Les techniques de préparation des coupes pour
les microscopies optique et électronique
Histologie-Embryologie Pr. Mariam Naciri
Université Mohammed V-Agdal Faculté des Sciences de Rabat
Laboratoire de Zoologie et de Biologie générale
Visualisation in situ de substances chimiques
Autoradiographie Cyto-histochimie
- réaction chimique +/- spécifique dont le résultat est appréciable a l’observation microscopique sous forme d’un précipité coloré
- PAS (glycogène) ; noir Soudan (graisses) ; bleu de Prusse
Immuno-cyto-histochimie (immunofluroscence)
Hybridation in situ
Visualisation in situ de substances chimiques
Immuno-cyto-histochimie (Immunofluorescence)
- Mettre en évidence et localiser à l’échelon tissulaire, cellulaire ou sub- cellulaire toutes sortes d’antigènes, révélés par leurs anticorps
spécifiques
- Le complexe antigène-anticorps est révèle par l’adjonction de molécules enzymatiques sur lesquelles on fait agir leur:
*substrat spécifique (microscopie en lumière blanche) ou
*de fluorochromes (microscopie en lumière ultra violette) ou
*de corps opaques aux électrons (microscopie électronique)
Reaction immunocytochimique
L'immunohistochimie (ou IHC) est une technique qui permet de mettre en évidence:
- des sites antigéniques sur des cellules grâce à des anticorps spécifiques
- une mise en évidence utilisant un procédé
colorimétrique (on utilise généralement une enzyme : la peroxydase).
Principe d'une réaction immunohistochimique
Une immunoréaction est composée de trois éléments principaux :
1.La préparation (tissu, cellule, organite subcellulaire, virus ...) contenant l'antigène à étudier ;
2.Un anticorps2 dirigé contre l'antigène recherché ;
3.Le système révélateur qui permet de visualiser l'immunoréaction.
Principe d'une réaction immunohistochimique
La qualité des résultats dépend de l'utilisation judicieuse de ces trois éléments (la préparation, Anticorps 2 , le système révélateur)
a/ Les termes :
- immunohistologie et immunohistochimie (immunoréactions sur tissus) - immunocytologie et immunocytochimie (immunoréactions sur cellule) - immunocytologie est plutôt employé pour la cytométrie en flux
- immunohistologie plutôt réservé aux immunomarquages sur tissus et coupes de tissus.
b/ L'anticorps dirigé contre l'antigène recherché est souvent appelé anticorps primaire :
une immunoréaction est en effet la plupart du temps réalisée au
moyen d'une cascade d'anticorps (anticorps primaire, secondaire,
éventuellement tertiaire)
Quantification a l’échelon cellulaire ou tissulaire
Cytométrie par analyses d’images microscopiques
Le microscope devient un instrument de mesureLes cellules sont caractérisées par un ensemble de paramètre dont on peut mesurer les valeurs et qui représentent la morphologie, la couleur, la densitomètre…
Applications :
- dosage in situ (ADN, récepteurs, antigènes) ;
- identification des cellules (évolution possible vers l’automatisation de la lecture cytologique)
.
Cytométrie en flux
les cellules en suspension sont colorées par des fluorochromes, illuminées par un faisceau laser ; l’analyse des interactions entre cellules et faisceau permet de les caractériser et de les compter ; on mesure:
La quantité de substance fluorescente
le dosage in situ des molécules sur
lesquelles elles se sont fixées
Cytométrie en flux
Les cellules sont dispersées dans du sérum physiologique et passent à travers un
faisceau de lumière laser.
La diminution de l’intensité du faisceau direct permet de
mesure la masse cellulaire ou la masse de DNA.
Les cellules qui émettent de la fluorescence sont reconnues par une cellule photoélectrique particulière.
Enfin, on peut éventuellement séparer les cellules selon leur charge électrique : séparateur de cellules
Description sommaire d’un appareillage de cytométrie de flux.
Immunohistochimie
Intérêts
- Détection spécifique de protéines sur matériel cytologique ou sur coupes
tissulaires
- localisation (+/- quantification) d'une
protéine dans une cellule ou un tissu
Accès des Ac à l'Ag : la fixation
1/ Fixation physique : congélation
Tissu plongé dans un liquide refroidissant (iso pentane –130°C) Enrobage dans substance protectrice (OCT)
Avantages :
- maintien de la réactivité de l ’Ag (fixation idéale) - état proche du vivant
- maintien en place des constituants solubles
- préservation d’organites sensibles à la pression osmotique
Inconvénients :
- peu pratique (Azote (N2) liquide) - moins bonne morphologie
- 2/ Fixation chimique :
Les agents précipitants : Alcool éthylique, acétone Modification structure III aire des protéines : effet dénaturant
Avantage :
-Préserve l’antigénicité
Inconvénients :
- Altérations morphologiques - Déshydratation simultanée
Accès des Ac à l'Ag : la fixation
Les agents pontants : Formol, liquides de Bouin
Immobilisation par des liens intra et intermoléculaires
Avantages :
- Structures mieux préservées: bonne morphologie
- Meilleure immobilisation des protéines Inconvénients :
- Dénaturation + sévère des Ag
- Masquage des Ag
Accès des Ac à l'Ag :
Démasquage antigénique
1- Enzymatique
-Trypsine 0,1% TA - Pronase 0,1% 37°C
- Pepsine 0,4% 37°C 2-A la chaleur
- tampon citrate four à micro-ondes - tampon EDTA
- bain-marie ++
- étuve
Accès des Ac à l'Ag :
Perméabilisation des membranes
Cellules entières
Détergents non ioniques : - Triton 0,1%
- Saponine 0,1-0,01%
Les anticorps
Anticorps polyclonaux :
Avantages :
- plusieurs Ac contre un seul Ag - plus « sensible »
- fixation moins critique - mise en oeuvre rapide
Inconvénients :
- spécificité moindre : reconnaît différents déterminants d ’un même Ag
- plus grande sensibilité à la qualité de la fixation
Révélateur
Fluorescence :
principe absorption – émission
Fluorescence :
Avantages :
- protocoles rapides - grande sensibilité
- colocalisations possibles - confocal
Inconvénients :
- montage aqueux : disparaît au cours du temps - sensibilité à la lumière : stockage à 4°C
- extinction du signal sous UV
- microscope spécialement équipé, chambre noire
- marche mal en paraffine
Images des cellules du cancer
du colon SW480
No plasma exposure No Accutase
1000 x
1000 x
a
c
b
No plasma exposure Accutase treated
1000 x
1000 x
Plasma exposure
d
No Accutase Plasma exposure
Accutase treated
