Fiche technique
IgA Saliva ELISA
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif des anticorps IgA dans la salive humaine.
DM59171
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I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
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1. BUT DU TEST
Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif des anticorps IgA dans la salive humaine.
2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION
Les IgA représentent environ 15% à 20% des immunoglobulines dans le sang. Elles sont également présentes dans le mucus sécrété dans l'estomac, les poumons et les intestins. Cela empêche la liaison des microbes aux cellules épithéliales du tracte respiratoire et digestif. Cette immunoglobuline permet de lutter contre les agents pathogènes qui entrent en contact avec la surface du corps, sont ingérées ou inhalées.
Elle existe sous deux formes, IgA1 (90%) et IgA2 (10%) qui diffèrent par leur structure. L’IgA1 se trouve dans le sérum et est produite par les cellules B de la moelle osseuse, alors que l’IgA2 est produite par les cellules B situées dans les muqueuses et est sécrétee dans le colostrum, le lait maternel, les larmes et la salive.
Les IgA trouvées dans les sécrétions ont une forme spéciale. Ce sont des molécules dimères, reliées par deux chaînes additionnelles. L'une d'elles est la chaîne J (pour jointure), qui est un polypeptide de masse moléculaire de 1,5 kDa, riche en cystéine et ayant une structure complètement différente des autres chaînes d'immunoglobulines. La forme dimère d'IgA dans les sécrétions externes a aussi un polypeptide de même masse moléculaire (1,5 kDa) appelée chaîne de sécrétion et est produite par les cellules epitheliales.
Des taux faibles ou absents en IgA, nommés déficit sélectif en IgA, peut être une immunodéficience cliniquement significative.
3. PRINCIPE DU TEST
Les IgA salivaires présents dans l'échantillon rentrent en compétition avec l'antigène marqué à la peroxydase pour l'anticorps anti-IgA adsorbé sur microplaque (phase solide).
La séparation libre-lié est obtenue par simple lavage de la phase solide.
L’enzyme présent dans la réaction liée catalyse la réaction entre le substrat (H2O2) et le substrat TMB (TMB) en développant une coloration bleue qui vire au jaune après ajout de la solution d'arrêt (H2SO4).
L’intensité de la couleur développée est inversement proportionnelle à la concentration de IgA dans l'échantillon. La concentration de IgA dans l'échantillon est calculée sur la base d'une série d’étalons.
4. RÉACTIFS, MATÉRIEL ET EQUIPMENT 4.1. Réactifs et matériel fournis
1. MTP Microplate Plate
(1 Plaque de Microtitration à detacher) Anticorps anti IgA adsorbé sur la microplaque 2. ENZCONJ CONC Enzyme Conjugate (Conjugué) 20x concentrated
(1 flacon, 1 mL) Conjugué d'anticorps anti IgA avec peroxydase de raifort (HRP) 3. CAL 0 - 4 Standard (Etalons) 0 - 4
(5 flacon, 1 mL chaque) 4. CONTROL Control (Contrôle)
(1 flacon, 1 mL) Consulter les concentrations sur le certificat CQ 5. ASSAYBUF CONC Assay Buffer 5x concentrated
(1 flacon, 40 mL) Hepes buffer 25 mM pH 7.4; BSA 0,5 g/L 6. TMB SUBS TMB Substrate (Solution Substrat TMB)
(1 flacon, 15 mL) H2O2-TMB 0.26 g/L (éviter tout contact avec la peau 7. WASHBUF CONC Wash Buffer 50x concentrated (Tampon de lavage)
(1 flacon, 20 mL) NaCl 45 g/L; Tween-20 55 g/L 8. STOP Stop Solution (Solution d’Arrêt)
(1 flacon, 15 mL) Acide Sulfurique 0.15 mol/L (corrosive: éviter le contact avec la peau) 4.2. Réactifs requis, mais non fournis
Eau distillée.
4.3. Matériaux auxiliaires et instrumentation Multipette.
Un spectrophotomètre lecteur de micro-plaques calibré (450nm, 620-630 nm) Remarques
Conserver tous les réactifs à 2 °C - 8 °C, à l'abri de la lumière.
N'ouvrir le sachet de la microplaque qu'après l'avoir ramené à température ambiante et refermez-le tout de suite après avoir prélevé les barrettes à utiliser; une fois ouvert, les barrettes de microplaque sont stables jusqu'à la date d'échéance du coffret.
Éviter de détacher la feuille adhésive des bandes qui ne sont pas utilisées pendant l'analyse en cours.
5. AVERTISSEMENTS
Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l’usage professionnel. Non prévu pour usage interne ou externe chez les humains ou les animaux.
Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire.
Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité.
Comme conservateurs, certains réactifs contiennent du ProClin 300. Éviter tout contact de la peau ou des muqueuses.
Le Chromogène TMB contient un irritant qui peut être nocif si inhalé, ingéré ou absorbé à travers la peau. Pour empêcher des lésions, éviter toute inhalation ou ingestion par la peau ou les yeux et tout contact cutané ou oculaire.
Eviter tout contact avec la solution d’arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées.
Éviter d’exposer le réactif TMB/H2O2 à la lumière directe du soleil, aux métaux ou aux oxydants. Ne pas congeler les réactifs.
Cette méthode permet la détermination de IgA pour une concentration comprise entre 0.5 et 400 µg/mL.
6. PRÉCAUTIONS D'USAGE
Observer rigoureusement l'ordre des passages indiqué dans le présent protocole. Les résultats présentés ici ont été obtenus en utilisant les réactifs spécifiques énumérées dans ces Instructions d'Utilisation.
Tous les réactifs doivent être conservés à une température contrôlée de 2 °C - 8 °C dans leurs conteneurs originaux. Les exceptions sont clairement marqués. Les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration lorsqu'ils sont conservés et manipulés conformément aux instructions fournies.
Avant usage, laisser reposer tous les éléments des coffrets et les échantillons à température ambiante (22 °C - 28 °C) et mélanger avec soin.
Ne pas échanger des éléments du coffret provenant de lots différents. Les dates d'échéance rapportées sur les étiquettes des récipients d'expédition et sur celles de tous les ampoules doivent être observées.
Ne pas utiliser d'éléments au-delà de leur date d'échéance.
Si vous utilisez des équipements automatisés est de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer que le kit a été correctement validées.
Un lavage incomplet ou peu soigné et une aspiration insuffisante du liquide dans les puits des tests ELISA peuvent provoquer un manque de précision et/ou un arrière-plan élevé. Afin d’augmenter les performances du kit sur des systèmes automatiques, il est recommandé d’augmenter le nombre de lavages
Il est important de maintenir constants les temps de réaction dans chaque puits afin d'obtenir les résultats susceptibles d'être répétés. Le pipetage des échantillons ne doit pas durer plus de 10 minutes afin d'éviter tout résultat incorrect. S'il se prolonge au-delà des 10 minutes, il est recommandé de suivre l'ordre de distribution. Si vous devez utiliser plus d’une microplaque, il est conseillé de répéter la courbe dose-réponse.
L’ajout de la solution de substrat donne lieu à une réaction cinétique qui est interrompue par l'ajout de la solution de blocage. Par conséquent, il est nécessaire d'ajouter le substrat et la solution bloquante dans la sequence même afin d'éliminer toute variation temporelle pendant la réaction.
Observer les instructions relatives à l'exécution du contrôle de qualité dans les laboratoires cliniques en testant les contrôles et/ou les groupes de sérum.
Observer la plus grande précision dans la reconstitution et la distribution des réactifs.
Ne pas utiliser des échantillons microbiologiquement contaminés ou des échantillons hautement
7. PROCÉDURE
7.1. Préparation des étalons (CAL 0 … CAL 4) Les étalons et contrôles sont prêts à l'emploi.
Les concentrations suivantes correspondent aux étalons: 0; 6.9; 62; 132; 400 ng/mL.
La concentration des étalons est 1000 fois plus faible que les valeurs rapportées dans la gamme de référence parce que les échantillons sont dilués 1: 1000, tandis que les étalons sont pipettés directement.
Les concentrations des étalons à entrer dans l'instrument pour les calculs sont:
CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL4
µg/mL 0 6.9 62 132 400
Une fois ouverts, ils sont stables pendant 6 mois à 2 - 8°C.
7.2. Préparation du tampon pour essai IgA
Diluer le contenu du tampon pour essai IgA concentré 5X avec 160 mL d'eau distillée ou désionisée dans un récipient approprié. Pour préparer différents volumes, respecter le taux de dilution 1: 5. Conserver à 2 - 8 ° C jusqu'à la date de péremption imprimée sur l'étiquette.
7.3. Préparation du conjugué dilué Préparer immédiatement avant l'emploi.
Ajouter 50 μL de conjugué (réactif 4) à 950 µL de tampon pour essai IgA dilué (réactif 3). La quantité de conjugué dilué est proportionnelle au nombre de tests Mettre à agiter délicatement sur un agitateur rotatif pendant au moins 5 minutes. Stable pendant 3 heures à température ambiante (22 - 28°C)
7.4. Préparation de la solution de lavage
Avant l'usage, diluer le contenu de chaque flacon de solution de lavage concentrée et tamponnée (50x) avec de l'eau distillée jusqu'à un volume de 1000 mL. Pour préparer des volumes moindres, respecter le rapport de dilution de 1:50. La solution de lavage diluée est stable à 2 °C - 8 °C pendant au moins 30 jours.
7.5. Préparation de l'échantillon
Les échantillons de salive doivent être prélevés uniquement à l’aide de dispositifs d’échantillonnage spéciaux adaptés à la salive (flacon et paille).Pour la collecte des échantillons il est recommandé d’utiliser un tube à centrifuge en verre et une paille en plastique si nécessaire.
Faire passer la salive à travers la paille et jusque dans le tube en verre; Centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 3000 t/min.
Ne pas utiliser de tube en plastique ou des dispositifs disponibles dans le commerce pour la collecte de salive pour éviter les faux résultats.
Préparer la solution A pour chaque échantillon en diluant le liquide surnageant au 1:20 avec du tampon pour essai dilué (par exemple: 50 µL jusqu'à 1 mL); puis mélanger délicatement toutes les solutions A en les laissant pendant au moins 5 minutes sur un agitateur rotatif. Ensuire, diluer ces solutions encore une fois au 1:50 avec le tampon pour essai dilué (ex: 20 µL jusqu'à 1 mL). La dilution finale obtenue est de 1:1000.
Mélanger doucement en laissant ces dilutions pendant au moins 5 minutes sur un agitateur rotatif.
Si le dosage est pas effectué le jour même de la collection salivaire, congeler la salive à -20 ° C.
7.6. Procédure
Amener tous les réactifs à température ambiante (22 °C - 28 °C) pendant au moins 30 minutes. A la fin du test, conserver immédiatement les réactifs à 2 °C -8 °C; éviter une longue exposition à température ambiante.
Les bandes de puits non utilisées doivent être immédiatement rangées dans le sachet refermable contenant le déshydratant et stockées à 2 °C - 8 °C.
Pour éviter la potentielle contamination microbienne et/ou chimique ne pas reverser les réactifs inutilisés dans les flacons originaux.
Afin d'augmenter la précision des résultats du test, il est nécessaire de travailler en double: préparer deux puits pour chaque point de la courbe d'étalonnage (CAL 0 – CAL 4), deux pour chaque contrôle, deux pour chaque échantillon et un pour l'échantillon blanc.
Réactif Étalon Échantillons/
Contrôles Blanc
Étalon CAL 0 – CAL 4 25 µL
Échantillons/Contrôles
dilués 25 µL
Conjugué dilué 100 µL 100 µL
Laisser incuber 1 h à 22 - 28 °C.
Retirer le contenu de chaque puits, laver les puits 3 fois avec 300 μL de solution de lavage diluée.
Note importante: lors de chaque étape de lavage, secouer doucement la plaque pendant 5 secondes et retirer l’excès de liquide en tapant légèrement la plaque renversée sur du papier absorbant.
Laveur automatique: si un équipement automatique est utilisé, laver les puits au moins 5 fois.
Substrat TMB 100 µL 100 µL 100 µL
Laisser incuber 15 minutes à température ambiante (22 - 28°C) à l'abri de la lumière.
Solution d'arrêt 100 µL 100 µL 100 µL
Agiter doucement la microplaque.
Lire l'absorbance (DO) à 450 nm en mettant à zéro avec le référence 620-630 nm ou avec le blanc dans les 5 minutes.
8. CONTRÔLE DE QUALITÉ
Chaque laboratoire devrait analyser les échantillons dans la gamme des niveaux élevés, normaux et bas en IgA pour vérifier la qualité du test. Ces échantillons devraient être traités comme inconnus et les valeurs determinées à chaque test. Il est important de conduire des statistiques pour contrôler la qualité et le bon continu des tests. Des méthodes statistiques appropriées devraient être employées pour vérifier la tendance. Le laboratoire devrait définir des limites d'acceptabilité, comme par exemple les interceptions de 80, 50 et 20% de la courbe d'étalonnage pour évaluer la reproductibilité. De plus, la DO maximale devrait être constante avec l'expérience précédente. Une déviation significative par rapport aux prestations établies peut indiquer un changement non observé des conditions expérimentales ou une dégradation des réactifs du coffret. Dans ce cas, iI est conseillé d'utiliser des réactifs frais afin de determiner la raison des variations.
9. RÉSULTATS
9.1. Densité optique moyenne
Calculer la densité optique moyenne (DOmean) de chaque point de la courbe d'étalonnage et de chaque échantillon.
9.2. Calcul des résultats – Méthode automatique
Pour utiliser la méthode, les algorithmes de calcul recommandés sont les suivants : 4 paramètre logistique, sigmoïde logistique ou spline cubique lisse.
9.3. Calcul des résultats – Méthode manuelle
Une courbe étalon est utilisée pour déterminer la concentration des IgA dans des échantillons inconnus.
1. Notez les absorbances obtenues à partir de l'impression du lecteur de microplaques.
2. Reportez l’absorbance pour chaque valeur double des étalons en fonction de la concentration en IgA correspondante en µg/mL sur du papier millimétré.
3. Reliez les points de la courbe étalon pour obtenir la meilleure courbe.
4. Pour déterminer la concentration des IgA des échantillons inconnus, repérez l'absorbance moyenne des doublons pour chaque échantillon inconnu sur l'axe vertical du graphique, trouver le point sur la courbe d'intersection, et lire la concentration (en µg/mL) à partir de l'axe horizontal du graphique (les doublons de l'inconnu peuvent être rendues en valeur moyenne).
10. VALEURS DE RÉFÉRENCE
Basé sur les données de la littérature et sur les résultats obtenus avec le kit IgA IBL, une gamme très sommaire de la normalité est: de 40 à 170 µg/mL.
Il est important de noter que la détermination d'une gamme de valeurs attendues dans une méthode donnée pour une population «normale» est tributaire de nombreux facteurs, tels que la spécificité et la sensibilité de la méthode en usage, et de la population étudiée. Par conséquent, chaque laboratoire devrait examiner la gamme spécifiée par le fabricant comme un guide général et produire leur propre gamme de valeurs attendues sur la base des laboratoires où la population autochtone habite.
11. PARAMÈTRES CARACTÉRISTIQUES 11.1. Sensibilité
La concentration minimale de IgA mesurable est de 0.5 µg/mL avec une limite de confiance de 95 %.
11.2. Spécificité
L'anticorps employé présente les réactions croisées suivantes, calculées à 50 % selon Abraham:
h IgA 100.0 % h IgA1 124.5 % h IgA2 145.5 % h IgG <0.3 % h IgM <0.3 %
11.3. Corrélation avec le dosage RIA
Le coffret de IgA Saliva ELISA a été comparé avec un coffret disponible en commerce. 22 échantillons de sérum ont été testés. La courbe de régression est:
y = 1.5865x – 7.614 r= 0.9478 (r2 = 0.8984)
11.4. Effet de surdosage (Hook Effect)
Aucun effet de surdose n’a été observé avec ce test IgA ELISA < 600 µg/mL 12. DISPOSITIONS RELATIVES À L'ÉLIMINATION DES DÉCHETS Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois en vigueur.
13. BIBLIOGRAPHIE
- Tomasi, T.B. Jr. Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall. (1976) - Ben-Aryeh H., et al Archive of Oral Biol. 35, 929-931 (1990) - Smith D.J., et al J. Dental Research 66, 451-456 (1987)
- Ventura M.T.et al Allergol Immunopath (madr) 19, 183-185 (1991) - Kugler J., et al J. Clin. Immunol. 12, 45-49 (1992)
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- Ruan M.S., Chung-Hua-Kou-Chiang-Hsueh-Tsa-Chin, 25, 158-160 (1990) - Jemmot III J.B., et al J. Personality and Social Psychology 55, 803-810 (1988)
- Kugler J.A review. Psychotherapy, Psychosomatic Medicine and Psychology, 41, 232-242 (1991) - Shirtcliff E.A., et al Psychoneuroendocrinology, 26, 165-173 (2001)
- Chard T. An introduction to radioimmunoassay and related technics 14. ERREUR CAUSES POSSIBLES / SUGGESTIONS
Aucune réaction colorimétrique du dosage - non distribution du conjugué
- contamination du conjugué et/ou du substrat
- erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs dans le mauvais ordre ou en provenance des mauvais flacons, etc.)
Réaction trop faible (DO trop basse)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse Réaction trop intense (DO trop élevée)
- conjugué non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée
- mauvaise qualité de l'eau utilisée pour la solution de lavage (bas degré de déionisation) - lavages insuffisants (conjugué non entièrement aspiré)
Valeurs inexplicablement hors plage
- contamination des pipettes, embouots ou récipients - lavages insuffisants (conjugué non entièrement éliminé) CV% intra-essai élevé
- les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage
- le laveur de microplaques ne lave pas correctement (suggestion : nettoyer la tête du laveur) CV% inter- essai élevé
- conditions d'incubation non constantes (temps ou température)
- contrôles et échantillons non distribués en même temps (avec les mêmes intervalles) (contrôler l'ordre de distribution)
- variabilité intrinsèque des opérateurs
Σύμβολα
REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθμός-Κατ.:
LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείταιαπό:
No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο
IVD
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro Διάγνωση.
Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / Διαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου.
Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.
Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.
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