NOTE
Étude par chromatographie liquide haute
performance de la composition en acides citrique, malique et ascorbique des jus de différentes
variétés d’agrumes marocaines
Aziz HASIB1, Abderrahim JAOUAD2, Mostafa MAHROUZ2
SUMMARY High performance liquid chromatography study of citric, malic and ascorbic acid contents in various varieties of Moroccan citrus juices.
Citric, ascorbic and malic acids are very important in the formulation of drinks.
These acids were separated and measured by high performance liquid chro- matography in the Moroccan orange and lemon juices. The mobile phase was adjusted at an optimum pH of 2.15. Good chromatograms were obtained by coupling three RP18 columns of 25 cm of length. The absorbance at 210 nm and 250 nm, was used for quantification. Study of the repeatability gives coeffi- cients of variation lower than 3.8. This method of separation is appropriate for the quality control of drinks containing citrus juice.
Key-words: citric acid, malic acid, ascorbic acid, orange, lemon.
RÉSUMÉ
Les acides citrique, ascorbique et malique sont présents dans les fruits et leur dosage constitue une étape préliminaire dans la formulation des boissons.
Dans ce travail, nous avons dosé ces acides dans les jus de différentes varié- tés d’orange et de citron marocaines par chromatographie liquide de haute performance. Une bonne séparation a été obtenue par couplage de trois colonnes type RP18 de 25 cm de longueur et une phase mobile constituée d’eau et d’acide phosphorique à pH 2,15. Un détecteur-intégrateur UV à bar- rette de photodiodes réglé à 210 nm et 250 nm a été utilisé. Cette méthode de séparation convient au contrôle de la qualité des boissons à base de jus d’agrumes.
Mots clés : acide citrique, acide ascorbique, acide malique, orange, citron.
1. Laboratoire de chimie agroalimentaire, Département de chimie et environnement, Faculté des Sciences et Techniques de Beni-mellal, BP 523, Beni-mellal, Maroc.
2. Laboratoire de chimie organique appliquée, Unité de chimie agroalimentaire, Département de chimie, Faculté des Sciences Semlalia de Marrakech, Avenue prince My Abdellah, Marrakech, Maroc.
* Correspondance.
1 - INTRODUCTION
La présente étude entre dans le cadre d’un projet de valorisation des princi- paux fruits cultivés au Maroc et dont la production reste faiblement exploitée.
Elle vise à la diversification des produits issus de ces fruits par la mise en place de nouvelles formulations purement naturelles, stables, et ayant conservé toutes leurs qualités organoleptiques, nutritionnelles et hygiéniques.
Les citrons et les oranges marocains sont riches en acide citrique, ascorbique et malique. Ces acides jouent un rôle important dans la conservation et la stabilisation des boissons (CASTANERet al., 1996 ; CHEFTELet al., 1992). Une concentration éle- vée en acide ascorbique permet d’empêcher le brunissement polyphénolique et d’inhiber la production de l’hydroxyméthylfurfural (STEGRENE MATEet al., 1997). En revanche, la dégradation de cet acide, suite à une pasteurisation, contribue au bru- nissement non enzymatique des jus de fruit (ROIGet al., 1996 ; SILIHAet al., 1996).
La détermination de la composition en ces différents acides constitue une étape préliminaire dans la formulation des boissons à base de jus de fruits.
La technique de dosage que nous avons choisie est la chromatographie liquide haute performance (CLHP) qui permet l’analyse rapide et simultanée des acides organiques faisant l’objet de ce travail. Un grand nombre de publications décrivent des modes opératoires très variés (CALLULet al., 1992 ; DE BACKER et NAGELS, 1996 ; GOIFFONet al., 1985 ; KENNEY, 1991 ; KLAMPFL1999 ; SHAWet WILSON, 1983). La méthode choisie est la chromatographie de phase inverse dans laquelle les acides organiques, composés polaires, sont peu retenus sur une colonne de silice greffée n-alkyle.
2 - MATÉRIEL ET MÉTHODES
2.1 Préparation des échantillons
Les essais expérimentaux ont été effectués sur six variétés d’orange (Citrus sinensis) et deux de citron (Citrus limonia) (tableau 1) cultivées dans la plaine de Tadla (Maroc) et récoltées, à maturité, sur différentes périodes. Les jus fraîche- ment extraits ont été centrifugés 10 min à 3 150 g, dilués au 1/10edans l’eau distillée et filtrés sur membrane Millipore 0,45 µm avant analyse.
2.2 Fractionnement CLHP
– Chromatographe GILSON équipé d’une vanne Rheodyne à boucle d’injec- tion de 10 µL.
– Détecteur-intégrateur UV à barrette de photodiodes CRYSTAL 240.
– Phase mobile : eau désionisée, bidistillée, filtrée sur membrane millipore 0,45 µm puis dégazée sous vide et acidifiée à pH 2,15 par l’acide phosphorique (SDS, p.a. à 85 %).
– Phase stationnaire : trois colonnes Lichrosorb RP18 (25 ×0,46 cm) mon- tées en série.
3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION
La figure 1 représente le chromatogramme obtenu avec un mélange témoin des principaux acides organiques susceptibles d’être présents dans les jus de citron et d’orange. Malgré le couplage de trois colonnes de 25 cm de longueur, la durée d’une analyse n’excède pas 1 h.
Les acides organiques des jus ont été identifiés par comparaison de leurs temps de rétention avec ceux des composés standards. On retrouve les acides : malique, malonique, ascorbique et citrique. Les composés les plus polaires n’ont pas été identifiés (figures 2a et 2b). Les droites d’étalonnage des différents acides organiques ont des coefficients de corrélations supérieurs à 0,999.
Nous avons testé la reproductibilité de la méthode en analysant six fois le même jus. Les résultats de ces essais sont consignés dans le tableau 2. Le coefficient de variation des mesures et l’intervalle de confiance autour de la moyenne ne dépassent pas 4 % pour les trois acides étudiés.
Le dosage de l’acide ascorbique a été effectué à 250 nm. À cette longueur d’onde, l’absorbance de l’acide ascorbique est très importante et le chromato- gramme obtenu présente un seul pic (figure 3).
La méthode de dosage a été appliquée sur les jus obtenus à partir des six variétés d’orange et des deux variétés de citron les plus cultivées au Maroc. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3. Pour chaque acide, nous avons noté la concentration moyenne dans le jus.
Pour une même variété de citron ou d’orange récoltée durant la même période, les concentrations en acides organiques dans les jus peuvent être très différentes. C’est le cas en particulier de la variété d’orange Maroc-late récoltée en avril et de la variété de citron Roumi récoltée en avril et juin. Ceci peut s’ex- pliquer par la variation des conditions de culture entre les différentes régions de provenance.
Tableau 1
Les périodes de récolte des différentes variétés d’orange et de citron marocaines Table 1
The harvest periods of various Moroccan orange and lemon varieties
Variété Période de récolte
Orange clémentine Novembre à janvier Orange Navel Thomson Décembre à avril
Orange Hameline Décembre à avril Orange Salustiana Janvier à mars Orange w. sanguine Janvier à avril
Orange Maroc late Mars à juin
Citron roumi Décembre à juin
Citron beldi Novembre à décembre
On observe aussi une différence variétale. Ainsi, pour les oranges, la variété Maroc-late est la plus riche en acide citrique et en acide malique. Dans le cas des citrons récoltés en décembre, la variété Roumi contient davantage d’acide citrique et d’acide malique que la variété de citron Beldi.
La période de récolte a également une influence, en particulier pour les teneurs en acide citrique qui diminuent notablement entre la récolte d’hiver et une récolte plus tardive. C’est le cas des variétés de citron Roumi et d’orange Navel Thomson qui sont produites sur différentes saisons de l’année.
Enfin, si on compare le jus de citron et le jus d’orange, le premier est très riche en acide malique et en acide citrique, en revanche le jus d’orange contient davantage d’acide ascorbique.
Figure 1
Chromatogramme d’un mélange témoin d’acides organiques Couplage de trois colonnes RP18 de 25 cm ; Phase mobile : Eau + H3PO4à pH 2,15
et débit : 0,5 ml/min ; Détection : UV 210 nm.
Pics 1 : galacturonique (0,58 g/l) ; 2 : tartrique (1,3 g/l) ; 3 : malique (2,18 g/l) ; 4 : malonique (0,45 g/l) ; 5 : ascorbique (1,0 g/l) ; 6 : acétique (1,0 g/l) ; 7 : citrique (3,5 g/l) ; 8 : succinique (1,0 g/l) ;
9 : fumarique (0,17 g/l).
Chromatogram of organic acids standard mixture
Three 25 cm RP18 columns connected; Mobile phase: Water + H3PO4at pH 2.15 and debit:
0.5 ml/min; Detector: UV at 210 nm; Ambient temperature.
Peaks 1: galacturonic; 2: tartaric; 3: malic; 4: malonic; 5: ascorbic; 6: acetic; 7: citric; 8: succinic;
9: fumaric.
210 nm Mélange témoin 0,20
0,15
0,10
0,05
0,0
0 20 40 60
Minutes 5
1 2
3
4 6
7
8 9
210 nm Jus de citron (1:10) 210 nm Jus d’orange
(1:10)
– 0,4
– 0,3
– 0,2
– 0,1
0,0 0,04
0,03
0,02
0,01
0,0
0 20 40 60
Minutes 0
a) b)
20 40 60
3 5
7 7
5
3
4
Minutes
Figure 2
Chromatogrammes d’un jus d’orange (figure 2a) et d’un jus de citron (figure 2b) Couplage de 3 colonnes RP18 de 25 cm ; Phase mobile : Eau + H3PO4à pH 2,15 et débit :
0,5 ml/min ; Détection : UV à 210 nm ; Température ambiante.
Pics 3 : malique ; 4 : malonique ; 5 : ascorbique ; 7 : citrique.
Chromatograms of orange juice (1:10) (v:v) (figure 2a) and lemon juice (1 :10) (v:v) (figure 2b)
Three 25 cm RP18 columns connected; Mobile phase: Water + H3PO4in pH 2.15 and debit:
0.5 ml/min; Detector: UV at 210 nm; Ambient temperature.
Peaks 3: malic; 4: malonic; 5: ascorbic; 7: citric.
4 - CONCLUSION
La technique de CLHP que nous avons utilisée pour l’analyse des acides : citrique, malique et ascorbique dans les jus de citron et d’orange est très fiable.
Les résultats obtenus ont montré que les concentrations en ces différents acides sont variables en fonction de la variété, de la période de récolte et des conditions de culture. La connaissance de cette composition permet de formu- ler différents mélanges, à base de jus d’orange, de jus citron et d’autres fruits, sans avoir recours à des conservateurs ou des antioxydants chimiques.
Reçu le 14 mai 2001, accepté le 27 septembre 2001.
Tableau 2
Reproductibilité de la détermination des teneurs en acides citrique, malique et ascorbique dans les jus de citron et d’orange
Table 2
Reproducibility of the determination of citric, malic and ascorbic acid contents in lemon and orange juice
Quantité contenue Quantité contenue
N° dans le jus de citron Roumi dans le jus d’orange Maroc-late
g·L–1 g·L–1
Malique Ascorbique Citrique Malique Ascorbique Citrique
1 0,791 0,526 73,82 0,777 0,729 27,37
2 0,791 0,503 74,25 0,773 0,746 27,48
3 0,763 0,559 73,93 0,782 0,749 27,57
4 0,774 0,526 74,72 0,799 0,719 27,86
5 0,780 0,510 74,59 0,797 0,740 27,66
6 0,774 0,514 75,48 0,797 0,711 27,66
Moyenne 0,779 0,523 74,47 0,788 0,732 27,60
CV %# 1,40 3,80 0,82 1,50 2,09 0,61
IC % 1,45 4,02 0,86 1,52 2,18 0,64
# CV : coefficient de variation ; * IC : intervalle de confiance au seuil de 5 % exprimé en pourcent de la moyenne.
Figure 3
Chromatogramme d’un jus d’orange détecté à 250 nm Couplage de 3 colonnes RP18 de 25 cm ; Phase mobile : Eau + H3PO4à pH 2,15
et débit : 0,5 ml/min ; Température ambiante. Pic 5 : acide ascorbique.
Absorbance of orange juice with detection at 250 nm Three 25 cm RP18 columns connected; Mobile phase: Water + H3PO4in pH 2.15
and debit: 0.5 ml/min; Ambient temperature. Peak 5: ascorbic acid.
250 nm Jus d’orange
(1:10) 0,15
0,12
0,08
0,04
0,0
0 20 40 60
Minutes 5 5
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Tableau 3
Composition en acides citrique, malique et ascorbique des jus de différentes variétés d’orange et de citron marocain
Table 3
Citric, malic and ascorbic acids content of various varieties of Morrocan orange and lemon juice
Fruits Variétés Période Malique Ascorbique Citrique
de récolte g·L–1 g·L–1 g·L–1
Navel Thomson 1 décembre 0,679 0,664 17,330
Navel Thomson 2 avril 1,046 0,834 11,860
Navel Thomson 3 avril 1,146 0,721 11,540
Clémentine décembre 1,473 0,681 17,655
Salustiana février 0,699 0,740 16,690
Hameline 1 avril 0,954 0,756 14,460
Orange Hameline 2 avril 1,269 0,948 19,895
W. Sanguine 1 avril 0,656 0,718 17,160
W. Sanguine 2 avril 0,645 0,751 18,005
Maroc-Late 1 avril 1,633 0,848 21,480
Maroc-Late 2 avril 1,259 0,740 23,390
Maroc-Late 3 avril 1,430 0,715 21,270
Maroc-Late 4 avril 0,787 0,721 27,520
Roumi 1 décembre 4,528 0,492 94,500
Roumi 2 décembre 4,958 0,516 92,420
Roumi 3 avril 2,750 0,508 82,800
Citron Roumi 4 avril 1,362 0,492 78,530
Roumi 5 Juin 0,783 0,521 74,620
Roumi 6 Juin 1,282 0,382 74,825
Beldi 1 décembre 2,210 0,397 80,380
Beldi 2 décembre 2,408 0,389 86,336
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