TP16 Détermination de l'activité Invertase 1. Réactifs
β-fructosidase à 0,3 mg/mL dans Tp4,7
Tp4,7 tampon acétate pH 4,7 à 50 mmol/L Saccharose 1,2 mol/L
Sucre inverti à 5 mmol/L (glucose à 5 mmol/L + fructose à 5 mmol/L) DNS réactif alcalin au 3-5 DNS
2. Protocole
2.1. Étalonnage du sucre inverti par la méthode au 3-5 DNS
remarque : réaction colorimétrique identique pour l'étalonnage et les essais « enzymes »
On appelle sucre inverti le produit de la réaction catalysée par l'invertase, mélange équimolaire de glucose et de fructose.
Dans 2 tubes à essai, verser : 0,5 mL de "sucre inverti" à 5 mmol/L 0,5 mL de saccharose à 1,2 mol/L 1 mL de Tp4,7
1 mL de DNS
Boucher les tubes avec du papier d'aluminium et les porter à 100°C pendant 5 minutes exactement;
refroidir dans un bain d'eau froide, (remarque : la conduite du refroidissement est aussi importante que la conduite du chauffage dans la reproductibilité de la coloration). Après refroidissement, ajouter 7,0 mL d'eau déminéralisée.
Lire l'absorbance à 530 nm contre un blanc réactif. D'après cet étalonnage au DNS, trouver pour les calculs ultérieurs d'activité enzymatique, la relation : µmol de sucre inverti / tube;= f(Absorbance)
2.2. Détermination de l'activité Invertase Réaction enzymatique (2 essais) :
Diluer au 1/25 la solution de β-fructosidase puis déterminer l'activité volumique de l'enzyme selon le protocole suivant :
0,5 mL de saccharose 1,2 mol/L (préchauffés 10 minutes à 40°C)
+ 1,45 mL de Tp4,7 (préchauffés 10 minutes à 40°C)
+ 0,05 mL de β-fructosidase diluée au 1/25 dans Tp4,7 5 minutes à 40°C
+ 1 mL de 3-5 DNS (réactif d'arrêt et de coloration) Réaction colorimétrique :
5 minutes à 100 °C (inactivation thermique + coloration) Après refroidissement, ajouter 7,0 mL d'eau déminéralisée.
lecture à 530 nm contre le blanc-réactifs
Déterminer l'activité volumique de la β-fructosidase libre en U/mL d'enzyme diluée et d'enzyme non diluée.
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DOSAGE DE L'ETHANOL DU VIN 1. Organigramme
Distillation et oxydation
Distillation de l'éthanol
Préparation du dichomate de K
Oxydation chromique de l'éthanol et dosage par le sel de Mohr préalablement étalonné
Distillation et aréomètrie
Distillation de l'éthanol
Mesure par l'alcoomètre
2. Méthode par distillation et oxydation sulfo-chromique
2.2. Dosage de l'éthanol
2.2.1. Préparation de la solution de dichromate de potassium
Peser exactement une masse voisine de 3,3790g de dichromate de potassium (MM = 294,18 g/mol) pur et anhydre. Transvaser quantitativement et dissoudre dans l'eau distillée. Ajuster à 100 mL.
2.2.2. Oxydation chromique de l'éthanol
Dans un erlen bouché à l'émeri de 500 mL, introduire : – 10 mL de solution de dichromate de potassium
– 5 mL d'acide sulfurique concentré (Attention ! éprouvette, porter des lunettes de sécurité et des gants). Verser l'acide très lentement. Agiter. Refroidir au fur et à mesure
– 5 mL de distillât alcoolique.
Boucher. Agiter doucement. Attendre 15 à 20 min.
2.2.3. Dosage de l'excès de solution chromique Ajouter ensuite :
– 150 mL environ d'eau distillée
– 15 mL d'acide phosphorique pur (Attention ! éprouvette +.. porter des lunettes de sécurité et des gants)
– 10 gouttes de diphénylaminosulfonate de (baryum) Doser par la solution de sel de Mohr jusqu'à la coloration vert franc.
2.2.4. Dosage de la solution de sel de Mohr Dans un erlen bouché à l'émeri, introduire:
– 10 mL de solution de dichromate de potassium – environ 5 mL d'acide sulfurique concentré – environ 150 mL d'eau distillée
– environ 15 mL d'acide phosphorique pur – environ 10 gouttes d'indicateur
Verser la solution de sel de Mohr jusqu'à coloration vert franc.
3. Méthode par distillation et aréomètrie
3.1. Distillation
Mesurer a l'aide d'une fiole jaugée, 200 mL de vin après avoir noté sa température. Verser ce vin dans le ballon de l'appareil à distiller.
Rincer 3 à 4 fois la fiole avec de l'eau distillée. Ajouter quelques billes de verre et 60 mL de lait de chaux à 1 mol/L , nécessaire pour neutraliser l'acidité de 200 mL de vin.
Adapter la fiole jaugée qui a servi à la prise d'essai sous le réfrigérant.
Distiller au moins 150 mL. Arrêter la distillation. Rincer l'appareil.
Amener la température du distillât a celle du vin initial (à moins de 5°C près).
Compléter au trait de jauge (rincer le thermomètre) avec de l'eau distillée. Agiter.
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3.1. Mesure du degré alcoolique
Introduire le distillât dans l'éprouvette cylindrique, placée sur une table exactement horizontale.
Nettoyer la surface du liquide en y faisant tremper des bandelettes de papier filtre qui fixent les impuretés superficielles.
Introduire doucement, en évitant de tremper toute la tige émergente, l'alcoomètre propre et le thermomètre. Après 1 minute lire la température après avoir agité le liquide, (t°C).
Retirer le thermomètre et lire le degré alcoolique apparent (sous le ménisque). La lecture se fait de préférence a la loupe L'aréomètre ne doit pas toucher les parois de l'éprouvette. Effectuer 3 mesures en tapotant chaque fois l'éprouvette pour éliminer les frottements. On détermine ainsi le degré apparent à t°C.
3.3. Correction de température
Corriger, à l'aide des tables jointes, la valeur du degré apparent à t°C pour obtenir le degré réel à 20°C.
4. Résultats
Calculer les concentrations molaires des solutions de dichromate et de sel de Mohr.
Calculer les concentrations molaires et massiques de l'éthanol dans le vin.
Calculer le titre alcoométrique du vin par les 2 méthodes (masse volumique = 0,79 g/mL).
Comparer avec les résultats sur l'étiquette.
