Mise en œuvre du protocole : test ELISA

(1)

Lisez le protocole, vérifiez que vous avez repéré le matériel à utiliser (X), organisez votre paillasse puis mettez en œuvre le protocole

Matériel : (on utilise des produits de substitution)

• Une barrette de 8 puits au fond desquels sont fixés des antigènes correspondant à ceux injectés lors de la vaccination

• 6 solutions d’anticorps antitoxine de concentrations différentes appelées C1, C2, C3, C4, C5, C6

Concentration

d’AC (UI/ml) C1 C2

(=C1/2) C3

(=C1/4) C4(=C1/8) C5(=C1/32) C6(=C1/128)

0,4 0,2 0,1 0,05, 0,0012 0,003

• Sérum T (témoin) d’un patient qui n’est plus immunisé

• Sérum X de l’individu à tester

• Solution d’anticorps de détection anti anticorps couplé à une enzyme = complexe entre anticorps et enzyme

• Solution de substrat de l’enzyme TMB, peroxydase = H2O2

(L’action de l’enzyme sur ce substrat se traduit par une coloration)

• Solution de lavage (tampon PBS tween)

• Micropipette, cônes, bécher poubelle pour les cônes

• Feutre marqueur

• Poubelle d’évier Protocole

1. Repérez le matériel à utiliser et cochez dans la liste au-dessus.

2. Organiser votre plan de travail pour manipuler proprement.

Cochez au fur et à mesure à 3. L’encoche de la barrette du puits, placée à gauche permet de repérer, à sa droite, le puits

1, marquez les puits 1, 2, 3, 4, 5, 6, T, X, à l’aide du marqueur

Bien respecter l’ordre des puits le long de la barrette

4. Déposer 40 µL des solutions d’anticorps C1->C6, sérum T et sérum X dans les puits 1 cône par solution

5. Laisser incuber 10 minutes

6. Vider la barrette en la renversant d’un geste rapide au-

dessus du papier absorbant de manière à éviter le mélange des produits, tapez sur le papier absorbant pour éliminer les dernières gouttes

7. Remplir les puits avec la solution de lavage (tampon), vider à nouveau 8. Recommencer

9. Déposer dans chaque puits 40 µL de solution d’AC de détection 10. Laisser incuber 5 minutes

11. Vider la barrette (comme précédemment) 12. Laver 2 fois de suite avec la solution de lavage

13. Déposez dans chaque puits 80 µL de solution de substrat (2X 40µL)

14.Observez la coloration des puits (faites une photo, les colorations peuvent changer avec le temps)

15. A la fin vider les barrettes, retirer la gélose et les placer dans la cuvette