFY 3D softwares. The Ramachandran plot was used to validate the overall stereochemical property of the protein. All curcuminoids formed a hydrogen bond with hinge region by Methionine (Met 623) and lysine (Lys 567) indicating that these compounds can be utilized therapeutically as a natural AXL inhibitors.

Keywords

Fatima et al., J Appl Bioinforma Comput Biol 2017, 6:3

DOI: 10.4172/2329-9533.1000142

Journal of

Applied

Bioinformatics

&

Computational

Biology

In Silico Inhibition Studies of

AXL Kinase by Curcumin and

its Natural Derivatives

Ghrifi Fatima*, Allam Loubna, Lakhlili Wiame and Ibrahimi Azeddine

Introduction

The AXL receptor tyrosine kinase , also known as UFO, Tyro7 and Ark, is a member of the tyrosine kinases receptors family TAM (Tyro3, AXL and MERTK) [1]. AXL, like the other TAM members, is activated via the interaction with the growth arrest-specific protein 6 (GAS6) ligand [2]. The receptor has been implicated in a number of oncogenic processes. AXL signalization enhances many essential biological functions for cancer formation and progression, including invasion, migration, survival, angiogenesis, cell transformation and

proliferation [3]. The increase of AXL activity or overexpression indicates a poor prognosis for the patients and has been reported to be associated with metastasis in several types of cancer [4-6]. AXL was demonstrated to confer resistance to chemotherapies when overexpressed in gastrointestinal stromal tumor [7] and breast cancer cells [8]. AXL was first cloned from myeloid leukemia cells in 1991[9].

*Corresponding author: Ghrifi Fatima, Biotechnology Lab (MedBiotech), Rabat

Medical and Pharmacy School, Mohammed V University in Rabat, Avenue Mes belarbi Alaoui, Suissi-Rabat, BP6203 Rabat instituts, Rabat,10000, Morocco, Tel: +212 537 77 28 50; E-mail: ghrifatima1000@gmail.com

Received: August 08, 2017 Accepted: November 07, 2017 Published: November

No crystal structure for Axl catalytic domain has been reported. Just the extracellular Ig-like domain was crystallized as fragments in complex with Gas6 in 2006 [10].

During the last decades, inhibition of AXL tyrosine kinases has emerged as an important approach for cancer therapy. Until this date, no inhibitor was clearly designed and marketed to inhibit AXL. However, Some clinical molecules, developed to inhibit other kinases, were evaluated against AXL given its interest, but these molecules continue to be inadequate having either limited efficacy, prohibitive toxicities or often exhibit less potency for AXL. All these are due to the similarity of the kinases catalytic domains, to which classical ATP competitive inhibitors (type I and II) tend to bind, particularly, with c-MET and MERTK kinases. Recently, the first AXL specific small molecule inhibitor, BGB324 originally discovered by BergenBio Company as R-428, entered phase 1 clinical trials [11].

Thus, there is a need for other therapies that can desactivate AXL kinase and keep the cancer in remission and increase survival. Previous studies have focused on the anticancer effects of natural products, for designing novel molecules ATP competitives with low toxicity.

Curcumin, has been shown to be effective against different cancers [12-14] in both in vitro and in vivo assays through a variety of mechanisms [15,16]. In addition, human clinical trials did not demonstrate any toxicity for curcumin at doses up to 10 g/day [17]. Curcumin, isolated from turmeric Curcuma longa contains curcumin as major component(77%) but it also contains demethoxycurcumin (DMC) (17%) and bisdemethoxycurcumin (BDMC) (3%) that have a remarkable anti- carcinogenisis effect. A study showed that

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demethoxycurcumin induced the G2/M step of cellular cycle arrest in human glioma U87cells [18]. In another study, BDMC was observed

to suppress the growth and activity in human adenogastric carcinoma [19].

Here, we focused on examining the interactions between curcumin as well as DMC and BDMC with AXL domain kinase using in silico appraoch and molecular docking. This study could be applied to develop new potential AXL inhibitors ATP competitives from curcumin and natural derivatives in the future. Since no data are available on AXL crystal structure. Herein we used homology modeling to this end.

Materials and Methods

AXL kinase homology modeling

We used the Swiss model server [20] to bluit the AXL model by homology modeling, a proto-oncogene tyrosine-protein kinase MER (MERTK PDB code:3BRB, resolution 1.9Å) was used as template.

The template was selected based on sequence identity and the coverage of the sequence obtained by alignement using Basic Local Alignment SearchTool [21] NCBI BLAST. AXL and MERTK sequences were obtained from UniProt database (ID: P30530; ID: Q12866 respectively) Uniprot.

Model validation

II. Etude 2D-QSAR des Analogues Synthétiques de la Curcumine Comme Inhibiteurs de la Kinase AXL

Pour rechercher des analogues avec un bon problème de la faible biodisponi

dans la partie bibliographique, une étude QSAR) a été envisagée dans cette partie. choisis par le logiciel MOE

présente les résultats de la validation et la vali régression PLS. Cette régression

l'activité biologique (pIC50) des composés tandis que la Figure 51 obtenue par le logiciel calculés et obsérvés pour le training set et le test set training set et test set.

Figure 50: Résultats de la validation et la validation croisée du PLS. Le cercle jaune entoure les paramètres de validation 0,99 et l’erreur quadratique moyenne RMSE =0.064 paramètres de validation croisée

corrélation croisé q² = 0,707

190

QSAR des Analogues Synthétiques de la Curcumine Comme Inhibiteurs

analogues avec un bon rapport structure/activité et f

problème de la faible biodisponibilité et le métabolisme rapide de la curcumine mentionné dans la partie bibliographique, une étude de relation structure-activité quant

s cette partie. Les 98 molécules de training set,

ont été utilisé pour construire le modèle QSAR. L

les résultats de la validation et la validation croisée du modèle QSAR obtenu par la ssion relie les descripteurs en tant que variables

l'activité biologique (pIC50) des composés de training set en tant que de variables dépendants obtenue par le logiciel MOE, montre la corrélation entre les logIC 50 pour le training set et le test set. L’analyse de PLS set identique pour le

ésultats de la validation et la validation croisée du modèle QSAR développé cercle jaune entoure les paramètres de validation : coefficient de corrélation R 0,99 et l’erreur quadratique moyenne RMSE =0.064, alors que le cercle rouge entoure les paramètres de validation croisée Cross validation RMSE= 0,672 et le coefficient de

QSAR des Analogues Synthétiques de la Curcumine Comme Inhibiteurs

ctivité et faire face au e rapide de la curcumine mentionné activité quantitative (2D-es 98 molécul(2D-es de training set, l(2D-es 30 d(2D-escripteurs

QSAR. La figure 50 QSAR obtenu par la variables indépendants à en tant que de variables dépendants, , montre la corrélation entre les logIC 50 se de PLS set identique pour le

QSAR développé par coefficient de corrélation R²est , alors que le cercle rouge entoure les

Figure 51: Corrélation entre les log I Les point en Bleu : Training set,

IC50 : Concentration de ligand qui provoque 50%de l’inhibition, pIC50

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log IC50 calculés (P pred) et observés (pIC50) pour le

les carrés enRouge : Test set

tration de ligand qui provoque 50%de l’inhibition, pIC50 = -log IC 50

(pIC50) pour le modèle QSAR 50

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III-Criblage Virtuel

400 dérivés synthétiques de la curcumine ont été sélectionnés de la base de données CRDB v.1.1, le premier filtrage sur la plateforme ChemBioServer a réduit le nombre à 355 dérivés en éliminant les molécules qui ne répondent pas aux cinq règles de Lipinski ou qui présentent certaines toxicités. Le modèle QSAR validé a été utilisé pour prédire l’activité des 355 molécules résultantes, seulement 63 molécules avec une pIC50 prédite≥6 (des valeurs d’IC50 inférieurs à 1000nM) ont été sélectionnées pour faire le docking moléculaire.

Le score de docking (affinité de liaison du complexe récepteur/ligand, plus l’énergie totale est faible, plus le complexe est stable stériochimiquement) est situé entre -9.0 et-3.4 kcal/mol. L’étape de criblage virtuel a permis de retenir trois composés potentiellement actifs sur le récepteur AXL. L’ensemble des résultats de QSAR et criblage virtuel ont fait l’objet de notre deuxième publication.

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DISCUSSION GENERALE

Le rôle joué par AXL dans la survie, la prolifération et les mécanismes de résistance aux médicaments dans différentes leucémies et tumeurs solides soutient fortement le choix d'inhibition de l'AXL en tant que stratégie anticancéreuse, en particulier dans le cas des cancers avancés. Plusieurs preuves cliniques chez des patients présentant une surexpression du gène AXL ont montré que les anomalies de l'AXL pouvaient être des facteurs oncogéniques cliniquement pertinents dans la plupart des formes de cancers, et le développement des monothérapies ciblées pourraient constituer la bonne indication thérapeutique. Cependant, seulement quelques médicaments candidats ont pour cible principale AXL et une seule molécule BGB324 déclarée comme un inhibiteur sélectif de l’AXL.

La curcumine est un polyphénol naturel, isolée du rhizome de la plante Curcuma longa linné (4), agit sur plusieurs cibles et voies de signalisation (5). Jusqu'à présent, il a été démontré que la curcumine possédait un large éventail d'activités pharmacologiques, notamment anti-inflammatoires (6), anticancéreuses (7) et antioxydatives. Des études effectuées sur des modèles cellulaires ont mis en évidence la pléiotropie de la curcumine. Au niveau moléculaire, la curcumine a été montré moduler de nombreuses molécules de signalisation soit directement ou indirectement en modulant l’expression d'autres protéines. Les cibles indirectes de la curcumine comprennent des facteurs de transcription, des enzymes, des facteurs de croissance, des récepteurs, des médiateurs inflammatoires, des molécules d’adhésion, des protéines de survie cellulaire, des chimiokines et des récepteurs de chimiokines, des protéines invasives et angiogéniques et des protéines régulatrices du cycle cellulaire. La curcumine, par sa structure s’est avérée directement interagir avec de nombreuses molécules de signalisation. Plus précisément, il a été démontré que ce polyphénol interagissait directement avec les protéines kinases, plus de 40 essais cliniques utilisant la curcumine ont été développés pour le traitement de divers maladies et cancers humains. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que la curcumine et ses dérivés naturels et synthétiques peuvent être utilisés comme inhibiteurs ATP compétitifs de la protéine kinase AXL. Mais l’un des défis auxquels nous sommes confrontés pour la conception de novo inhibiteurs AXL à base de la curcumine est l’absence de données cristallographiques sur le domaine kinase de la protéine AXL. Cette limitation a été résolue par l’utilisation des approches in silico.